МикроРНК-18а от М2 макрофагов стимулирует прогрессию назофаринgealного карциномы через TGFBR3 в TGF-β пути

Аннотация

Цели

Назофарингеальная карцинома (НКР) — тип назофарингеального заболевания с высокими метастатическими и инвазивными свойствами. Доказано, что опухолевые ассоциированные альтернативно активированные (М2) макрофаги связаны с НКР. На этой основе данное исследование направлено на изучение механизма и участия микроРНК-18а (miR-18а) от М2 макрофагов в НКР.

Методы

Периферические мононуклеарные клетки крови дифференцировали в макрофаги, а макрофаги поляризовали в М2 тип интерлейкином-4. Клетки SUNE-1 и CNE2 трансфицировали восстановленным или истонченным miR-18а или рецептором III типа трансформирующего фактора роста-бета (TGFBR3) для изучения их ролей в прогрессии НКР с вовлечением TGF-β сигнального пути. Далее, клетки SUNE-1 и CNE2 ко-культивировали с М2 макрофагами, обработанными восстановленным или истонченным miR-18а или TGFBR3, для понимания их комбинированных ролей в НКР с вовлечением TGF-β сигнального пути.

Результаты

MiR-18а высоко экспрессировала, а TGFBR3 — низко экспрессировала в клетках НКР. Восстановление miR-18а, нокаут TGFBR3 или ко-культивация с М2 макрофагами, трансфицированными мимиками miR-18а или si-TGFBR3, стимулировали прогрессию клеток SUNE-1, рост опухоли у мышей, снизили p-Smad1/t-Smad1 и повысили p-Smad3/t-Smad3. Регуляция вниз miR-18а, экспрессия TGFBR3 или ко-культивация с М2 макрофагами, трансфицированными ингибиторами miR-18а или OE-TGFBR3, подавляли прогрессию клеток CNE2, рост опухоли у мышей, повысили p-Smad1/t-Smad1 и снизили p-Smad3/t-Smad3.

Заключение

Наше исследование разъясняет, что miR-18а от М2 макрофагов приводит к стимулированию прогрессии клеток НКР и росту опухоли у голых мышей через подавление TGFBR3, вместе с инактивацией Smad1 и активацией Smad3.

Введение

Назофарингеальная карцинома (НКР) — эпителиальная злокачественная опухоль, склонная к местной инфильтрации и ранней дальней метастазированию [1]. Пациенты с НКР часто жалуются на парез VI парной черепной нерва и синдром Горнера [2]. На данный момент применяемое лечение преимущественно состоит из лучевой терапии и комбинированной лучевой и химиотерапии [3]. К сожалению, лучевая и химиотерапия неожиданно сопровождаются осложнениями, и приобретенная резистентность к лучевой терапии препятствует результатам лечения НКР [3]. Учитывая, что задача поиска потенциальной таргетной терапии является приоритетом.

Дисрегулированные микроРНК (miRNA) задокументированы как вовлеченные в тумorigенез НКР, метастазирование, инвазию и резистентность к лучевой и химиотерапии [1]. Как подсемейство miRNA, miR-18а найдена как способствующая прогрессии НКР через ингибицию супрессора морфогенеза в гениталиях 1 и активацию mTOR пути [4]. Кроме того, miR-18а дополнительно верифицирована как активирующая пролиферацию и метастаз клеток НКР через регуляцию DICER1 [5]. Дополнительно, прогрессия клеток НКР доказана как стимулируемая miR-18а через нарушение биогенеза miRNA [6]. Более того, miR-18а задокументирована как критически функционирующая в метастазировании НКР [7]. Альтернативно активированные (М2) макрофаги являются важными компонентами солидных и гематологических злокачественностей и связаны с прогрессией, метастазами и резистентностью к терапии [8]. М2-поляризованные опухолевые-ассоциированные макрофаги ассоциированы с плохой прогнозом НКР [9]. Интригующе зафиксированы различия М2 макрофагов в Эпштейн-Барр вирус-отрицательном и Эпштейн-Барр вирус-положительном НКР [10]. Существует исследование, описывающее, что miR-18а ингибирует печеночную метастазацию клеток колоректального рака путем индукции М1 макрофагов [11]. Трансформирующий фактор роста-бета III типа рецептор (TGFBR3) является ко-рецептором TGF-β, обеспечивающим лиганд рецептору II типа TGF-β для стимулирования сигналинга и баланса клеточной поверхности, и растворимый TGFBR3 является регулятором в прогрессии рака [12]. Низко экспрессируемый TGFBR3 сообщается как индуцирующий иммунотолерантную опухолевую микросреду [13]. Напротив, транзиторная экспрессия TGFBR3 индуцирует апоптоз в человеческих клетках НКР [14]. По нашим знаниям, поляризация М2 макрофагов, индуцированная miR-181а, продвигает метастаз опухолевых клеток, посредствованный М2 макрофагами, через ось Kruppel-подобного фактора 6 и CCAAT/энхенсер-связывающего белка α [15].

