Быстрый, дешевый LSPR нанобиосенсор для точной диагностики бруцеллеза

Аннотация

Бруцеллез остается наиболее распространенной бактериальной зоонозом во всем мире. Конвенциональная диагностика — культура, серология и PCR — страдает от долгих сроков, ограниченной чувствительности или перекрестной реактивности. Здесь представлен золотонаночастичный локализованный поверхностный плазмонный резонанс (LSPR) нанобиосенсор, преодолевающий эти недостатки. Гладкие липополисахариды (ЛПС) из Brucella melitensis и Brucella abortus ковалентно иммобилизовали на 10-нм золотых наночастицах. Связывание антител пациентов против Brucella давало измеримый красный сдвиг LSPR пика, позволяя количественно дискриминировать инфицированные и неинфицированные сыворотки. В слепом исследовании 40 клинических образцов (20 культура-позитивных, 20 культура-негативных) сенсор достиг 85% чувствительности, 100% специфичности, 100% положительной прогностической ценности и 86% отрицательной прогностической ценности — сопоставимо или превосходит стандартные серологические тесты. Анализ требует только 30 мин, использует недорогие реагенты и пригоден для точечной диагностики.

Введение

Brucella виды — медленно растущие, грамотрицательные коккобациллы, инфицирующие широкий спектр домашних и диких животных. Среди 12 признанных видов B. melitensis, B. abortus, B. suis и B. canis — основные патогены для человека, причем B. melitensis наиболее вирулентен. Человеческий бруцеллез проявляется неспецифическими гриппоподобными симптомами, делая лабораторное подтверждение обязательным. Традиционная культура, хотя и золотой стандарт, требует 5–7 дней и несет биобезопасностные риски. Серологические тесты страдают от перекрестной реактивности и не отличают активную инфекцию от перенесенной. Нуклеинокислотное усиление дает скорость, но может оставаться положительным долго после излечения. Таким образом, срочно нужен быстрый, точный и доступный диагностический инструмент.

Локализованный поверхностный плазмонный резонанс (LSPR) использует коллективную осцилляцию проводимых электронов в металлических наночастицах, генерируя острый абсорбционный пик, сдвигающийся при биомолекулярном связывании. Золотые наночастицы (AuNP) ~10 нм предлагают высокое соотношение поверхность/объем и стабильные оптические свойства, делая их идеальными LSPR-трансдукторами. Присоединение ЛПС антигенов к AuNP позволяет LSPR сенсору обнаруживать анти-Brucella антитела с высокой чувствительностью и специфичностью в простой колориметрической ридовке.

Методы

Бактериальная культура и экстракция ЛПС

Гладкие штаммы Brucella melitensis и Brucella abortus выращивали на агаре Лизии-Бертани. ЛПС экстрагировали горячим феноловым методом, очистили серебрянокрашенным SDS-PAGE, квантифицировали 1,9-диметилметиленовым синим против стандарта Salmonella typhimurium. Белковое загрязнение исключили Bradford тестом, нуклеиновые кислоты <0.2% от массы ЛПС.

Синтез золотых наночастиц

AuNP получали Туркевич-редукцией HAuCl₄ цитратом натрия, затем добавлением борида натрия при комнатной температуре. Полученный коллоид имел 530 нм плазмонный пик и средний диаметр 10 нм, подтвержденный SEM и динамическим световым рассеянием (DLS). Зета-потенциал -28 мВ указывал на хорошую коллоидную стабильность.

Подготовка нанопроб

AuNP функционализировали тиогликолиевой кислотой (TGA) для карбоксиловых поверхностных групп. Оптимальная инкубация TGA 24 ч, после чего 300 мкг/мл ЛПС ковалентно связывали через EDC/NHS химию. Финальная проба сохраняла сильный 530 нм абсорбционный пик.

Детекция антител

Сывороточные образцы разбавляли 1:50 в PBS и смешивали 1:2 (100 мкл сыворотки + 200 мкл пробы). После 30-минутной инкубации смесь центрифугировали и измеряли абсорбцию supernatанта. Красные сдвиги ≥4.38 нм, определенные как отсечка (mean + 2 SD негативных контрольных), считались позитивными.

