Блокировка miR-301 подавляет ангиогенез и рост опухоли при плоскоклеточном раке пищевода через активацию PTEN

Аннотация

Цель

Плоскоклеточный рак пищевода (ПКРП) характеризуется ранней метастазацией и поздней диагностикой. МикРНК-301 (miR-301) известна своим участием в различных раках. Однако влияние miR-301 на ПКРП оставалось неизученным. Таким образом, мы стремились исследовать роль miR-301 в прогрессировании ПКРП.

Методы

Экспрессия miR-301 и фосфатазы и тензина гомолога (PTEN) в тканях ПКРП и клетках оценивали. Затем отобранные клетки обрабатывали олигонуклеотидами и плазмидами с измененной экспрессией miR-301 или PTEN, после чего оценивали колониобразующую способность, жизнеспособность, миграцию, инвазию, распределение по фазам цикла и апоптоз клеток ПКРП. Кроме того, оценивали рост опухоли и плотность микровен (MVD), а также подтверждали таргетные отношения между miR-301 и PTEN.

Результаты

MiR-301 была урегулирована, а PTEN — даунрегулирована в тканях ПКРП и клетках. Для функциональных анализов выбрали клетки KYSE30 и Eca109. В клетках KYSE30 ингибирование miR-301 или переэкспрессия PTEN подавляли злокачественное поведение клеток, а сенсинг PTEN устранял влияние ингибирования miR-301 на прогрессию ПКРП. В клетках Eca109 переэкспрессия miR-301 или ингибирование PTEN стимулировали злокачественное поведение, а переэкспрессия PTEN обращала эффекты повышения miR-301 на прогрессию ПКРП. In vivo эксперимент показал, что ингибирование miR-301 или переэкспрессия PTEN подавляли рост опухоли ПКРП и MVD, а повышение miR-301 или снижение PTEN имели противоположные эффекты. Более того, PTEN таргетировалась miR-301.

Заключение

Вместе результаты нашего исследования раскрыли, что miR-301 влияет на рост клеток, метастазирование и ангиогенез через регуляцию экспрессии PTEN в ПКРП.

Введение

Рак пищевода (РП), 8-я по частоте онкология во всем мире, — критическая злокачественность с высокой смертностью и плохой прогнозом. На около 90% всех случаев РП приходится плоскоклеточный рак пищевода (ПКРП) — основная форма РП в Китае. Множество причин, включая низкий социально-экономический статус, курение, потребление алкоголя, плохое питание, пищу, богатую нитрозаминами или микотоксинами, приводят к возникновению ПКРП. Несмотря на улучшение клинических исходов и лечения, прогноз у пациентов с ПКРП остается плохим, 5-летняя выживаемость составляет 15–25%. Поэтому критически важно выявить онкогены или supprimоры, которые могут служить биомаркерами в развитии ПКРП для обеспечения более эффективных терапевтических методов.

МикРНК (miRNAs) — небольшие некодирующие РНК, играющие важную роль в модуляции экспрессии генов и признанные способными влиять на прогрессию опухолей через регуляцию стабильности мРНК и способности мРНК. Ряд микРНК, таких как miR-4324, miR-889-3p и miR-9, были связаны с процессом ПКРП. MiR-301 — член микРНК, формируемый транскрипционной единицей fam33a, расположенной на 17q22-23 в геноме человека. Переэкспрессия miR-301 ранее выявлялась, отражая ее вовлеченность в человеческие заболевания. Однако функциональные механизмы miR-301 в ПКРП не были раскрыты. Более того, фосфатаза и тензин гомолог (PTEN) подтверждено часто нарушается в опухолях и таргетируется герминальными мутациями у пациентов с раком, играя ингибиторную роль. Было подтверждено, что дисрегуляция PTEN коррелирует с развитием ПКРП. Интересно, недавнее исследование показало, что miR-301 таргетирует PTEN при неклеточном раке легкого. Однако таргетные отношения между miR-301 и PTEN в развитии ПКРП остаются нераскрытыми. Наше исследование фокусировалось на влиянии miR-301 и PTEN на прогрессию ПКРП, которые остаются в значительной степени неизвестными и являются новизной. Мы предположили, что miR-301 может влиять на ангиогенез и рост клеток в ПКРП путем модуляции экспрессии PTEN.