В совокупности, хотя многие исследования открыли независимую роль miR-18а, TGFBR3 и М2 макрофагов в НКР, их комбинированные взаимодействия среди этих трех факторов остаются неясными. Учитывая, что данное исследование запущено для расшифровки механизмов и участия этих факторов в НКР.

Материалы и методы

Этический заявление

Эксперимент одобрен этического комитетом Третьей Сианьи больницы, Центрального Южного Университета и соответствовал стандартам медицинской этики. Исследование проводили с письменным согласием всех доноров. Эксперименты на животных соответствовали требованиям Национальных правил управления и использования лабораторных животных.

Сбор периферических мононуклеарных клеток

Моноциты получали из периферической крови здоровых доноров адгезивным методом. Образцы периферической крови получали от здоровых доноров Гематологического отделения Третьей Сианьи больницы, Центрального Южного Университета. Моноцито-производные макрофаги получали через пластическую адгезию периферических мононуклеарных клеток (PBMC), предварительно изолированных градиентной центрифугацией по плотности (Ficoll-Paque, GE Healthcare) из буффа-корт препаратов крови здоровых доноров. Затем 2,0 × 10⁶ PBMC культивировали в модифицированной среде Дюльбекко (DMEM) с 10% человеческой сывороткой (Millipore, Bedford, MA, США) и пенициллином/стрептомицином в 12-колодчатых пластинках (NalgeNunc, NY, США). Когда PBMC адгезировали к стенке 2–3 ч, надстановку и взвешенные PBMC удаляли повторно для получения адгерированных моноцитов.

Поляризация макрофагов

Моноциты индуцировали к дифференцировке в макрофаги человеческим фактором стимуляции колоний макрофагов (M-CSF) и поляризовали в М2 макрофаги интерлейкином (IL)-4.

Индукция макрофагов

Моноциты культивировали в 20% ФБС-DMEM и добавляли M-CSF (100 мкг, Peprotech, NJ, США) до конечной концентрации 100 нг/мл. Среду обновляли наполовину каждые 3 дня и дополнительно добавляли 100 нг/мл M-CSF. К 7–8 дню часть клеток собирали, и маркеры поверхности макрофагов CD68 [16], CD163 [17] и CD206 [18] тестировали иммунофлуоресцентным анализом [19] для идентификации макрофагов.

Поляризация макрофага

Макрофаги поляризовывали в М2 макрофаги добавлением 20 нг/мл IL-4 (Peprotech) в дифференциационную среду на еще 24 ч. Часть образцов М2 макрофагов использовали для детектирования потоковой цитометрией. Образцы делили на 3 пробирки: пробирка 1 — та же партия адгерированных макрофагов без стимуляции IL-4; пробирки 2 и 3 — адгерированные макрофаги, стимулированные IL-4. Образцы разбавляли до ~10 000 клеток при загрузке и добавляли неспецифический иммуноглобулин G для блокировки Fc-рецептора. Затем добавляли неспецифический изотипный антител, PE-маркированный CD68 антител и PE-маркированный CD163 антител (оба от Biolegend, CA, США). Инкубировали 30 мин и промывали 0,5% сывороточным альбумином в фосфатно-буферном растворе (PBS), центрифугировали и делали клетковую суспензию с 500 мкл PBS для детектирования.

Обратная транскрипция количественная ПЦР

Обратная транскрипция количественная полимеразная цепная реакция (RT-qPCR) применяли для детектирования экспрессии miR-18а, CCL22, пероксисомного пролифератор-активированного рецептора γ (PPAR-γ) и мРНК TGFBR3 в собранных клетках.

Общий РНК извлекали из клеток тризолом (Invitrogen, Carlsbad, CA, США) и обраттранскрибировали в комплементарную РНК набором Mir-X miRNA First Strand Synthesis Kit (Clontech, Mountain View, CA, США) для miR-18а и набором PrimeScript RT Master Mix Kit (Takara, Dalian, Китай) для CCL22, PPAR-γ и TGFBR3. U6 и глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа (GAPDH) были контрольными нагрузками для miR-18а, CCL22, PPAR-γ и TGFBR3. SYBR Premix Ex Taq II (Perfect Real Time) (Takara) в системе LightCycler 480 II (Roche Diagnostics, Indiana, США) использовали в ПЦР. Расчет данных оценивали методом 2^(-ΔΔCT). ПЦР праймеры представлены в Таблице 1.

Вестерн-блот анализ

Вестерн-блот анализ применяли для детектирования TGFBR3, тотального (t)-Smad1, фосфорилированного (p)-Smad1, t-Smad3 и p-Smad3 белка в собранных клетках.

