Золотой нанобиосенсор на основе локализованного поверхностного плазмонного резонанса способен диагностировать бруцеллез человека, представляя быстрый и доступный метод

Введение

Brucellae - это медленнорастущие грамотрицательные коккобациллы, принадлежащие к семейству Brucellaceae [1]. К бруцеллам относятся факультативные внутриклеточные бактерии, поражающие различных домашних и диких животных [2]. Открытие новых типов бруцелл в последние годы значительно расширило род. В настоящее время существует двенадцать видов этого рода, четыре из которых включают Brucella. melitensis , Б. прерывание , Б. suis , и Б. canis являются основными причинами заболевания человека [3]. Б. melitensis считается наиболее опасным для человека видом [3]. Несмотря на то, что бруцеллез не вызывает смерти людей и является лишь исключительным случаем передачи от человека к человеку, непрекращающаяся эпидемия бруцеллеза человека во всем мире приводит к серьезным проблемам со здоровьем и экономическому ущербу из-за потери продуктивности животных. Важно отметить, что ослабление потенциала бруцеллеза у людей и сложный протокол лечения этого заболевания сделали эти бактерии кандидатами в агенты биологической войны [4, 5].

Бруцеллез у людей называют «болезнью ошибок» [6], потому что его клинические проявления неспецифичны и пересекаются с широким спектром других заболеваний; Следовательно, для правильного лечения пациента необходимо лабораторное подтверждение диагноза [7, 8]. Хотя посев, серологические тесты и тестирование амплификации нуклеиновых кислот могут помочь в диагностике бруцеллеза, эти методы имеют много ограничений. В культуре, являющейся золотым стандартом, основным ограничением, которое задерживает правильную диагностику и лечение пациента, является длительное время инкубации. Усовершенствованные автоматизированные системы культивирования крови (например, системы Bactec и BacTAlert) могут обнаруживать острые случаи бруцеллеза, но для них требуется от 5 до 7 дней инкубации, и даже инкубация и выполнение слепых субкультур для длительных образцов должны быть увеличены [9]. Отсутствие специфичности и ложноположительные результаты, особенно у лиц, неоднократно контактировавших с микроорганизмами Brucella, являются основными ограничениями в отношении серологических тестов [9, 10]. Хотя они обладают превосходной чувствительностью, специфичностью, безопасностью и быстрой диагностикой заболевания с помощью анализов амплификации нуклеиновых кислот, клиническая важность этих методов и их ограниченное терапевтическое значение не ясны из-за длительного сохранения положительных результатов биомолекулярных тестов у пациентов. которые полностью восстановились [9, 11]. Следовательно, необходимо разработать метод, который сможет преодолеть все ограничения теста, упомянутые выше, и в то же время усилить их преимущества.

Улучшение биосенсорных устройств с низкими пределами обнаружения стало важным компонентом исследований по обнаружению биомаркеров, потому что в последнее десятилетие большое количество исследований было посвящено поиску подходящих процедур для повышения чувствительности различных платформ обнаружения в биосенсоре [12, 13] . Биосенсоры используются для обнаружения и количественной оценки аналита путем генерации сигнала от взаимодействий, которые включают биологические компоненты. В последнее время повышенная чувствительность оптических преобразователей в сочетании с несравненной специфичностью биомолекулярных взаимодействий привела к разработке множества различных оптических биосенсоров [14]. Благодаря простоте применения, чувствительности к низким температурам и надежной генерации сигнала, о чем свидетельствует красное смещение полосы поглощения в ответ на биологические взаимодействия, тесты, основанные на уникальных оптических свойствах наночастиц, являются экономически эффективными для обнаружения биологических маркеров [ 15,16,17]. Эти методы обнаружения используют биофизические характеристики молекул, такие как молекулярная масса, заряд и показатель преломления, для отслеживания активности конкретной молекулы. Поверхностный плазмонный резонанс - это явление, вызванное коллективными колебаниями поверхностных электронов после воздействия падающего света, которое используется для быстрого и легкого обнаружения биомолекул, связанных с поверхностью [18, 19]. SPR состоит из двух основных методов:локализованного (LSPR) и распространяющегося (PSPR) [20, 21]. Среди них оптические биосенсоры на основе локализованного поверхностного плазмона получили заметное развитие в связи с их значительным потенциалом применения [12, 22]. Этот метод основан на взаимодействии между поверхностными электронами проводящих наночастиц, которые короче длины волны падающего света, и световой волной, возникающей, когда падающий свет в зоне проводимости взаимодействует с поверхностными электронами [23, 24]. По сравнению с другими подобными платформами биосенсоры на основе локализованного поверхностного плазмонного резонанса имеют несколько преимуществ (например, поверхностный плазмонный резонанс), такие как меньшая длина затухания электромагнитного поля, нечувствительность к изменениям показателя преломления в объеме, вызванным колебаниями температуры или компонентами окружающая среда и способность возбуждаться свободно распространяющимся светом [12]. Поэтому в технологии нанобиосенсоров нанобиосенсоры на основе LSPR считаются одним из самых мощных инструментов для обнаружения биомолекул.