Этика

Все сыворотки собраны с информированным согласием и одобрением IRB (IR.FUMS.1396.324). Идентичность участников зашифрована.

Валидация

40 сывороток (20 культура-позитивных, 20 культура-негативных) тестировали. Результаты сравнили с культурой, стандартным трубчатым агглютинационным тестом (SAT) и коммерческими ELISA наборами для IgM/IgG. Чувствительность, специфичность, PPV, NPV рассчитывали стандартными формулами.

Статистический анализ

Нормальность данных проверяли Колмогоров-Смирнов; ANOVA сравнивали группы. Анализ в GraphPad Prism 8 и SPSS 9.

Результаты

Экстракция ЛПС

SDS-PAGE подтвердил ~1% выход (мокрый вес) с пренебрежимым белковым и нуклеиновым загрязнением.

Характеризация AuNP

SEM показал равномерные 10-нм сферы. DLS дал узкое распределение (10 ± 2 нм). Зета-потенциал -28 мВ. UV-Vis пик 530 нм подтвердил успешный синтез.

Оптимизация пробы

24-часовое TGA покрытие дало максимальную функционализацию без спектрального сдвига. Нагрузка ЛПС плато на 300 мкг/мл, дальше изменений абсорбции не было.

Доказательство концепции

Инкубация с позитивными контрольными анти-Brucella антителами дала явный красный сдвиг, негативные контролы — нет.

Определение отсечки

Средний красный сдвиг в негативах 1.70 нм; в позитивах 6.08 нм. Отсечка 4.38 нм дала 5% ложнопозитивных и 0% ложнонегативных в валидационной выборке.

Диагностическая производительность

По сравнению с культурой, LSPR анализ показал 85% чувствительность, 100% специфичность, 100% PPV, 86% NPV. SAT достиг 90% чувствительности, 100% специфичности; ELISA IgM/IgG имели более низкий PPV (90% и 81% соответственно).

Обсуждение

Бруцеллез вызывает ~500 000 новых случаев в год. LSPR нанобиосенсор предлагает быстрый (≤30 мин), недорогой (<$1 за тест) и высокоспецифичный альтернативу конвенциональным методам. Обнаружение анти-ЛПС антител через измеримый спектральный сдвиг обходит времязатратную культуру и проблемы перекрестной реактивности серологии. Хотя он дает качественную, а не количественную оценку уровня антител, высокий PPV и NPV делают его пригодным для скрининга и подтверждения в эндемичных регионах.

Ограничения включают персистентность антител после излечения, что может давать позитивные результаты у выздоровевших, и необходимость спектрофотометра для точного измерения сдвига. Будущая работа изучит переносные портативные ридеры для настоящей точечной диагностики.

Заключение

10-нм золотонаночастичный LSPR биосенсор демонстрирует быстрый, точный и стоимостно-эффективный детект анти-Brucella антител. Его высокая специфичность и сопоставимая с стандартной серологией чувствительность, вместе с минимальными аппаратными требованиями, делают его убедительным инструментом для диагностики бруцеллеза, особенно в ресурсно-ограниченных условиях.

Доступность данных и материалов

Наборы данных доступны у соответствующего автора по разумному запросу.

Аббревиатуры

LPS

Липополисахариды

GNPs

Золотые наночастицы

DLS

Динамическое световое рассеяние

LSPR

Локализованный поверхностный плазмонный резонанс

SAT

Стандартный трубчатый агглютинационный тест

ELISA

Иммуноферментный анализ

PPV

Положительная прогностическая ценность

NPV

Отрицательная прогностическая ценность

PSPR

Распространяющийся поверхностный плазмонный резонанс

SDS-PAGE

Натрийдодецилсульфат-полиакриламидная гель-электрофорез

SEM

Растровое электронное микроскопирование

TGA

Тиогликолиевая кислота

NHS

N-гидроксисукцинимид

EDC

N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимид гидрохлорид

PBS

Фосфатно-буферный салайн