Общий белок клеток извлекали, а белковая концентрация определяли на основе набора бинхониновой кислоты. Белковый образец загружали в колодки натриевого додецилсульфат-полиакриламидного гель-электрофореза и переносили на поливинилиденфторидную (PVDF) мембрану. PVDF мембрану блокировали обезжиренным молоком и инкубировали с первичными антителами TGFBR3 (1:2000, R&D Systems, Minneapolis, MN, США), t-Smad1 (1:1000), p-Smad1 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology), t-Smad3 (1:1000), p-Smad3 (1:1000) и GAPDH (1:1000, все от Abcam, Cambridge, MA, UK), за чем следовала инкубация с пероксидазой перекиси маркированным вторичным антителом (1:500, Jackson ImmunoResearch Laboratories, PA, США). Промывали 3 раза трис-буферным раствором с Tween 20, мембрану развивали усиленной хемолюминесценцией. Квантование сигналов завершали программным обеспечением National Institutes of Health ImageJ Imaging Processing Analysis Software с нормализацией интенсивности сигнализации к GAPDH.

Клеточная культура и скрининг

Линии клеток человеческого НКР CNE2, TW03, C666-1, SUNE-1 и нормальная человеческая назофарингеальная линия клеток NP96 (Шанхайский институт биологических наук, Китайская академия наук, Шанхай, Китай) культивировали в среде RPMI-1640 (Gibco, CA, США) с ФБС (Gibco), 100 мкг/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина и пассажировали при 80% конфлюенции. RT-qPCR использовали для детектирования экспрессии miR-18а. Среди этих линий клеток НКР, клетки CNE2 и SUNE-1 показывали наибольшую и наименьшую разницу в экспрессии miR-18а от клеток NP96, поэтому их выбрали для assays порегуляции вниз или вверх miR-18а.

Группировка клеток и лечение

Среди всех линий клеток НКР, клетки SUNE-1 с наименьшей разницей от NP96 в экспрессии miR-18а были выбраны. Руководствуясь спецификациями Lipofectamine 2000 (Invitrogen), клетки SUNE-1 трансфицировали мимиками miR-18а, негативным контролем (NC) мимиков miR-18а, si-TGFBR3 или si-TGFBR3 NC.

Среди всех линий клеток НКР, клетки CNE2 с наибольшей разницей от NP96 в экспрессии miR-18а были выбраны и трансфицированы ингибиторами miR-18а, NC ингибиторов miR-18а, экспрессией (OE)-TGFBR3 или OE-TGFBR3 NC с помощью Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

Руководствуясь спецификациями Lipofectamine 2000 (Invitrogen), М2 макрофаги трансфицировали мимиками miR-18а, NC мимиков miR-18а, si-TGFBR3, si-TGFBR3 NC, ингибиторами miR-18а, NC ингибиторов miR-18а, OE-TGFBR3 или OE-TGFBR3 NC.

Ко-культивация М2 макрофагов и клеток НКР

Клеточную ко-культивацию в камере Transwell применяли для изучения эффектов miRNA от М2 макрофага на клетки НКР. Верхняя камера заполняли М2 макрофагом с размером поры 0,4 мкм, который останавливал только клетки верхней камеры от прохождения, но не малые молекулы, секретируемые клетками, такие как везикулы, факторы роста, питательные вещества и т.д. Нижняя камера засевали клетками НКР.

SUNE-1 и CNE2 инкубировали в нормальном ФБС (Gibco). Клетки в логарифмической фазе роста использовали для экспериментов.

SUNE-1 и CNE2 клетки ко-культивировали с М2 макрофагами в 10% ФБС-RPMI-1640 среде (оба от Gibco) в блюдце для ко-культивации Transwell (Coring, Corning, NY, США) с размером поры 0,4 мкм.

SUNE-1 клетки не ко-культивировали с М2 макрофагами, или ко-культивировали с М2 макрофагами, мимиками miR-18а-трансфицированными М2 макрофагами, NC мимиков miR-18а-трансфицированными М2 макрофагами, si-TGFBR3-трансфицированными М2 макрофагами или si-TGFBR3 NC-трансфицированными М2 макрофагами.

CNE2 клетки не ко-культивировали с М2 макрофагами, или ко-культивировали с М2 макрофагами, ингибиторами miR-18а-трансфицированными М2 макрофагами, NC ингибиторов miR-18а-трансфицированными М2 макрофагами, OE-TGFBR3-трансфицированными М2 макрофагами или OE-TGFBR3 NC-трансфицированными М2 макрофагами.

MTT анализ

Жизнеспособность клеток тестировали 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиевым бромидом (MTT) анализом, который был колориметрическим анализом для определения активности митохондриальной дегидрогеназы, восстанавливающей MTT в формазан.

Трипсинизированные и засеянные в 96-колодчатых пластинках по 4 × 10⁴ клеток/колодку, клетки лишали культурной среды на 0, 12, 24, 36 и 48 ч соответственно и добавляли MTT раствор (500 мкл, 0,5 г/л). Инкубировали 4 ч, надстановку удаляли и инкубировали клетки с 200 мкл раствора диметилсульфоксида. Оптическую плотность (OD, 490 нм) измеряли на микропластинчатом считывателе (ELX808IU, BioTek, VT, США). Каждую группу устанавливали с 6 параллельными колодками.

Колониобразовательный анализ

Колониобразовательная способность клеток НКР тестировали колониобразовательным анализом, отражающим клеткопопуляционную зависимость и клональную пролиферацию.