Материалы и методы

Этическое заявление

Письменные информированные согласия получены от всех пациентов до исследования. Протоколы исследования одобрены Этического комитетом Второй больницы Цзилинского университета и основаны на этических принципах медицинских исследований с участием людей по Хельсинкской декларации. Эксперименты на животных строго соответствовали Руководству по управлению и использованию лабораторных животных, изданному Национальными институтами здравоохранения. Протокол экспериментов на животных одобрен Комитетом по уходу и использованию лабораторных животных Второй больницы Цзилинского университета.

Объекты исследования

Собрано 110 образцов тканей ПКРП и смежных нормальных тканей (>5 см от опухоли) у пациентов с ПКРП (78 мужчин, 32 женщины), перенесших эзофагэктомию в грудной хирургии Второй больницы Цзилинского университета с января 2015 по декабрь 2017 г. Среди 110 пациентов 84 случая >60 лет, 26 ≤60 лет; размер опухоли: 65 случаев ≥5 см, 45 <5 см; 71 случай без метастазов в лимфатических узлах (ЛУ) и 39 с метастазами; ТНМ стадия: 60 случаев I+II стадии, 50 — III стадии; локализация опухоли: 13 верхний ПКРП, 97 средне-нижний. Все пациенты диагностированы с ПКРП, не получали лучевую или химиотерапию до операции. Опухоли полностью удалены, отрицательная хирургическая маржа подтверждена патологией. Согласно стадированию ПКРП, предложенному Международным союзом борьбы с раком (МСБР) в 2009 г., послеоперационная патологическая стадия определена как pT1-4N1-2(I-IIIb). После операции не было значимых осложнений, периоперационные смерти исключены.

Обратная транскрипция количественной ПЦР (RT-qPCR)

Общие РНК в тканях и клетках извлекали наборами Trizol (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, USA). Концентрацию и качество РНК измеряли. РНК-праймеры (Таблица 1) проектировали и синтезировали в TaKaRa Biotechnology Co., Ltd. (Ляонин, Китай). РНК обратно транскрибировали в кДНК по инструкциям набора Takara PrimeScript™ RT reagent Kit with g DNA Eraser (Takara). qPCR проводили на Light Cycler 480II (Roche) с Power PCR SYBR green PCR master mix (Takara). U6 использовали как контроль загрузки для miR-301, β-актин — как внутреннюю референцию для PTEN. Данные анализировали методом 2^−ΔΔCt.

Вестерн-блот анализ

Буфер RIPA для лизиса (Beyotime Institute of Biotechnology, Шанхай, Китай) использовали для экстракции общего белка в клетках и тканях, белок квантифицировали набором BCA Protein Assay kit (Beyotime). Концентрацию белка каждого образца измеряли, проводили 10% SDS-PAGE. Образцы переносили на нитроцеллюлозные мембраны, блокировали 5% обезжиренным сухим молоком при 4 °C на ночь. Затем инкубировали с первичными антителами PTEN и β-актин (оба 1:500, Santa Cruz Biotechnology Inc, CA, USA) на ночь, добавляли вторичные антитела и инкубировали 1 ч. После погружения в усиленный хемилюминесцентный реагент (Pierce Chemical Inc., Даллас, TX, USA) на 1 мин мембраны экспонировали в темноте и детектировали на LAS4000 mini chemiluminescence imager. Серые значения оценивали системой обработки изображений с β-актином как контролем, получая итоговую относительную экспрессию белка. Белковые полосы анализировали программой ImageJ2x.

Двойной люциферазный репортерный анализ

3′-непереводимая область (3′-UTR) PTEN предсказана как взаимодействующая с miR-301, или мутированная последовательность в предсказанных таргетных сайтах синтезирована и вставлена в сайты XbaI и FseI вектора pGL3 control luciferase reporter vector (Promega, WI, USA). Затем получили векторы pGL3-PTEN-wt и pGL3-PTEN-mut. Правильно идентифицированные wt и mut люциферазные репортерные плазмиды с miR-301 mimic и mimic NC ко-трансфектировали в клетки KYSE30 и Eca109 на 48 ч. Затем клетки лизировали, люциферазная активность определялась наборами люциферазного детектора (Promega).

