Модуляция актинового цитоскелета и фокальных адгезий в клетках U2OS с помощью нанопиллеров

Аннотация

Фон

Мы исследуем, как массивы полимерных нанопиллеров на стекле влияют на актиновый цитоскелет и организацию фокальных адгезий (ФА) в клетках U2OS остеосаркомы. Анализ раскрывает три различных клеточных режима — полный контакт с подложкой, периферическая адгезия и подвешивание на пиллерах — определяемых плотностью и геометрией пиллеров. Плотные массивы индуцируют периферические ФА и кольцеобразную актиновую кору, зеркаля ответ клеток на комплаентные подложки.

Результаты

Используя электронно-лучевую литографию, мы изготовили SU-8 нанопиллерные массивы с шагом 500–2000 нм и высотой 500–1000 нм. Высокоразрешающая Airyscan визуализация U2OS клеток, экспрессирующих LifeAct-GFP и TagRFP-винулин, квантифицировала >400 клеток и >7700 ФА на >400 изображениях. Плотные пиллеры (шаг 1000 нм, высота 1000 нм) заставляли клетки парить над массивом, с ФА, сконцентрированными на периферии; разреженные массивы (шаг 2000 нм, высота 1000 нм) позволяли полную базальную адгезию. Количественные метрики показали значительные различия в числе ФА, площади и периферической локализации через 24 ч, которые исчезли к 48 ч.

Заключение

Высокопроизводительная нанофабрикация, передовая микроскопия и строгий анализ изображений обеспечивают надежную платформу для дисекции клеточно-наноструктурных взаимодействий. Наши находки демонстрируют, что адаптация геометрии нанопиллеров может направлять актиновую архитектуру и распределение ФА, предлагая путь к инженерии культурных подложок, смещающих специфические клеточные функции.

Графическая аннотация

Фон

In vivo клетки испытывают сложную 3D внеклеточную матрицу (ECM), доставляющую как биохимические сигналы, так и механическую жесткость, регулирующие морфогенез, гомеостаз и дифференциацию. Состав ECM варьируется по тканям, влияя на поведение клеток.

Для лучшего мимикрирования физиологических условий исследователи все чаще используют 3D или полу-3D системы культивирования. По сравнению с плоскими поверхностями, клетки на 3D матрицах демонстрируют измененную жизнеспособность, пролиферацию, дифференциацию и морфологию, подчеркивая важность размерности в исследованиях клеточных культур.

В то время как настоящие 3D гидрогели (коллаген, Matrigel) воспроизводят объемную ECM, 2.5D поверхности — плоское стекло, декорированное наноструктурами — предоставляют точную, воспроизводимую топографию, оставаясь совместимыми с оптической микроскопией. Такие поверхности позволяют контролируемые исследования мембранной кривизны, интервалов лигандов и механической комплаентности.

Клеточно-ECM адгезия медируется фокальными адгезиями, мультибелковыми комплексами, связывающими интегрины с актиновым цитоскелетом. Винулин, ключевой компонент ФА, привязывает F-актин, модулирует пучкование филаментов, нуклеацию и сигнальные пути. Нарушение винулина меняет форму клетки, адгезивную силу и передачу сил.

Нанопиллерные массивы показывали влияние на морфологию клеток и распределение ФА. Плотные массивы могут поднимать клетки над подложкой, в то время как разреженные позволяют базальный контакт. Предыдущие работы на галлие-фосфидных и кремниевых наноколоннах демонстрируют плотностно-зависимое число и морфологию ФА. Однако систематических количественных исследований на полимерных наноструктурах и их влиянии на актин и ФА организации остается мало.

Результаты

SU-8 нанопиллерные массивы изготавливались с контролируемыми шагами (500–2000 нм) и высотами (500–1000 нм). Массивы классифицировали как плотные или разреженные на основе наблюдаемого клеточного адгезивного поведения. Live-клеточная визуализация захватила ≥100 клеток на условие на 24 ч и 48 ч, производя >400 высокоразрешающих изображений и 20 3D датасетов.

Клетки на разреженных массивах (шаг 2000 нм) демонстрировали плоскую морфологию с базальными ФА и F-актиновыми волокнами, уходящими к подложке. В противовес, плотные массивы (шаг 500–1000 нм, высота 1000 нм) заставляли клетки парить над пиллерами; F-актин формировал кольцо вокруг периферии клетки, а ФА ограничивались периферическими контактными сайтами. Z-стек визуализация подтвердила, что актиновые сети в плотных массивах располагались над основанием пиллеров, в то время как в разреженных массивах актин и ФА ко-локализовали на интерфейсе подложки.

Количественный анализ >7700 ФА выявил значительные различия на 24 ч: плотные массивы имели меньше, более мелкие ФА с более высокой периферической долей, тогда как разреженные массивы и плоское стекло имели более центральные ФА. К 48 ч число ФА, площадь и распределение сходились по условиям, предполагая транзиторную фазу ремоделирования.

Рисунок 3 суммирует метрики клеточной морфологии (площадь, круглость, соотношение сторон) по поверхностям. Значительное уменьшение площади наблюдалось на 24 ч для плотных массивов, но не на 48 ч. Круглость и соотношение сторон оставались сравнимыми после 48 ч.