Культивировали 24 ч и отсоединяли 0,25% трипсином, 300 клеток посевали в 35-мм блюдце с 3 параллельными колодками в каждой группе. С обновлением среды каждые 3 дня клетки культивировали неделю и фиксировали 5 мл 4% параформальдегидом. После этого клетки окрашивали кристаллическим фиолетовым раствором и сушили на воздухе. Блюдце переворачивали, на котором накладывали прозрачную пленку с сеткой, и считали число колоний (более 50 клеток) под микроскопом (Olympus, Токио, Япония).

Царапинный тест

Миграцию клеток тестировали царапинным тестом. Клетки трипсинизировали, засеяли в 6-колодчатые пластинки с 3 параллельными колодками для каждой группы и культивировали до 90% конфлюенции. Затем клетки инкубировали в среде с 2% ФБС и вертикальные царапины наносили 100-мкл пипеткой. Клетки фотографировали на 0 и 24 ч под инвертированным микроскопом для измерения дистанции миграции клеток.

Transwell анализ

Инвазию и миграцию клеток тестировали Transwell анализом. Верхняя камера Transwell камеры предварительно мачивали и добавляли 100 мкл Matrigel (Coring), разбавленного сывороточно-свободной средой RPMI 1640 в соотношении 1:100. Верхняя и нижняя камеры добавляли 200 мкл и 600 мкл сывороточно-свободной среды RPMI 1640 соответственно. Затем нижнюю камеру добавляли 600 мкл среды RPMI 1640 с 10% ФБС, а верхнюю — 200 мкл клетковой суспензии (12,5 × 10⁴ клеток/мл). Инкубировали 40 ч, клетки окрашивали кристаллическим фиолетовым раствором и вытирали ватным тампоном для подсчета клеток, прошедших через Matrigel под микроскопом.

Потоковая цитометрия

Апоптоз клеток и распределение клеточного цикла определяли потоковой цитометрией.

Распределение клеточного цикла оценивали пропидиевым йодидом (PI) окрашиванием. Клетки засеяли в 6-колодчатые пластинки по 4 × 10⁵ клеток/колодку и культивировали до 70–80% конфлюенции. Фиксировали в предохлажденном 70% этаноле на ночь, клетки центрифугировали (надстановку удаляли), добавляли РНКазу (1 г/л, 200 мкл) и Тритон X-100 (2 мкл), и окрашивали PI раствором 30 мин. После этого распределение клеточного цикла детектировали потоковым цитометром (BD Bioscience, NJ, США) при 488 нм согласно различной клетковой флуоресценции на каждой фазе (G0/G1 фаза, S фаза и G2/M фаза).

Апоптоз клеток измеряли двойным окрашиванием Annexin V-флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) и PI. Клетки ресуспендировали в 500 мкл Binding буфера и окрашивали 5 мкл Annexin V-FITC раствором и 10 мкл PI раствором. Апоптоз также тестировали потоковым цитометром (BD Bioscience) в течение 30 мин без воздействия света. На диаграмме рассеяния живые клетки в левом нижнем квадранте (Q4) были FITC⁻/PI⁻, апоптотические клетки ранней стадии в правом нижнем квадранте (Q3) — FITC⁺/PI⁻, некротические и апоптотические поздней стадии в правом верхнем квадранте (Q2) — FITC⁺/PI⁺. Скорость апоптоза = процент ранней апоптоза (Q3) + процент поздней апоптоза (Q2).

Ксенотрансплантация опухоли у голых мышей

Рост опухоли наблюдали созданием модели НКР у голых мышей. Отсоединенные 0,25% трипсином клетки SUNE-1 и CNE2 в логарифмической фазе конфигурировали в одноклеточную суспензию 5 × 10⁷ клеток/мл. Клеточную суспензию (0,2 мл) инъецировали в правое подмышко мышей микроинъектором для создания моделей мышей. Моделированные мыши содержали в специфически патоген-свободной среде. Начиная с 4-го дня рост опухоли наблюдали и взвешивали мышей каждые 4 дня. Голух мышей эвтаназировали на 20-й день после инъекции и опухоли ресектировали, взвешивали электронными весами и фотографировали.

Двойной люциферазный репортер-генный анализ

Систему двойного люциферазного репортер-гена применяли для подтверждения связывающих сайтов miR-18а и 3'нетранслируемой области (UTR) мРНК TGFBR3. Биологический предиктивный веб-сайт (https://www.microrna.org/microrna/home.do) использовали для анализа целевого гена miR-18а и обнаружения существования комплементарного связывающего сайта miR-18а на 3'UTR TGFBR3. Двойной люциферазный репортер-генный анализ применяли для дополнительной верификации, является ли TGFBR3 прямой мишенью miR-18а. Конструировали pmirGLO-TGFBR3-дикий тип (WT) и pmirGLO-TGFBR3-мутантный тип (MUT) связывающего сайта TGFBR3 3'UTR. TGFBR3-WT или TGFBR3-MUT и мимики miR-18а или NC мимиков ко-трансфицировали в клетки SUNE-1 и CNE2 Lipofectamine 2000 (Invitrogen) и инкубировали 48 ч. Набор люциферазного анализа (Promega, Madison, WI, США) использовали для анализа клеток.