Клеточная культура, группировка и трансфекция

Клеточные линии ПКРП (KYSE-150, KYSE-30, Eca109, KYSE-70) получены из Шанхайского института биохимии и клеточной биологии, Китайская академия наук (Шанхай, Китай), человеческие пищеводные эпителиальные клетки (HEECs) — из Mingzhou Biotechnology Co., Ltd. (Чжэцзян, Китай). Клетки культивировали в RPMI 1640 (Invitrogen) с 10% фетового бычьего сывороточного белка (FBS, Life Technologies, USA), 100 ед/мл пенициллина G натрия (Sigma) и 100 мкг/мл сульфата стрептомицина (Sigma). Экспрессию miR-301 и мРНК PTEN в каждой клеточной линии измеряли RT-qPCR, клеточную линию с наивысшей и наименьшей относительной экспрессией выбирали для последующих клеточных экспериментов.

Клетки KYSE-30 разделяли на 7 групп и соответственно обрабатывали: ингибитор miR-301, ингибитор негативного контроля (NC), pcDNA-PTEN (переэкспрессия (oe)-PTEN), pcDNA-NC (oe-NC), ингибитор miR-301 + малый интерференционный РНК (si)-PTEN или ингибитор miR-301 + si-NC. Клетки Eca109 также разделяли на 7 групп и обрабатывали: mimic miR-301, mimic NC, si-PTEN, si-NC, mimic miR-301 + oe-PTEN, mimic miR-301 + oe-NC. Ингибитор NC, ингибитор miR-301, mimic miR-301, mimic NC, si-NC и si-PTEN приобрели в GenePharma Ltd. (Шанхай, Китай); pcDNA-PTEN NC и pcDNA-PTEN — в Shanghai Sangon Bio-technology Corporation (Шанхай, Китай). Клетки транзиентно трансфектировали в клетки ПКРП липофектамином 2000 (Invitrogen) при конфлюэнтности 60%.

Тест CCK-8

Клетки посеяли в 96-лунку (1×10³ клеток/лунку) и инкубировали разные периоды. После инкубации 24, 48, 72, 96 ч в каждую лунку добавляли 10 мкл раствора CCK-8 (5 мг/мл), инкубировали при 37 °C без света 2 ч. Оптическую плотность (OD) при 450 нм анализировали микроплатным ридером (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

Колониобразующий анализ

Клетки посеяли 500 клеток/лунку в 6-лунковые пластины после трансфекции и культивировали 14 д. Колонии фиксировали метанолом, окрашивали 0,5% кристаллическим фиолетом и считали под инвертированным микроскопом.

Transwell-анализ

Клетки (5×10³) в RPMI 1640 посеяли в апикальные камеры Transwell с непокрытыми или матригель-покрытыми мембранами (Corning, NY, USA). Через 24 ч клетки на апикальных камерах удаляли, а клетки на нижней стороне фиксировали и окрашивали 0,1% кристаллическим фиолетом. Микроскопом (Olympus Corporation, Токио, Япония) считали на 3 случайных полях для расчета количества клеток.

Потоковая цитометрия

Цикл клетки и апоптоз оценивали потоковой цитометрией. Annexin V-FITC (10 мкл) и йодид пропидия (PI; 5 мкл, Sigma) инкубировали с клетками (5×10⁵ клеток/лунку) в темноте при 4 °C 30 мин. Процент апоптических клеток рассчитывали потоковым цитометром (BD Biosciences, CA, USA) с ПО FlowJo v10 (FlowJo LLC, OR, USA).

Для оценки цикла клетки клетки (5×10⁵ клеток/лунку) фиксировали 75% этанолом на ночь при 4 °C, окрашивали 5 мкл PI/рибонуклеаза А (Sigma) при 4 °C 30 мин в темноте. Данные анализировали потоковым цитометром (BD Biosciences). Флуоресцентные сигналы (14 000) каждого образца собирали и рассчитывали с ПО ModFit LT v3.2 (Verity Software House, Inc., ME, USA).

Подкожная тumeursгенез в нюд мышах

42 самки BALB/c-nu нюд мышей (4 недели, 16–24 г) получены из Экспериментального животноводческого центра Цзилинского университета (Чанчунь, Китай). Нюд мышей разделили на 14 групп (n=3). Нюд мышей 7 групп соответственно инъецировали клетками KYSE-30 согласно группировке клеток, остальные 7 групп — клетками Eca109. Концентрация трансфектированных клеток KYSE-30 и Eca109 скорректировали до 5×10⁶ клеток/100 мкл. Нюд мышей фиксировали и подкожно инъецировали соответствующими клетками ПКРП в стерильных условиях. Крупнейшую длину (L) и ширину (W) опухолей измеряли еженедельно, объем опухоли (V) = 1/2 × L × W². Нюд мышей эвтаназировали на 5-й неделе инъекции, опухоли ресектировали, взвешивали и фотографировали. Частота образования опухолей = количество мышей с подкожной опухолью / общее количество инъецированных мышей в группе × 100%. Время инъекции — абсцисса, размер опухоли — ордината; таким образом строили кривую роста опухоли.