Короче говоря, с одной стороны, лабораторные стратегии по-прежнему являются основной базой для диагностики бруцеллеза. С другой стороны, современные клинические методы сталкиваются со многими ограничениями. Поэтому предложение нового альтернативного метода, который может преодолеть недостатки существующих методов, считается одним из основных компонентов протоколов лечения. Таким образом, это исследование было направлено на внедрение быстрого, удобного, недорогого, безопасного и чувствительного нанобиосенсора на основе LSPR для обнаружения антител против бруцелл в биологических образцах для диагностики бруцеллеза. С этой целью липополисахариды (ЛПС) B. melitensis и B. abortus были нанесены на наночастицы золота (ЗНЧ), и были оценены специфичность, чувствительность, положительная прогностическая ценность (PPV) и отрицательная прогностическая ценность (NPV) метода. путем сравнения полученных результатов с анализом сывороточной культуры. Кроме того, в текущем исследовании был проведен иммуноферментный анализ для измерения антител к бруцеллезам (как IgM, так и IgG) и стандартный пробирочный тест агглютинации для оценки способности разработанной в настоящее время технологии выявлять бруцеллез в отличие от традиционных методов. P>

Методы

Бактериальная культура и экстракция ЛПС

Гладкие штаммы B. melitensis и Б. прерывание были выращены в Лурия-Бертани [3] агар. На следующем этапе бактерии собирали и экстрагировали ЛПС с использованием модифицированного метода горячей фенольной воды [25]. Для подтверждения качества экстрагированного ЛПС применяли электрофорез в геле додецилсульфата натрия в полиакриламидном геле (SDS-PAGE, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) с окрашиванием нитратом серебра. Количественное определение ЛПС проводили с использованием 1,9-диметилметиленового синего (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) с использованием Salmonella typhimurium как стандарт. Для оценки загрязнения белками и нуклеиновыми кислотами использовали метод Брэдфорда и оптическую плотность при 260 нм.

Синтез сферических наночастиц золота

Химическое восстановление соли золота (HAuCl ₄ ) был использован для синтеза наночастиц золота, который представляет собой быструю, недорогую и экологически чистую процедуру синтеза наночастиц Au при комнатной температуре [26]. Согласно описанному методу 15 мг цитрата натрия (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) растворяли в 50 мл дистиллированной деионизированной воды, хранили на ледяной бане и перемешивали на магнитной мешалке (150 об / мин). . Одновременно добавляли 600 мкл раствора соли золота (17,3 мМ). Затем добавляли 1,2 мл раствора боргидрида натрия (20 мМ). Раствор перемешивали в течение 2 часов в аналогичных условиях, а затем выдерживали при 4 ° C для последующего применения. Согласно предыдущим исследованиям, в этом типе синтеза цитрат натрия одновременно действует как восстанавливающий агент (приводящий к восстановлению AuIII до Au0), блокирующий агент (электростатически стабилизирующий коллоидный раствор наночастиц золота) и медиатор pH (модифицирующий реакционную способность Au виды, участвующие в реакции). В этом анализе получение раствора красного цвета из раствора HAuCl4 желтого цвета показывает образование золота с нулевой степенью окисления.