Рисунок 4 представляет статистику ФА. На 24 ч плотные массивы имели меньше ФА и меньшую общую площадь ФА на клетку. Доля площади ФА (площадь ФА ÷ площадь клетки) также была ниже для плотных массивов. Эти различия рассеялись к 48 ч.

Анализ локализации ФА (Рис. 6) показывает, что ФА на плотных массивах позиционированы ближе к краю клетки, тогда как на плоском стекле и разреженных массивах они более центрально распределены. Нормализация к максимальному радиусу клетки подтверждает этот тренд, подчеркивая смещение ФА к периферии, индуцируемое плотностью пиллеров.

Обсуждение

Наше исследование демонстрирует, что геометрия нанопиллеров диктует актиновую архитектуру и ФА организацию в U2OS клетках. Плотные пиллеры поднимают клетки над подложкой, создавая комплаентную-подобную среду, где ФА кластеризуются периферически и актин образует кортикальное кольцо. Разреженные пиллеры сохраняют базальную адгезию и центральное ФА распределение.

Эти наблюдения согласуются с отчетами о более мягких подложках, индуцирующих периферические ФА и кольцевидный актин. Транзиторные различия на 24 ч предполагают, что клетки изначально адаптируются к топографии перед достижением стационарного состояния к 48 ч.

ФА медируют тракционные силы, формирующие стресс-волокна; напротив, актиновое напряжение влияет на ФА зрелость. Наши данные поддерживают двунаправленное связывание между цитоскелетом и адгезивными комплексами на наноструктурированных поверхностях, расширяя предыдущие находки на фибробластах и кремниевых наноколоннах.

Будущая работа должна исследовать, как эти морфологические изменения влияют на сигнальные пути и функциональные выходы, такие как миграция, пролиферация и дифференциация. Представленная здесь платформа предлагает масштабируемый путь к инженерии культурных подложок, смещающих специфические клеточные фенотипы.

Заключения

Комбинируя высокопроизводительную нанофабрикацию, передовое Airyscan изображение и количественный анализ изображений, мы идентифицировали три различных режима U2OS клеток на полимерных нанопиллерных массивах: полный контакт с подложкой, периферическая адгезия и подвешивание. Плотность и высота пиллеров управляют актиновой организацией и ФА локализацией, с плотными массивами, имитирующими механические сигналы комплаентных подложек.

Эти инсайты позволяют рационально проектировать 2.5D культурные платформы для направления клеточного поведения, потенциально полезные для тканевой инженерии, скрининга лекарств и механиобиологии.

Методы

Фабрикация наноструктур и монтаж образцов

Стеклянные коверсципы (24 мм × 24 мм, #1.5, 170 мкм толщиной) очищали, плазмообрабатывали и покрывали SU-8 2001 (500 нм или 1000 нм толщиной). Флуоресцентное SU-8 готовили добавлением 100 мкг/мл Оксазина 170, Родамина 800 или Кумарина 102. После спин-коутинга образцы выпекали, покрывали проводимым полимером (AR-PC 5091) и экспонировали 100 кВ EBL системой для создания пиллерных массивов (шаг 500–2000 нм, высота 500–1000 нм). Пост-экспозиционная разработка, кислородная плазмовая обработка и спуттерирование платиной/палладия завершали фабрикацию. Образцы монтировали пиллерами вверх в 35-мм Петри для клеточной культуры.

Клеточная культура и трансфекция

U2OS клетки растили в DMEM + 10% FBS при 37 °C, 5% CO₂. Для экспериментов 15 000 клеток на ячейку посевали на наноструктурированные или плоские поверхности. Через 6 ч клетки трансфековали Липофектамином 2000 с 0.5 мкг плазмиды pCMV-LifeAct-GFP и pTAG-RFP-винулин. Транфекционные комплексы инкубировали 20 мин при комнатной температуре перед добавлением в ячейки. Среду меняли 18 ч пост-транфекции.

Микроскопия

Live-визуализация на Zeiss LSM 800 Airyscan с 63×/1.4 NA маслом. Изображения при 34 нм xy разрешении и 180 нм z шаге. Стандартный растерный протокол обеспечивал согласованный сбор данных по всем массивам.

Анализ изображений

Изображения обрабатывали кастомным Python 3 скриптом (CZIfile, SciPy, scikit-image). Фон вычитание, медианная фильтрация и Multi-Otsu порог изолировали винулин-богатые ФА. Контуры клеток выводили из LifeAct-GFP интенсивности. Геометрические дескрипторы (площадь, круглость, соотношение сторон) рассчитывали; ФА <0.05 мкм² или с экстремальными соотношениями сторон исключали. Кратчайшее евклидово расстояние от центроида каждой ФА до края клетки вычисляли и нормализовывали максимальным радиусом клетки.

Статистический анализ

Непараметрические Манн-Уитни тесты сравнивали распределения; p-значения ≥ 0.05 считались незначимыми (ns). Уровни значимости: * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001.

Аббревиатуры

DMEM

Модифицированная среда Эйгла Дюльбекко

EBL

Электронно-лучевая литография

ECM

Внеклеточная матрица

EDTA

Этилендиаминтетрауксусная кислота

FA

Фокальная адгезия

FBS

Фетальный теленчий сывороточный

GFP

Зеленый флуоресцентный белок

HMDS

Гексаметилдисилазан

NP

Нанопиллер

RFP

Красный флуоресцентный белок

SEM

Растровое электронное микроскопирование