Улучшение адгезии клеток на полиэтерэтеркетоне (PEEK) путем золотого покрытия и аргоновой плазменной обработки

Аннотация

Полиэтерэтеркетон (PEEK) обладает исключительной химической стабильностью и биомеханической совместимостью для биомедицинских имплантов, однако его гидрофобная, биоинертная поверхность затрудняет прикрепление клеток. В этом исследовании изучен синергетический эффект активации аргоновой плазмой и распыления золота на поверхности PEEK для создания наноструктурированного интерфейса, способствующего адгезии и спредингу эмбриональных фибробластов мыши. Свойства поверхности — полярность, химия и топография — количественно определены гравиметрией, гониометрией, рентгеновской фотоэлектронной спектроскопией (XPS), электрокинетическим анализом и атомно-силовой микроскопией (AFM). Клеточный ответ оценивали адгезионными тестами, флуоресцентной визуализацией и РЭМ. Результаты показывают, что плазменное воздействие генерирует полярные группы и увеличивает поверхностный кислород, тогда как золотое покрытие дополнительно улучшает смачиваемость и вводит наноструктурированный металлический слой. Особенно, толщина золотого покрытия прямо коррелирует с улучшением адгезии клеток, а непрерывные золотые слои при осаждении 150–300 с обеспечивают наиболее благоприятную среду для пролиферации фибробластов. Эти выводы поддерживают комбинированный плазменно-золотой подход как жизнеспособную стратегию улучшения биологической производительности PEEK в ортопедических и спинальных имплантах.

Введение

Возрастно-связная дегенерация суставов приводит к переломам, артриту и костным опухолям, стимулируя спрос на надежные ортопедические импланты. Традиционные металлические сплавы — титан и кобальт-хром — ценятся за прочность и коррозионную стойкость, но их высокий модуль Юнга часто вызывает эффект «стресс-шилдинга» и последующую костную ресорбцию. Полимерные альтернативы — UHMWPE, PTFE, PMMA, PLA, PGA, PHB — широко используются, но обычно лишены механической робастности для нагрузочных применений. PEEK, полукристаллический ароматический термопласт, замыкает этот разрыв, предлагая модуль, близкий к костной ткани, отличную химическую и термическую стабильность и доказанную биосовместимость. Однако его врожденная гидрофобность и биоинертность ограничивают адсорбцию белков и адгезию клеток, что требует стратегий модификации поверхности.

Модификация поверхности достижима плазменной активацией или металлическим распылением. Плазменная обработка вводит реактивные виды, меняющие поверхностную химию без ущерба объемным свойствам, в то время как золотое распыление обеспечивает биологически активный слой, улучшающий прикрепление клеток и служащий платформой для дальнейшей функционализации. В частности, золотые нанчастицы ниже 100 нм известны как усиливающие адгезию и пролиферацию клеток. Настоящая работа исследует комбинацию аргоновой плазменной активации и золотого распыления для создания наноструктурированной поверхности PEEK, оптимизированной для роста фибробластов, с потенциальными последствиями для спинальных и ортопедических имплантов.

Методы

Материалы и модификации поверхности

Пленки PEEK (толщина 50 мкм, плотность 1.26 г/см³) приобретены у Goodfellow Ltd. Каждый образец диаметром 2 см сначала подвергали аргоновой плазме (Balzers SCD 050) в течение 60 с или 240 с при 8.3 Вт. Затем половину каждого образца покрывали золотом методом DC аргонового распыления (ток 40 мА, 15 Вт) в течение 30 с, 150 с или 300 с, формируя золотые слои с временем осаждения 30–300 с. Образцы хранили при 24 °C, 40–60% влажности до тестирования.

Характеристика поверхности

Гравиметрия

Толщина золота определяли приростом массы на микровесах Mettler Toledo UMX2, используя объемную плотность золота. Десять повторов на условие дали <15% погрешность.