Сканирующая электронная микроскопия (SEM) использовалась для изучения морфологии наночастиц золота, а Zetasizer NanoZS90 (Malvern Instruments Ltd, Малверн, Вустершир, Великобритания) был использован для оценки распределения по размерам. Динамическое рассеяние света (DLS) при угле рассеяния 90º использовалось в качестве основного принципа для измерения размера частиц. Zetasizer Nano использовал лазер с длиной волны 633 нм. С помощью этого метода разброс частиц, вызванный броуновским движением, измеряется и преобразуется в распределение по размерам с помощью соотношения Стокса-Эйнштейна [27]. Дзета-потенциал также применялся для определения электрического заряда поверхности наночастиц. Спектры поглощения наночастиц регистрировали с помощью спектрофотометра Cary 500 UVeviseNIR (ультрафиолетовый – видимый ближний инфракрасный) (Varian, Австралия).

Создание нанозонда (биосенсора)

Карбоксилирование наночастиц золота

Наночастицы золота были покрыты линкерами тиогликолевой кислоты для подготовки поверхности ЗНЧ к загрузке ЛПС. Короче говоря, 1 мл раствора ТГА (1 мМ) смешивали с 1 мл раствора наночастиц золота и выдерживали при комнатной температуре в течение 24 часов. Для выделения наночастиц золота с покрытием раствор центрифугировали при 12000 g в течение 15 мин. После этого использовали две стадии промывки бидистиллированной деионизированной водой для удаления избытка ТГА. Наконец, спектрофотометрия была использована для оценки покрытия тиогликолевой кислоты на поверхности ЗНЧ.

Оптимизация покрытия тиогликолевой кислотой на золотых наночастицах

Покрытие ТГА наносили в разное время, включая 12, 18, 24, 36 и 48 часов, чтобы оптимизировать коэффициент покрытия ТГА на наночастицах золота. Впоследствии была измерена и построена диаграмма оптической плотности для определения оптимального времени инкубации.

Ковалентное присоединение LPS к наночастицам золота, модифицированным TGA

Чтобы стимулировать ковалентное связывание между карбоксильной группой TGA и аминогруппой LPS, карбоксильные группы были активированы EDC (самый популярный сшивающий агент нулевой длины для биохимических конъюгаций) и молекулами N-гидроксисукцинимида (NHS) [28]. Осажденные наночастицы золота суспендировали в 0,1 мМ растворе EDC / NHS и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. На следующем этапе добавляли 2 мл фосфатно-солевого буфера (PBS), содержащего 0,05% твин-20 (PBST) (pH 7,4). После интенсивного перемешивания наночастицы центрифугировали при 12000 об / мин в течение 15 мин. После центрифугирования после удаления супернатанта добавляли раствор LPS. Затем смесь инкубировали в ультразвуковой бане в течение 10 мин, после чего инкубировали в течение 3 ч при комнатной температуре. После этого добавляли 2 мл PBST и интенсивно встряхивали с последующим центрифугированием в течение 15 мин при 12000 об / мин и супернатант удаляли. Наконец, нанозонды ресуспендировали в 500 мкл PBS, и спектры LSPR измеряли с помощью спектрофотометра. После подтверждения присоединения ЛПС к наночастицам золота раствор выдерживали при 4 ° C для дальнейших исследований. На рисунке 1 показаны уравнения химического взаимодействия при синтезе наночастиц золота, модифицированных ТГА, и присоединении ЛПС.

Химические взаимодействия присоединения ЛПС к наночастицам золота. А Молекула ТГА, B EDC + NHS взаимодействие и C Ковалентное присоединение ЛПС к наночастицам золота, модифицированным ТГА. Номер 1:наночастицы; № 2:LPS

Оптимизация концентрации LPS

Чтобы максимизировать связывание ЛПС с активированными карбоксильными группами ТГА, была проведена оптимизация соотношения наночастиц ЛПС и Au путем оценки сдвига пика в спектрах LSPR как функции концентраций ЛПС (100, 150, 200, 300 и 560 мкг / мл) в фиксированном количестве наночастиц Au.