Статистический анализ

Статистическое программное обеспечение SPSS21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, США) использовали для анализа. Данные выражали как среднее ± стандартное отклонение. Различия между двумя группами анализировали t-тестом, а различия среди множественных групп — однофакторным дисперсионным анализом (ANOVA), за которым следовал пост-хок тест Тьюки. Значимая разница считалась при P < 0,05.

Результаты

Идентификация М2 макрофагов

Моноциты, обогащенные адгезивным методом и индуцированные M-CSF, собирали из периферической крови здоровых доноров. Иммунофлуоресцентное детектирование CD68, CD206 и CD163 подтвердило, что PBMC, индуцированные M-CSF in vitro, превратились в макрофаги с типичными молекулярными характеристиками, отвечающими нашим требованиям (рис. 1a).

Полученные макрофаги поляризовывали IL-4 и наблюдали под микроскопом по морфологии. Проявлялось, что макрофаги (M0) без стимуляции IL-4 были разнообразными и неправильными, показывая круглую, овальную или веретенообразную форму. Стимулированные IL-4, М2 макрофаги становились крупнее и преимущественно приобретали круглую форму, что соответствовало морфологическим характеристикам М2 макрофагов, описанным ранее [20] (рис. 1b).

Потоковая цитометрия тестировала поверхностные антигены адгерированных клеток, стимулированных 20 нг/мл IL-4 в течение 24 ч, и обнаружила, что CD68 экспрессировала при 21,16%, а CD163 — при 98,69% от общего числа клеток (рис. 1c), подтверждая адгерированные клетки как М2 макрофаги. RT-qPCR показало, что по сравнению с M0 клетками, CCL22 и PPAR-γ (типичные поляризующие молекулы) увеличивались в М2 макрофагах (рис. 1d, e), указывая на успешную индукцию М2 макрофагов.

RT-qPCR также проявил, что экспрессия miR-18а увеличивалась в М2 макрофагах в противовес M0 макрофагам (P < 0,05) (рис. 1f).

MiR-18а высоко экспрессирована, а TGFBR3 слабо экспрессирована в клетках НКР

Биоинформатический веб-сайт (miRanda) предсказал потенциальные мишени miR-18а, и TGFBR3 считался одной мишенью miR-18а (рис. 2a). Двойной люциферазный репортер-генный анализ реализовывали для верификации, что miR-18а таргетирует 3'UTR TGFBR3. TGFBR3-WT или TGFBR3-MUT клонировали в вектор pmirGLO и ко-трансфицировали с мимиками miR-18а или NC в клетки SUNE-1 и CNE2. Мимики miR-18а не влияли на люциферазную активность TGFBR3 3'UTR-MUT, но ухудшали активность TGFBR3 3'UTR-WT в клетках SUNE-1 и CNE2, предполагая, что TGFBR3 был целевым геном, регулируемым miR-18а (рис. 2b).

Трансфекционная эффективность мимиков miR-18а или ингибиторов miR-18а в М2 макрофагах проявлялась определением экспрессии miR-18а и TGFBR3 в М2 макрофагах RT-qPCR и вестерн-блот анализом. Было очевидно (рис. 2c, d), что экспрессия miR-18а повышала экспрессию miR-18а и снижала экспрессию TGFBR3 в М2 макрофагах. Напротив, ингибирование miR-18а снижало экспрессию miR-18а и повышало экспрессию TGFBR в М2 макрофагах. Разницы не наблюдали в экспрессии miR-18а, в то время как экспрессия TGFBR3 снижалась, когда М2 макрофаги трансфицировали si-TGFBR3. Разницы не наблюдали в экспрессии miR-18а, в то время как экспрессия TGFBR3 росла при OE-TGFBR3 трансфекции в М2 макрофаги.

Экспрессия miR-18а и TGFBR3 в линиях клеток CNE2, TW03, C666-1, SUNE-1 и NP96 тестировали RT-qPCR и вестерн-блот анализом. В клетках НКР, по сравнению с клетками NP96, экспрессия miR-18а увеличивалась, а экспрессия TGFBR3 снижалась (рис. 2e). Из-за того, что клетки CNE2 и SUNE-1 проявили наибольшую и наименьшую разницу в экспрессии miR-18а от клеток NP96, их выбрали для дальнейших assays порегуляции вниз и вверх miRNA.

Для идентификации эффектов miR-18а и TGFBR3 на клетки НКР, клетки SUNE-1 трансфицировали мимиками miR-18а или si-TGFBR3, а клетки CNE2 — ингибиторами miR-18а или OE-TGFBR3. RT-qPCR и вестерн-блот анализ демонстрировали, что мимики miR-18а повышали экспрессию miR-18а и снижали экспрессию TGFBR3 в клетках SUNE-1. Трансфекция si-TGFBR3 не влияла на экспрессию miR-18а, в то время как снижала экспрессию TGFBR3 в клетках SUNE-1. Ингибиторы miR-18а снижали экспрессию miR-18а и повышали экспрессию TGFBR3 в клетках CNE2. OE-TGFBR3 трансфекция в клетках CNE2 не влияла на экспрессию miR-18а, но повышала экспрессию TGFBR3 (рис. 2f, g).