Угол смачиваемости воды

Смачиваемость измеряли системой анализа формы капли DSA 100. Капли 2 мкл наносили на выдержанные образцы (14 дней) и фиксировали угол через 2 с. Каждый образец измеряли минимум 7 раз на 3 повторных пробы, отчитывались среднее ± SD.

Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия

XPS спектры получали на спектрометре Omicron ESCAProbeP. Анализировали площадь 2×3 мм² в ультравысоком вакууме, фокусируясь на пиках C 1s, O 1s, Au 4f. Три независимых измерения на образец дали <10% ошибку.

Дзета-потенциал

Электрокинетический потенциал измеряли в 1 мМ KCl и фосфатно-буферном растворе (PBS, pH 7.4) на Anton Paar SurPASS. Пары пленок (20×10 мм²) помещали в ячейку с зазором 100 мкм. Токового ток записывали три раза на образец, применяли уравнение Гельмгольца-Смолуховского. Все измерения на 14-дневных выдержанных образцах.

Атомно-силовая микроскопия

AFM-образы (Bruker VEECO CP II) в таппинговом режиме с зондами RTESPA-CP раскрывали морфологию поверхности на областях 1×1 мкм². Множественные сканы подтверждали воспроизводимость. Образцы 14-дневной выдержки.

Масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой

Выщелачивание золота в PBS (pH 7.4) количественно определяли ICP-MS (Agilent 8800). Образцы инкубировали при 37 °C в течение 6, 24 и 72 ч в увлажненной 5% CO₂ атмосфере. Выщелачиваемые растворы разбавляли 1:8 и анализировали с неопределенностью <3%.

Клеточная культура и цитокомпатибильность

Эмбриональные фибробласты мыши (L929) культивировали в DMEM с 10% FBS и 2 мМ L-глутамина при 37 °C, 5% CO₂. Стерилизованные диски PEEK монтировали в 12-колоночные пластинки; посевали 30 000 клеток на колоду. Адгезию оценивали через 6 ч, пролиферацию — через 24 и 72 ч. Эксперименты в триplicates.

Флуоресцентная микроскопия

После инкубации клетки фиксировали 4% формальдегидом, окрашивали F-актин (фаллоидин-Атто 565) и ядра (DAPI), визуализировали. Изображения получали на 14-дневных выдержанных образцах.

Растровое электронное микроскопирование

РЭМ (Tescan LYRA3 GMU) в режиме вторичных электронов визуализировал морфологию клеток на pristine PEEK, плазменно-обработанном/золоченном PEEK и стеклянных кавергласах (контроль). Клетки фиксировали раствором Карновского, дегидратировали через градуированный этанол, покрывали 10 нм золота, обрабатывали при масштабе 10 мкм.

Результаты и обсуждение

Все анализы проводились на 14-дневных выдержанных образцах для захвата стабилизированного поверхностного состояния после плазмы и золочения. Плазменная обработка вызвала умеренное увеличение шероховатости и генерацию полярных функциональных групп, что подтверждено AFM и XPS. Особенно, углы смачиваемости слегка выросли после плазмы (с 79.5° до ~95°), но существенно снизились после золочения, указывая на повышенную гидрофильность.

Гравиметрия показала двукратный рост аблиации PEEK при удлинении плазменного воздействия с 60 до 240 с, отражая более высокий энергетический вклад. Напротив, золотое распыление 150 и 300 с давало непрерывные слои, улучшающие адгезию золота к полимеру.

XPS-анализ выявил четкую тенденцию: плазма снижала поверхностный углерод и повышала кислород, подтверждая введение полярных групп. Последующее золочение уменьшало сигналы кислорода и повышало сигналы золота, с сильнейшими Au-сигнатурами для 300-секундного распыления.

AFM-образы продемонстрировали, что более длительная плазма создает более шероховатую поверхность, что в свою очередь способствует формированию более крупных, равномерных золотых кластеров при распылении. 30-секундные золотые слои формировали дискретные острова, тогда как 150- и 300-секундные покрытия давали непрерывные пленки с повышенной шероховатостью.