Обнаружение антител против ЛПС с помощью нанозонда

100 мкл разбавленных образцов (1:50 в PBS) смешивали с 200 мкл биосенсора и перемешивали пипетированием. На следующем этапе биосенсоры центрифугировали при 12000 g в течение 15 минут после 30 минут инкубации при комнатной температуре. Наконец, биосенсоры суспендировали в 200 мкл PBS и измеряли оптическую плотность, как описано ранее. Для подтверждения функции нанобиосенсора были также предоставлены положительный и отрицательный контроли из имеющегося в продаже набора для ELISA (Pishtazteb Zaman, Иран).

Этика

Использование сыворотки крови человека было одобрено комитетом по этике Университета медицинских наук Фаса, Иран (IR.FUMS.1396.324). Личности доноров сыворотки были закодированы и не раскрывались никому, участвовавшему в этом исследовании. Кроме того, все процедуры выполнялись в соответствии с этическими принципами и национальными правилами. Более того, все образцы были взяты от субъектов, подписавших письменное информированное согласие.

Оценка функции разработанного метода

Для оценки функциональности разработанного метода были предоставлены сорок образцов, содержащих 20 случаев (истинно положительных) и 20 контрольных (истинно отрицательных). По этой причине эффективность разработанного метода в настоящем исследовании сравнивалась с результатами культивирования. Кроме того, для оценки сывороточных уровней антител IgM и IgG использовались доступные коммерческие наборы (Pishtaz Teb, Тегеран, Иран). Подготовка образцов и оценка антител проводились в соответствии с протоколом производителя (специфичность:99,85%, чувствительность:99,4%). Кроме того, для всех образцов сыворотки был проведен тест на агглютинацию в стандартной пробирке для сравнения и проверки эффективности метода, основанного на LSPR. Чтобы оценить эффективность разработанного метода, полученные результаты метода на основе LSPR сравнивались с упомянутыми стандартными тестами с расчетом чувствительности, специфичности, положительной прогностической ценности и отрицательной прогностической ценности на основе следующей общей формулы:

Статистический анализ

Это исследование было проанализировано как классический эксперимент с диагностической эффективностью путем оценки согласованности предложенного теста, LSPR-наносенсора и эталонного стандартного теста, культуры и некоторых традиционных тестов, включая ELISA и SAT, для определения их способности определять целевое состояние. . Значения отсечения были рассчитаны как среднее значение контрольных (истинно отрицательных) сывороток плюс двукратные значения стандартного отклонения (2SD). Тест Колмогорова – Смирнова был использован для определения нормальности и оценки распределения данных. На основании результатов нормальности, которые выявили параметрическое распределение, для сравнения групп использовался тест ANOVA. Все статистические анализы были выполнены с использованием GraphPad Prism для Windows версии 8 и SPSS для Windows версии 9.

Результаты

Анализ экстракции липополисахаридов

SDS-PAGE показал, что выход экстракции LPS составлял приблизительно 1 процент от сырого веса использованных бактерий. Более того, концентрация нуклеиновой кислоты составляла ≤ 0,2% от концентрации ЛПС. Важно отметить, что метод Брэдфорда продемонстрировал отсутствие каких-либо белковых примесей.