Иммуногистохимическая окраска

Тканевые образцы опухолей нюд мышей фиксировали 10% формальдегидом, парафинизировали и делали 4 мкм срезы. Срезы сушили при 60 °C 2 ч, девоскили ксилолом, дегидратировали градиентным этанолом, инкубировали с 50 мкл 3% H₂O₂ 10 мин. Затем замачивали в 0,01 М цитратном буфере, кипятили при 95 °C 20 мин, блокировали нормальным козьим сывороточным раствором при 37 °C 10 мин, добавляли CD₃₄ (1:100, Santa Cruz) при 4 °C на ночь. Затем добавляли HRP-маркированный козьи анти-кролик/мышь IgG полимер (ZSGB-Bio, Пекин, Китай), контр-окрашивали гемоксилином, дегидратировали, пермебилизировали и запечатывали нейтральным бальзамом. PBS использовали вместо первичных антител как NC. Измерение MVD: срезы рассматривали под низкоувеличивающим микроскопом. Эндотелиальная клетка или кластер, окрашенные в буро-желтый и четко отличимые от окружающих опухолевых клеток и соединительной ткани, считались микровеной. Ветвистая структура также считалась сосудом, если была дисконнектирована, тогда как сосуды с люменом >8 эритроцитов, мышечным слоем или более толстым люменом исключали. Числа микровен на 3 высоких полях зрения записывали, среднее число было MVD каждого случая.

Статистический анализ

Все статистические анализы проводили с SPSS v21.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA) и Graphpad Prism Software 6.0. Данные выражали как среднее ± стандартное отклонение. Различия между двумя независимыми группами проверяли t-тестом Стьюдента. Однофакторный ANOVA для сравнения трех и более групп. P < 0,05 указывало на статистически значимую разницу.

Результаты

MiR-301 высоко экспрессируется, в то время как PTEN слабо экспрессируется в тканях и клетках ПКРП

Экспрессию miR-301 и PTEN в тканях ПКРП и смежных нормальных тканях оценивали RT-qPCR и вестерн-блотом для раскрытия их роли в ПКРП. Обнаружили (Рис. 1a–c), что miR-301 урегулирована, а PTEN даунрегулирована в тканях ПКРП. Пациентов разделяли на группы низкой и высокой экспрессии по медианному значению экспрессии miR-301 или PTEN для анализа корреляции между экспрессией miR-301/PTEN и клинико-патологическими характеристиками пациентов с ПКРП. Результаты показали, что экспрессия miR-301/PTEN не связана с возрастом, полом, размером опухоли, локализацией и дифференцировкой, но коррелировала с ТНМ стадией и метастазами в ЛУ (Таблица 2).

Рис. 1. MiR-301 высоко экспрессируется, PTEN слабо экспрессируется в тканях и клетках ПКРП. а экспрессия miR-301 и мРНК PTEN в ткани ПКРП по RT-qPCR; б белковая экспрессия PTEN в ткани ПКРП по вестерн-блоту; в белковые полосы PTEN в вестерн-блоте; г экспрессия miR-301 и мРНК PTEN в клеточных линиях ПКРП по RT-qPCR; д белковая экспрессия PTEN в клеточных линиях ПКРП по вестерн-блоту; е белковые полосы PTEN в вестерн-блоте. *P < 0,05 vs HEEC. Данные: среднее ± SD, t-тест для сравнения двух групп.

Затем экспрессию miR-301 и PTEN в 4 клеточных линиях ПКРП и HEECs определяли RT-qPCR и вестерн-блотом. Обнаружили (Рис. 1d–f), что miR-301 урегулирована, PTEN даунрегулирована в клеточных линиях ПКРП, среди которых KYSE-30 имела наивысшую экспрессию miR-301 и наименьшую PTEN, а Eca109 — противоположную тенденцию. Таким образом, линию KYSE-30 обрабатывали даунрегуляцией miR-301/переэкспрессией PTEN, а Eca109 — переэкспрессией miR-301/сенсингом PTEN в клеточных экспериментах.