Для изучения эффектов miR-18а от М2 макрофагов на клетки НКР, мимики miR-18а- или si-TGFBR3-трансфицированные М2 макрофаги или ингибиторы miR-18а- или OE-TGFBR3-трансфицированные М2 макрофаги ко-культивировали с клетками SUNE-1 или CNE2 в камере Transwell соответственно. RT-qPCR и вестерн-блот анализ тестировали экспрессию miR-18а и TGFBR3 в клетках SUNE-1 или CNE2. Клетки SUNE-1, ко-культивированные с нетрансфицированными или мимиками miR-18а-трансфицированными М2 макрофагами, демонстрировали повышенную экспрессию miR-18а и деградированную экспрессию TGFBR3. Разницы не замечали в экспрессии miR-18а, а экспрессия TGFBR3 снижалась в клетках SUNE-1, ко-культивированных с si-TGFBR3-трансфицированными М2 макрофагами (рис. 2h). После ко-культивации с нетрансфицированными М2 макрофагами, клетки CNE2 характеризовались повышенной экспрессией miR-18а и сниженной экспрессией TGFBR3. Однако сниженная экспрессия miR-18а и повышенная экспрессия TGFBR3 проявлялись в клетках CNE2, которые заранее ко-культивировали с ингибиторами miR-18а-трансфицированными М2 макрофагами. Разницы не признавали в экспрессии miR-18а, а экспрессия TGFBR3 повышалась в клетках CNE2, ко-культивированных с OE-TGFBR3-трансфицированными М2 макрофагами (рис. 2i).

MiR-18а от М2 макрофагов стимулирует жизнеспособность и колониобразовательную способность клеток НКР

MTT анализ и колониобразовательный анализ применяли для идентификации влияний miR-18а и TGFBR3 на жизнеспособность и колониобразовательную способность клеток SUNE-1 и CNE2. Мимики miR-18а, ингибиторы miR-18а, si-TGFBR3 или OE-TGFBR3 трансфицировали в клетки SUNE-1 или CNE2. Показало, что в клетках SUNE-1, регуляция вверх miR-18а или регуляция вниз TGFBR3 повышала жизнеспособность клеток и увеличивала число колоний (рис. 3a, e). В клетках CNE2, жизнеспособность клеток нарушалась, а число колоний снижалось ингибированием miR-18а или экспрессией TGFBR3 (рис. 3b, f).

Для изучения эффектов miR-18а от М2 макрофага на жизнеспособность и колониобразовательную способность клеток НКР, мимики miR-18а-, ингибиторы miR-18а-, si-TGFBR3- или OE-TGFBR3-трансфицированные М2 макрофаги ко-культивировали с клетками SUNE-1 или CNE2 в камере Transwell. MTT и колониобразовательный анализ показали, что клетки SUNE-1, ко-культивированные с нетрансфицированными, или мимиками miR-18а-трансфицированными или si-TGFBR3-трансфицированными М2 макрофагами, проявляли усиленную жизнеспособность клеток и увеличенное число колоний (рис. 3c, g).

Клетки CNE2, ко-культивированные с нетрансфицированными М2 макрофагами, выделялись усиленной жизнеспособностью и увеличенными колониями. Однако клетки CNE2, ко-культивированные либо с ингибиторами miR-18а-трансфицированными или OE-TGFBR-трансфицированными М2 макрофагами, проявляли уменьшенную жизнеспособность и сниженные колонии (рис. 3d, h).

MiR-18а от М2 макрофагов стимулирует инвазивную и миграционную способности клеток НКР

Для лучшего понимания того, как miR-18а и TGFBR3 влияли на миграцию и инвазию клеток НКР, реализовывали царапинный тест и Transwell анализ. Результаты раскрыли, что клетки SUNE-1, трансфицированные мимиками miR-18а или si-TGFBR3, характеризовались увеличенной дистанцией миграции клеток и инвазивными клетками (рис. 4a и 5a).

В клетках CNE2, трансфицированных ингибиторами miR-18а или OE-TGFBR3, наблюдались снижения в дистанции миграции клеток и инвазивных клетках (рис. 4b и 5b).

Как miR-18а от М2 макрофагов влияла на инвазивную и миграционную способности клеток НКР, расшифровывали путем ко-культивации мимики miR-18а-, ингибиторы miR-18а-, si-TGFBR3- или OE-TGFBR3-трансфицированных М2 макрофагов с клетками SUNE-1 или CNE2. Результаты подсвечивали, что клетки SUNE-1, ко-культивированные с нетрансфицированными, или мимиками miR-18а-трансфицированными или si-TGFBR3-трансфицированными М2 макрофагами, проявляли увеличенную дистанцию миграции клеток и инвазивные клетки (рис. 4c и 5c).