Характеристика наночастиц золота

Распределение наночастиц по размерам определяет качество биосенсора. Согласно предыдущим исследованиям, наночастицы должны иметь определенный размер. В этом отношении достаточно малый размер наночастиц приводит к подходящей коллоидной стабильности, высоким отношениям поверхности к объему, а быстрое перемещение для высоких скоростей связывания приводит к высокому сродству, высокой чувствительности и высокой селективности во взаимодействии с биологическими мишенями. Кроме того, наночастицы должны быть как можно больше, чтобы позволить присутствию различных лигандов на поверхности частицы, а также получить многовалентные взаимодействия [29,30,31]. Как Gu et al. Сообщается, что сопоставимость размера наночастиц с размером биологических мишеней особенно важна при взаимодействии белков [32]. В соответствии с размером антител против Brucella, который составляет 2–5 нм [33], в этом исследовании были получены наночастицы золота со средним размером 10 нм и выполнено определение распределения наночастиц по размерам с помощью прибора Zetasizer NanoZS90, который использует лазер с длиной волны 633 нм. В этом методе используется уравнение Стокса-Эйнштейна, которое может преобразовать диффузию частиц, вызванную броуновским движением, в распределение по размерам. Согласно рис. 2, ЗНЧ были равномерно распределены в масштабе 10 нм. Значения дзета-потенциала раскрыли подробности о поверхностном заряде и стабильности ЗНЧ. Частицы были заряжены отрицательно, а их дзета-потенциал составлял примерно -28 мВ. Кроме того, в таблице 1 показана максимальная длина волны поглощения ЗНЧ. Длины видимых и ультрафиолетовых волн измеряли спектрофотометром, максимальное поглощение составляло 530 нм. Мы использовали метод Туркевича для получения наночастиц золота. Преимуществами этого метода являются получение наночастиц золота, включая простой и дешевый производственный процесс, возможность контролировать размер наночастиц и надлежащую коллоидную стабильность [34].

Структура наночастиц золота под СЭМ. Равномерное распределение наночастиц золота хорошо отражено на рисунке

Характеристика нанобио-зонда

Как упоминалось выше, в этом исследовании использовали молекулы TGA для соединения наночастиц золота с LPS, что привело к небольшому снижению пика LSPR на 530 нм на 4,55%. Кроме того, в настоящем исследовании было выполнено несколько инкубаций для определения максимальной адгезии ТГА к наночастицам золота. Согласно результатам, показанным на рис. 3, 24 часа инкубации ТГА с ЗНЧ привели к максимальному покрытию ТГА на поверхности наночастиц золота.

Оптимизирующее покрытие тиогликолевой кислоты на наночастицах золота. Как видно из рисунка, после 24 часов инкубации нет значительного изменения абсорбции, несмотря на удлинение соседнего времени. Поэтому 24 часа были выбраны в качестве оптимального времени для нанесения тиогликолевой кислоты на ЗНЧ. Y -ось показывает интенсивность поглощения при 530 нм (максимальное поглощение наночастиц). Эксперименты проводили в трех экземплярах. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. а.е.:единица абсорбции

Что касается определения оптимальной концентрации ЛПС, в настоящем исследовании изучались концентрации, включающие 100, 150, 200, 300 и 560 мкг / мл. Как показано на фиг. 4, по мере увеличения концентрации оптическая плотность уменьшается. Согласно результатам, в настоящем исследовании была выбрана концентрация ЛПС 300 мкг / мл для покрытия поверхности ЗНЧ, модифицированных ТГА, поскольку не было заметного снижения интенсивности пика поглощения при увеличении концентрации ЛПС.

Оптимизация концентрации ЛПС. По мере увеличения концентрации ЛПС абсорбция значительно снижалась. Однако при увеличении концентрации LPS более чем на 300 мг / мл не наблюдалось значительного снижения абсорбции LSPR. Следовательно, указанная концентрация была выбрана в качестве оптимальной. Y -ось показывает интенсивность поглощения при 530 нм (максимальное поглощение наночастиц). Эксперименты проводили в трех экземплярах. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. а.е.:единица абсорбции

Оценка функций нано-биозонда

Поскольку метод LSPR является поверхностно-чувствительным оптическим методом, он может обнаруживать взаимодействие между антителами против LPS и антигенами на поверхности наночастиц золота посредством изображения изменений пика поглощения LSPR, вызванного электростатическим взаимодействием между антителом и антиген. Чтобы подтвердить правильное функционирование биосенсора, в этом исследовании был подготовлен положительный контроль, состоящий из антител против ЛПС Brucella с титром 1:80 и отрицательный контроль, и записан спектр LSPR биосенсора после инкубации с контролями. Как показано на фиг. 5, инкубация с отрицательным контролем не влияла на поглощение LSPR. Однако инкубация с положительным контролем вызвала сдвиг максимальной абсорбции LSPR, который ранее был известен как красное смещение. Таким образом, связывание антител против Brucella с антигенами LPS ограничивает вероятность попадания света на поверхность нанозондов.