PTEN таргетируется miR-301

Биоинформатический софт (https://www.microrna.org/) предсказал PTEN как тарген miR-301 (Рис. 2a). Двойной люциферазный репортерный анализ подтвердил, что люциферазная активность значимо снизилась в клетках ПКРП, ко-трансфектированных с вектором PTEN-wt и mimic miR-301, по сравнению с ко-трансфекцией PTEN-mut и mimic miR-301, что подразумевает, что miR-301 может специфически связываться с PTEN (Рис. 2b, c).

Рис. 2. PTEN — тарген miR-301. а сайты связи miR-301 и PTEN предсказаны онлайн; б таргетные отношения в клетках KYSE-30 двойным люциферазным анализом; в таргетные отношения в клетках Eca109; г экспрессия miR-301 и мРНК PTEN в KYSE-30 после даунрегуляции miR-310 или переэкспрессии PTEN по RT-qPCR; д белковая экспрессия PTEN в KYSE-30 по вестерн-блоту после даунрегуляции miR-310 или переэкспрессии PTEN; е белковые полосы PTEN в KYSE-30; ж экспрессия miR-301 и мРНК PTEN в Eca109 после апрегуляции miR-310 или даунрегуляции PTEN по RT-qPCR; з белковая экспрессия PTEN в Eca109 по вестерн-блоту; и белковые полосы PTEN в Eca109. *P < 0,05 vs ингибитор-NC; &P < 0,05 vs oe-NC; #P < 0,05 vs miR-301 ингибитор + si-NC; aP < 0,05 vs mimic-NC; bP < 0,05 vs si-NC; cP < 0,05 vs miR-301 mimic + oe-NC; N=3. Данные: среднее ± SD, t-тест для двух групп, ANOVA для множественных.

RT-qPCR и вестерн-блот использовали для оценки экспрессии miR-301 и PTEN в трансфектированных клетках. В клетках KYSE-30 (Рис. 2d–f) клетки с ингибитором miR-301 даунрегулировали miR-301, апрегулировали PTEN; клетки с pcDNA-PTEN (oe-PTEN) повысили PTEN, si-PTEN обратило эффект ингибитора miR-301 на экспрессию PTEN. В клетках Eca109 (Рис. 2g–i) клетки с mimic miR-301 апрегулировали miR-301, даунрегулировали PTEN; клетки с si-PTEN снизили PTEN, pcDNA-PTEN (oe-PTEN) обратило ингибиторную роль mimic miR-301 в экспрессии PTEN. Эти данные подтвердили, что miR-301 таргетирует PTEN.

Ингибированная miR-301 или переэкспрессированная PTEN ограничивают жизнеспособность клеток ПКРП; апрегулированная miR-301 или сниженная PTEN способствуют жизнеспособности клеток ПКРП

Жизнеспособность клеток ПКРП оценивали колониобразующим и CCK-8 тестами. Результаты показали, что в линии KYSE-30 (Рис. 3a–c) трансфекция ингибитором miR-301 или oe-PTEN подавляла колониобразующую способность и жизнеспособность; трансфекция сенсингом PTEN устраняла влияние ингибитора miR-301 на жизнеспособность клеток ПКРП; в линии Eca109 (Рис. 3d–f) трансфекция mimic miR-301 или si-PTEN стимулировала колониобразующую способность и жизнеспособность; переэкспрессия PTEN обращала промоутивную роль апрегуляции miR-301 в колониобразующей способности и жизнеспособности Eca109. Эти результаты подразумевают, что нокаут miR-301 или переэкспрессия PTEN подавляли жизнеспособность клеток ПКРП, которую стимулировали апрегуляция miR-301 или ингибирование PTEN.

Рис. 3. Ингибированная miR-301 или переэкспрессированная PTEN ограничивают жизнеспособность клеток ПКРП; апрегулированная miR-301 или сниженная PTEN способствуют жизнеспособности. а число колоний в KYSE-30 после трансфекции колониобразующим анализом после даунрегуляции miR-310 или переэкспрессии PTEN; б колониобразующая способность KYSE-30; в жизнеспособность KYSE-30 по CCK-8; г число колоний в Eca109 после апрегуляции miR-310 или даунрегуляции PTEN; д колониобразующая способность Eca109; е жизнеспособность Eca109 по CCK-8. *P < 0,05 vs ингибитор-NC; &P < 0,05 vs oe-NC; #P < 0,05 vs miR-301 ингибитор + si-NC; aP < 0,05 vs mimic-NC; bP < 0,05 vs si-NC; cP < 0,05 vs miR-301 mimic + oe-NC, N=3. Данные: среднее ± SD, ANOVA для множественных групп.