Дзета-потенциал показал, что плазменная активация повышала поверхностный заряд (более отрицательный) и в KCl, и в PBS, тогда как золочение сдвигало потенциал к менее отрицательным или слегка положительным значениям. Эффект был более выражен в PBS из-за большей ионной силы, указывая на то, что спроектированная поверхностная химия чувствительна к физиологическим условиям.

ICP-MS данные указали, что тонкие золотые слои (30 с) выщелачивали более высокие концентрации золота в PBS, вероятно, из-за их дискретной природы. Напротив, непрерывные 300-секундные покрытия выделяли пренебрежимое золото, снижая потенциальную цитотоксичность.

Клеточные анализы подтвердили превосходную производительность плазменно-обработанного и золоченного PEEK. Через 6 ч адгезия на pristine PEEK была сравнима с тканевой пластиковой пластинкой, но на плазменно-обработанных поверхностях увеличивалась. Через 72 ч лучшие результаты показывали 60 с плазма + 300 с золото и 240 с плазма + 300 с золото, где непрерывные золотые пленки обеспечивали подходящий субстрат для пролиферации фибробластов. Тонкие золотые слои (30 с) давали наименьшие счеты клеток, коррелируя с более высоким выщелачиванием золота.

РЭМ-изображения подтвердили эти выводы, показывая хорошо растекающиеся, вытянутые фибробласты на оптимизированных поверхностях, тогда как клетки на тонкослойном золоте демонстрировали округлую морфологию, указывающую на слабую адгезию.

Заключение

Аргоновая плазменная активация с последующим золотым распылением эффективно адаптирует поверхности PEEK для биомедицинского использования. Плазменное воздействие 240 с удваивает аблиацию поверхности и вводит полярные группы, в то время как золотые слои 150–300 с осаждают непрерывные наноструктурированные пленки, значительно улучшающие смачиваемость, поверхностный заряд и адгезию фибробластов. Тонкие золотые слои непригодны из-за более высокого выделения металла и сниженной пролиферации клеток. В целом, комбинированный плазменно-золотой подход дает материал PEEK с улучшенной цитокомпатибильностью, подходящий для ортопедических и спинальных имплантов.

Аббревиатуры

AFM:

Атомно-силовая микроскопия (Atomic force microscopy)

CO₂:

Углекислый газ (Carbon dioxide)

DAPI:

4′,6-Диамидино-2-фенилиндиол дигидрохлорид (4′,6‑Diaminido‑2‑phenylindole dihydrochloride)

DMEM:

Модифицированное среднее Эйгла Дюльбекко (Dulbecco’s modified Eagle’s medium)

FBS:

Фетальная бычья сыворотка (Fetal bovine serum)

ICP‑MS:

Масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой (Inductively coupled plasma mass spectrometry)

KCl:

Хлорид калия (Potassium chloride)

L929:

Эмбриональные фибробласты мыши (Mouse embryonic fibroblasts)

PBS:

Фосфатно-буферный раствор (Phosphate‑buffered saline)

PEEK:

Полиэтерэтеркетон (Polyetheretherketone)

PGA:

Полигликолид (Polyglycolide)

PHB:

Полигидроксибутират (Polyhydroxybutyrate)

PLA:

Поли(L-лактид) (Poly(l‑lactide))

PMMA:

Полиметилметакрилат (Polymethylmethacrylate)

PTFE:

Политетрафторэтилен (Polytetrafluorethylene)

SEM:

Растровое электронное микроскопирование (Scanning electron microscopy)

TCPS:

Тканевая культура полистирола (Tissue culture polystyrene)

UHMWPE:

Ультравысокомолекулярный полиэтилен (Ultra‑high‑molecular‑weight polyethylene)

WCA:

Угол смачиваемости воды (Water contact angle)

XPS:

Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия (X‑ray photoelectron spectroscopy)