Пик нанозонда LSPR в присутствии положительного и отрицательного контролей. Контроли были предоставлены из имеющихся в продаже наборов для ELISA

Определение значения отсечения

С этой целью в этом исследовании было получено 40 сывороток от истинно положительных и отрицательных субъектов на основе посева и клинических наблюдений. Как показано на рис. 6, среднее красное смещение в истинно отрицательных образцах (контроле) составляло 1,70 нм, что значительно отличалось от истинно положительных пациентов ( P значение <0,001). Кроме того, результаты показали, что красное смещение 4,38 нм следует использовать в качестве значения отсечки. Интересно, что только 5% контролей имели красное смещение выше порогового значения, а красное смещение у всех пациентов было выше порогового значения, что указывает на то, что эффективность метода приемлемая, а определение порогового значения является надежным.

Красное смещение пика LSPR в сыворотках реальных пациентов и контрольных субъектов. При взаимодействии между антителами, которые присутствовали в сыворотках инфицированных индивидуумов, имело место красное смещение, которое значительно отличалось от контрольных. Кроме того, на рисунке показаны значения SD и 2SD, которые важны для определения точки отсечки. Эксперименты проводили в трех экземплярах для каждого образца. P значение <0,05 считалось значимым

Проверка функции биосенсора

На предыдущих этапах этого исследования был представлен быстрый и недорогой метод выявления антител против бруцелл в образцах. Однако необходимо проверить работоспособность нового метода. С этой целью в этом исследовании был проведен ряд дополнительных исследований, включая стандартный тест на агглютинацию пробирки, определение уровней анти-IgG и анти-IgM в сыворотках отрицательных и положительных образцов на основе результатов культивирования. Как показано в Таблице 2, чувствительность текущего метода была меньше, чем чувствительность одного SAT. Важно отметить, что специфичность метода на основе LSPR показала наиболее приемлемый результат - 100%. Подобно специфичности, положительная прогностическая ценность текущего метода была выше, чем других традиционных тестов (100%). В конечном итоге NPV для методов на основе SAT, IgG, IgM и LSPR составило 90%, 90%, 81% и 86% соответственно.

Обсуждение

Бруцеллез, вероятно, считается первой инфекцией человека после приручения крупного рогатого скота, овец и коз [35]. Бруцеллез является наиболее распространенным бактериальным зоонозом в мире, ежегодно во всем мире диагностируется 500 000 новых случаев заболевания людей [9, 36]. Симптомы бруцеллеза человека не являются патогномоничными, поскольку инфекция может поражать любой орган тела [37]. Хотя лабораторные данные по-прежнему являются надежным фактором в выявлении заболевания, текущие стратегии, включая посевы, серологические исследования и тесты амплификации нуклеиновых кислот, показали серьезные недостатки [9, 38,39,40]. Поэтому в этом исследовании делается попытка представить новый метод диагностики, основанный на LSPR, для устранения ограничений.

В последние годы локализованный поверхностный плазмонный резонанс был использован в качестве основы для разработки биосенсоров. Преимущества текущих исследований наночастиц золота и достижения в области нанотехнологий считаются основными факторами улучшения диагностической эффективности. Уникальные цветовые и оптические свойства ЗНЧ, обусловленные их плазмонными и регулируемыми эффектами, являются двумя выдающимися и полезными характеристиками этих частиц по сравнению с другими частицами [12, 41].