Ингибированная miR-301 или переэкспрессированная PTEN подавляют миграцию и инвазию клеток ПКРП; апрегулированная miR-301 или сниженная PTEN индуцируют миграцию и инвазию клеток ПКРП

Миграционную и инвазивную способность клеток ПКРП оценивали Transwell-тестом. Результаты подсказали, что в линии KYSE-30 (Рис. 4a, b) миграция и инвазия были скованы ингибированием miR-301 или переэкспрессией PTEN; супрессивная роль ингибитора miR-301 в миграции и инвазии обратилась si-PTEN. В линии Eca109 (Рис. 4c, d) миграция и инвазия стимулировались после трансфекции mimic miR-301 или si-PTEN; переэкспрессия PTEN обращала влияние mimic miR-301 на миграцию и инвазию. Вышеуказанные находки подразумевали, что миграция и инвазия клеток ПКРП ингибировались подавлением miR-301 или элевацией PTEN, тогда как фасилитировались апрегуляцией miR-301 или даунрегуляцией PTEN.

Рис. 4. Ингибированная miR-301 или переэкспрессированная PTEN подавляют миграцию и инвазию клеток ПКРП; апрегулированная miR-301 или сниженная PTEN способствуют миграции и инвазии. а миграция и инвазия трансфектированных KYSE-30 по Transwell после даунрегуляции miR-310 или переэкспрессии PTEN; б статистика мигрировавших и инвазивных клеток KYSE-30; в миграция и инвазия Eca109 по Transwell после апрегуляции miR-310 или даунрегуляции PTEN; г статистика мигрировавших и инвазивных Eca109. *P < 0,05 vs ингибитор-NC; &P < 0,05 vs oe-NC; #P < 0,05 vs miR-301 ингибитор + si-NC; aP < 0,05 vs mimic-NC; bP < 0,05 vs si-NC; cP < 0,05 vs miR-301 mimic + oe-NC, N=3. Данные: среднее ± SD, ANOVA для множественных групп.

Ингибированная miR-301 или переэкспрессированная PTEN индуцируют арест цикла и апоптоз клеток ПКРП; апрегулированная miR-301 или сниженная PTEN подавляют арест цикла и апоптоз клеток ПКРП

Потоковая цитометрия использовалась для детекции перехода цикла и апоптоза после трансфекции. Результаты указали, что в линии KYSE-30 (Рис. 5a–d) трансфекция ингибитором miR-301 или oe-PTEN повышала апоптический уровень и увеличивала клетки в G0/G1 фазе, снижая S и G2/M фазы; изменение апоптоза и ареста цикла, индуцированное ингибитором miR-301, обратилось si-PTEN.

Рис. 5. Ингибированная miR-301 или переэкспрессированная PTEN индуцируют арест цикла и апоптоз клеток ПКРП; апрегулированная miR-301 или сниженная PTEN подавляют арест цикла и апоптоз. а распределение цикла KYSE-30 по группам потоковой цитометрией после даунрегуляции miR-310 или переэкспрессии PTEN; б статистика процента в G0/G1, S, G2/M фазах KYSE-30; в апоптоз KYSE-30 потоковой цитометрией; г апоптический уровень трансфектированных KYSE-30; д распределение цикла Eca109 после апрегуляции miR-310 или даунрегуляции PTEN; е статистика процента в фазах Eca109; ж апоптоз Eca109; з апоптический уровень трансфектированных Eca109. *P < 0,05 vs ингибитор-NC; &P < 0,05 vs oe-NC; #P < 0,05 vs miR-301 ингибитор + si-NC; aP < 0,05 vs mimic-NC; bP < 0,05 vs si-NC; cP < 0,05 vs miR-301 mimic + oe-NC, N=3. Данные: среднее ± SD, ANOVA для множественных групп.

Согласно результатам потоковой цитометрии, в линии Eca109 (Рис. 5e–h) трансфекция mimic miR-301 или si-PTEN ингибировала апоптический уровень, снижала клетки в G0/G1 и увеличивала S и G2/M фазы; переэкспрессия PTEN обращала эффект mimic miR-301 на апоптический уровень и арест цикла Eca109. Мы заключили, что даунрегуляция miR-301 или апрегуляция PTEN способствовали переходу цикла и апоптозу в клетках ПКРП, тогда как ингибированная miR-301 или сенсинг PTEN оказывали противоположные эффекты.