Обе дистанция миграции и инвазивные клетки увеличивались в клетках CNE2, ко-культивированных с нетрансфицированными М2 макрофагами. При ко-культивации с ингибиторами miR-18а-трансфицированными или OE-TGFBR3-трансфицированными М2 макрофагами, клетки CNE2 показывали сниженную дистанцию миграции и инвазивные клетки (рис. 4d и 5d).

MiR-18а от М2 макрофагов задерживает меньше клеток НКР в G0/G1 фазе и подавляет апоптоз

Распределение клеточного цикла и апоптоз тестировали потоковой цитометрией для стратификации эффектов miR-18а и TGFBR3 на клетки НКР. Показало, что трансфекция мимиков miR-18а или si-TGFBR3 снижала клетки SUNE-1, задержанные в G0/G1 фазе, увеличивала клетки в S и G2/M фазах и снижала скорость апоптоза клеток (рис. 6a и 7a).

При трансфекции ингибиторами miR-18а или OE-TGFBR3, клетки CNE2 в G0/G1 фазе стремились к повышению, а в S и G2/M фазах — к снижению, и скорость апоптоза повышалась (рис. 6b и 7b).

С целью декодирования механизма miR-18а от М2 макрофагов в распределении клеточного цикла и апоптозе клеток НКР, М2 макрофаги, трансфицированные мимиками miR-18а, ингибиторами miR-18а, si-TGFBR3 или OE-TGFBR3, ко-культивировали с клетками SUNE-1 или CNE2 в камере Transwell. Ко-культивированные с нетрансфицированными, или мимиками miR-18а-трансфицированными или si-TGFBR3-трансфицированными М2 макрофагами, сниженные клетки SUNE-1 отображались в G0/G1 фазе и увеличенные клетки в S и G2/M фазах, и скорость апоптоза клеток SUNE-1 снижалась (рис. 6c и 7c).

Ко-культивированные с нетрансфицированными М2 макрофагами, клетки CNE2 в G0/G1 фазе снижались, клетки в S и G2/M фазах увеличивались, и скорость апоптоза снижалась. Напротив, ко-культивированные с ингибиторами miR-18а-трансфицированными или OE-TGFBR3-трансфицированными М2 макрофагами, клетки CNE2 в G0/G1 фазе повышались, а в S и G2/M фазах снижались, и скорость апоптоза повышалась (рис. 6d и 7d).

MiR-18а от М2 макрофагов снижает p-Smad1/t-Smad1 и повышает p-Smad3/t-Smad3 в клетках НКР

Вестерн-блот анализ детектировал белки TGF сигнального пути в клетках НКР для дальнейшего объяснения эффектов miR-18а и TGFBR3 на TGF сигнальный путь.

Объясняли, что трансфекция мимиков miR-18а или si-TGFBR3 снижала p-Smad1/t-Smad1 и повышала p-Smad3/t-Smad3 в клетках SUNE-1 (рис. 8a).

Трансфекция ингибиторами miR-18а или OE-TGFBR3 приводила к снижению p-Smad3/t-Smad3 и повышению p-Smad1/t-Smad1 в клетках CNE2 (рис. 8b).

Влияние miR-18а от М2 макрофагов на TGF сигнальный путь в клетках НКР определяли вестерн-блот анализом через тестирование белков TGF сигнального пути в клетках SUNE-1 и CNE2, ко-культивированных с мимиками miR-18а-, ингибиторами miR-18а-, si-TGFBR3- или OE-TGFBR3-трансфицированными М2 макрофагами в камере Transwell.

Клетки SUNE-1, ко-культивированные с нетрансфицированными, мимиками miR-18а-трансфицированными или si-TGFBR3-трансфицированными М2 макрофагами, проявляли сниженное p-Smad1/t-Smad1 и инкрементальное p-Smad3/t-Smad3 (рис. 8c).

Ко-культивированные с нетрансфицированными М2 макрофагами, клетки CNE2 стремились к снижению p-Smad1/t-Smad1 и повышению p-Smad3/t-Smad3. Напротив, клетки CNE2 демонстрировали повышенное p-Smad1/t-Smad1 и сниженное p-Smad3/t-Smad3 при ко-культивации с ингибиторами miR-18а-трансфицированными или OE-TGFBR3-трансфицированными М2 макрофагами (рис. 8d).

MiR-18а от М2 макрофагов индуцирует рост опухоли у голых мышей с НКР

Ксенотрансплантация опухоли проводили на голых мышах для дальнейшего разъяснения влияний miR-18а и TGFBR3 на рост опухоли НКР.

Показало, что инъецированные мимиками miR-18а-трансфицированными или si-TGFBR3-трансфицированными клетками SUNE-1, мыши проявляли увеличенный объем опухоли и более тяжелый вес опухоли (рис. 9a).

Сниженный объем и вес опухоли проявлялись у мышей с инъекцией ингибиторами miR-18а-трансфицированными или OE-TGFBR3-трансфицированными клетками CNE2 (рис. 9b).