В этом исследовании красное смещение пика LSPR использовалось в качестве индикатора взаимодействия между антигенами LPS и антителами против Brucella. Другими словами, по сравнению с контрольными образцами, присутствие антител в сыворотке исследуемых образцов вызывало значительное красное смещение пика поглощения LSPR, что можно предположить как индикатор бруцеллеза. Хотя существует значительная разница в красном смещении между контрольными образцами и образцами из клинических случаев, это различие не может количественно определить концентрацию антител в сыворотке, что можно рассматривать как одно из серьезных ограничений этого метода. Однако мы должны помнить, что некоторые распространенные методы, такие как стратегии, связанные с ИФА, обычно считаются точкой отсечения [42, 43].

Важно отметить, что это исследование подтвердило эффективность метода, основанного на LSPR, путем сравнения полученных результатов с другими текущими методами путем оценки различных параметров. Первым анализируемым параметром была чувствительность, определяющая вероятность положительного результата теста на бруцеллез у пациента [44]. Как отмечают Ягупский с соавт. Как уже обсуждалось [9], чувствительность посевов крови, которая в настоящее время считается золотым стандартом, снижается, особенно при хронических заболеваниях и очаговых инфекциях. Кроме того, этот метод сталкивался и с другими серьезными ограничениями, такими как проблемы лабораторной безопасности, медленный рост бактерий, а положительный результат - неоспоримое свидетельство болезни [45, 46]. Этот метод, основанный на LSPR, представляет собой надежный и конкурентоспособный результат по сравнению с традиционными методами по чувствительности, такими как культивирование, SAT и наборы для анализа ELISA. При этом оценивалась специфичность, то есть вероятность отрицательного результата теста, если пациент не инфицирован [45, 47]. Как показали результаты, по сравнению с другими диагностическими стратегиями, разработанный метод, основанный на LSPR, имел наиболее значительный результат с точки зрения специфичности. Это важная характеристика этого метода, потому что предыдущие исследования ставили под сомнение валидность и специфичность серодиагностических методов бруцеллеза человека, поскольку бессимптомные и самоограниченные эпизоды этой инфекции возникают в районах, эндемичных по зоонозу [48,49,50]. Однако, как и методы, связанные с антителами, текущий метод препятствует возможному долгосрочному сохранению антител против бруцелл в сыворотке даже после полного выздоровления от бруцеллеза.

Как и в предыдущих исследованиях, прогностическая ценность положительного результата определялась как отношение истинно положительных результатов к сумме всех положительных результатов [51]. Аналогичным образом NPV описывалась как отношение истинно отрицательных результатов к сумме всех отрицательных результатов [51]. По сравнению с традиционными диагностическими стратегиями, метод, разработанный в настоящее время, дает самые замечательные результаты PPV, демонстрируя его способность различать инфицированных и неинфицированных людей. Кроме того, оценка результатов NPV выявила многообещающий потенциал метода, основанного на LSPR, для исключения пациентов, не являющихся пациентами, из числа реальных пациентов.

Заключение

В этом исследовании был представлен быстрый, простой, недорогой, надежный и экономичный метод диагностики бруцеллеза. Хотя есть некоторые незначительные ограничения, в том числе качественные результаты и возможность быть положительными у выздоровевших людей, обсуждаемые преимущества показывают, что он имеет хорошие возможности по сравнению с текущими лабораторными диагностическими процедурами.

Доступность данных и материалов

Наборы данных, использованные и / или проанализированные в ходе текущего исследования, доступны у соответствующего автора по разумному запросу.

Сокращения

LPS:

Липополисахариды

ВНП:

Наночастицы золота

DLS:

Динамическое рассеяние света

LSPR:

Локализованный поверхностный плазмонный резонанс

SAT:

Стандартный пробирочный тест на агглютинацию

ELISA:

Иммуноферментный анализ

PPV:

Положительная прогностическая ценность

ЧПС:

Отрицательная прогностическая ценность

PSPR:

Распространение поверхностного плазмонного резонанса

SDS-PAGE:

Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия

SEM:

Сканирующая электронная микроскопия

TGA:

Тиогликолевая кислота

NHS:

N-гидроксисукцинимид

EDC:

N - (3-диметиламинопропил) - N '-Этилкарбодиимида гидрохлорид

PBS:

Фосфатный буферный раствор