Ингибированная miR-301 или переэкспрессированная PTEN сковывают рост опухоли и ангиогенез in vivo при ПКРП; апрегулированная miR-301 или сниженная PTEN усиливают рост опухоли и ангиогенез in vivo при ПКРП

Рост и изменения опухолей ПКРП в нюд мышах наблюдали в каждой группе. Оценка роста опухоли подразумевала, что в линии KYSE-30 (Рис. 6a–e) нюд мыши, инъецированные ингибитором miR-301 или oe-PTEN, снизили объем и вес опухоли; репрессивная роль ингибитора miR-301 в росте опухоли устранялась si-PTEN. В линии Eca109 (Рис. 6f–j) объем и вес опухоли увеличивались у нюд мышей, инъецированных mimic miR-301 или si-PTEN; переэкспрессия PTEN обращала эффект mimic miR-301 на рост опухоли. Тем временем экспрессию CD34 в ксенохранилищах нюд мышей оценивали иммуногистохимической окраской. Результаты показали (Рис. 7a–d), что в ксенохранилищах KYSE-30 MVD сковывалась после даунрегуляции miR-301 или апрегуляции PTEN; сенсинг PTEN обращал влияние ингибирования miR-301 на MVD. В ксенохранилищах Eca109 MVD увеличивалась после апрегуляции miR-301 или даунрегуляции PTEN; усиление MVD, индуцированное апрегулированной miR-301, могло быть устранено переэкспрессией PTEN. Эти данные указывали, что ингибирование miR-301 или переэкспрессия PTEN подавляли рост опухоли и ангиогенез при ПКРП, тогда как апрегуляция miR-301 или сенсинг PTEN имели обратные эффекты.

Рис. 6. Ингибированная miR-301 или переэкспрессированная PTEN сковывают рост опухоли при ПКРП; апрегулированная miR-301 или сниженная PTEN усиливают рост опухоли. а репрезентативные фигуры роста опухоли при подкожной тumeursгенезе в нюд мышах после трансфекции KYSE-30; б–д изменения объема опухоли по группам; е изменения веса опухоли; ж репрезентативные фигуры роста опухоли после трансфекции Eca109; з–и изменения объема опухоли; к изменения веса опухоли. *P < 0,05 vs ингибитор-NC; &P < 0,05 vs oe-NC; #P < 0,05 vs miR-301 ингибитор + si-NC; aP < 0,05 vs mimic-NC; bP < 0,05 vs si-NC; cP < 0,05 vs miR-301 mimic + oe-NC, n=3 мыши. Данные: среднее ± SD, ANOVA для множественных групп.

Рис. 7. Ингибированная miR-301 или переэкспрессированная PTEN сковывают ангиогенез при ПКРП; апрегулированная miR-301 или сниженная PTEN усиливают ангиогенез. а репрезентативные изображения тканей опухолей иммуногистохимической окраской в нюд мышах после трансфекции KYSE-30; б сравнение MVD KYSE-30 в тканях опухолей по группам; в репрезентативные изображения тканей опухолей после трансфекции Eca109; г сравнение MVD Eca109 в тканях опухолей по группам. *P < 0,05 vs ингибитор-NC; &P < 0,05 vs oe-NC; #P < 0,05 vs miR-301 ингибитор + si-NC; aP < 0,05 vs mimic-NC; bP < 0,05 vs si-NC; cP < 0,05 vs miR-301 mimic + oe-NC, n=3 мыши. Данные: среднее ± SD, ANOVA для множественных групп.

Обсуждение

РП — вид инвазивной злокачественности желудочно-кишечного тракта. Как основной тип РП, ПКРП — злокачественная опухоль, возникающая в пищеводных эпителиальных клетках. miRNAs, известные как малые некодирующие РНК, демонстрировали функционирование в качестве значимых ролей в ведущих молекулах в затихании РНК. Наше исследование было спроектировано для изучения эффектов miR-301 и ее таргента PTEN на прогрессию ПКРП, и мы обнаружили, что ингибированная miR-301 могла подавить ангиогенез и рост клеток в ПКРП путем повышения PTEN.

Экспрессию miR-301 оценивали и обнаружили, что miR-301 высоко экспрессировалась в клетках ПКРП по сравнению с HEEC, и более высокая экспрессия miR-301 также найдена в тканях ПКРП против смежных нормальных тканей. Аналогично, Ли и соавт. выявили высокую экспрессию miR-301 в тканях инфаркта миокарда. Кроме того, мы прояснили, что PTEN таргетируется miR-301, таргетные отношения указывались в существующей литературе. Мы также обнаружили, что PTEN, подтвержденно таргетируемая miR-301, была даунрегулирована в тканях и клетках ПКРП. Подобно этому, предыдущее исследование выявило низкую экспрессию PTEN в ПКРП по сравнению с неопухолевой пищеводной эпителиальной тканью. Более того, Ма и соавт. прояснили, что экспрессия PTEN деградировала в линии Eca109, которая также была выбрана для серии экспериментов в этом исследовании. Эти исследования предоставляют доказательства высокой экспрессии miR-301 и низкой экспрессии PTEN в ПКРП.

Другой важный исход в этом исследовании указал, что ингибированная miR-301 могла подавить колониобразующую способность и пролиферацию клеток ПКРП через повышение экспрессии PTEN, а апрегулированная miR-301 или сниженная PTEN имели противоположные эффекты. Аналогично, Хань и соавт. прояснили, что даунрегуляция miR-301, медированная лютеолином, способна сковывать пролиферацию клеток при раке простаты. Недавняя литература раскрыла, что переэкспрессия PTEN подавляет пролиферацию клеток рака поджелудочной железы, и аналогичный результат суммирован в исследовании на раке простаты. Кроме того, мы также выявили, что даунрегуляция miR-301 или элевация PTEN могла ингибировать миграцию и инвазию клеток ПКРП, а апрегулированная miR-301 или сниженная PTEN показывали противоположные тренды. В соответствии с этим, Ши и соавт. поддержали, что ингибированная miR-301 аттенюировала миграцию и инвазию клеток рака груди. Также сообщалось, что миграция и инвазия клеток ПКРП могли быть подавлены ингибированием miR-130b и элевацией PTEN. Эти публикации помогли верифицировать онкогенную роль miR-301 и опухолесупрессивный эффект PTEN в различных человеческих раках. Другой результат нашего исследования: ингибированная miR-301 переэкспрессировала PTEN для стимуляции апоптоза и индукции ареста цикла в G0/G1 фазе в клетках ПКРП, а апрегулированная miR-301 или сниженная PTEN имели обратные результаты. Аналогично, недавняя литература раскрыла, что активированная PTEN индуцирует арест цикла и апоптоз в ПКРП. Последовательно, Тян и соавт. обнаружили в своем исследовании, что элевация PTEN ингибировала ангиогенез путем снижения экспрессии сосудистого эндотелиального фактора роста в гепатоцеллюлярном карциноме. На основе вышеприведенных данных роли miR-301 и PTEN в апоптозе и ангиогенезе в различных заболеваниях были дополнительно подтверждены. Следовательно, мы заключили, что даунрегуляция miR-301 могла сковать рост опухоли в ПКРП через высокую экспрессию PTEN, и аналогичный вывод также раскрыт в раке груди и раке простаты. Напротив, апрегуляция miR-301 или снижение PTEN индуцировали рост опухоли в ПКРП. Можно заключить, что miR-301 и PTEN участвовали в in vivo росте раковых клеток.

Заключение

В данном исследовании мы показали, что репрессия miR-301 запрещает ангиогенез, пролиферацию, миграцию и инвазию, но способствует апоптозу в клетках ПКРП путем апрегуляции PTEN. Это исследование может способствовать пониманию потенциальных молекулярных механизмов ПКРП и предоставлять новые таргеты для лечения ПКРП.

Аббревиатуры

ПКРП:

Плоскоклеточный рак пищевода

PTEN:

Фосфатаза и тензин гомолог

MVD:

Плотность микровен

РП:

Рак пищевода

miRNAs:

МикРНК

ЛУ:

Метастазы в лимфатических узлах

МСБР:

Международный союз борьбы с раком

RT-qPCR:

Обратная транскрипция количественной ПЦР

3′UTR:

3′-непереводимая область

WT:

Дикий тип

MUT:

Мутантный тип

HRP:

Пероксидаза конюшинного редища

FBS:

Фетовый бычий сывороточный белок

OE:

Переэкспрессия

NC:

Негативный контроль

CCK-8:

Набор для подсчета клеток

DMEM:

Модифицированное среднее Дюльбекко

PI:

Йодид пропидия

FITC:

Флуоресцеин изотиоцианат

ANOVA:

Дисперсионный анализ