Рост опухоли наблюдали у мышей, инъецированных мимиками miR-18а-, ингибиторами miR-18а-, si-TGFBR3- или OE-TGFBR3-трансфицированными М2 макрофагами для иллюстрации механизма miR-18а от М2 макрофагов в НКР.

После ко-культивации с нетрансфицированными, мимиками miR-18а-трансфицированными или si-TGFBR3-трансфицированными М2 макрофагами, клетки SUNE-1 инъецировали в мышей и мыши наблюдали с большим объемом опухоли и более тяжелым весом (рис. 9c).

Клетки CNE2 ко-культивировали с М2 макрофагами и инъецировали в мышей с результатами, предполагающими растущий объем и вес опухоли. И объем, и вес опухоли склонялись к снижению, когда мышей инъецировали клетками CNE2, ко-культивированными с ингибиторами miR-18а-трансфицированными или OE-TGFBR3-трансфицированными М2 макрофагами (рис. 9d).

Обсуждение

НКР относится к полигеническому заболеванию, угрожаемому широким спектром факторов [21]. miRNA ранее подразумевались как участвующие в патогенезе НКР через регуляцию их целевых генов, которые являются индикаторами клеточных процессов и путей [22]. Конкретно, miR-18а продвигает прогрессию НКР через нарушение биогенеза miRNA [6]. Учитывая, что данное исследование идет вперед для расшифровки комбинированных взаимодействий miR-18а от М2 макрофагов и TGFBR3 в НКР с заключением, разъясняющим, что miR-18а от М2 макрофагов стимулирует прогрессию НКР через ингибирование TGFBR3 (рис. 10).

В начале исследования макрофаги стимулируют IL-4 для дифференцировки в М2 макрофаги, которые находятся обогащенными экспрессией miR-18а. Как известно, во время поляризации макрофагов экспрессия miRNA изменялась [23]. Кроме того, М2 поляризация обогащает гены, вовлеченные в клеточный цикл и метаболические процессы, и М2 фенотип благоприятен росту опухоли и ангиогенезу в неопластических тканях [24]. Основываясь на М2 макрофагах-обогащенных miR-18а, серию экспериментов успешно проводили.

Изначально наше исследование раскрыло, что miR-18а высоко экспрессирована, в то время как TGFBR3 слабо экспрессирована в клетках НКР. Из предыдущего исследования заключают, что miR-18а переэкспрессирована в тканях НКР с ее ассоциацией с метастазами лимфатических узлов и клинической стадией [5]. Кроме того, члены кластера miR-17-92 включая miR-18а документированы как переэкспрессированные в тканях НКР [25]. Более того, повышенная miR-18а сообщается как демонстрируемая в тканях НКР, связанная с стадией метастазов лимфатических узлов и размером опухоли [4]. Экспериментально, кроме регуляции вниз TGFBR3 в плоскоклеточном карциноме языка [26], было еще исследование, изображающее сниженный TGFBR3 в светлоклеточном почечном карциноме, сопровождаемое нежелательной прогнозом [27]. В любом случае, результаты в данном исследовании согласуются с этими находками в некоторой степени.

Для изучения ролей miR-18а и TGFBR3 в прогрессии клеток НКР, мы провели серию assays с результатами, указывающими, что регуляция вверх miR-18а или регуляция вниз TGFBR3 запускает прогрессию клеток НКР, в то время как репрессия miR-18а или экспрессия TGFBR3 имеет противоположные эффекты на клетки НКР. Широко, подавление miR-18а доказано как препятствующее прогрессии клеток в злокачественностях, включая яичковый рак, колит-ассоциированный колоректальный рак и гепатоцеллюлярный карцинома [28,29,30]. Узко, существовавшее исследование произнесло, что повышенная miR-18а продвигает прогрессию клеток НКР через медиацию DICER1 [6]. Дополнительно заметили, что переэкспрессированная miR-18а в НКР считается связанной с метастазами НКР и репрессированная miR-18а частично способствует лучшей прогнозе пациентов НКР [31]. Недавно обследовали, что регуляция вниз miR-18а способна неблагоприятствовать пролиферации, инвазии и миграции НКР [4]. Дополнительно, снижение экспрессии TGFBR3 считается связанным с инвазией плоскоклеточного карциномы гортани (LSCC) и ось miR-223/TGFBR3 участвует в ингибиции прогрессии LSCC [32]. Экспрессия TGFBR3 документирована как ограничивающая жизнеспособность клеток НКР, индуцирующая апоптоз и активирующая про-апоптотические сигнальные пути [14]. Ранее исследование указывало, что регуляция вверх TGFBR3 продвигает апоптоз и клетки, задержанные в G2/M фазе, приводя к нарушению жизнеспособности и миграции в слизистой железистой кисточной карциноме [33]. Интригующе, ранее описывали, что индукция TGFBR3 способствует нарушению внутрипеченочной холангиокарциномы прогрессии [34].

Несмотря на защитную роль низко экспрессированной miR-18а и экспрессированной TGFBR3 в клетках НКР in vitro, мы выполнили ксенотрансплантацию опухоли у голых мышей in vivo для дальнейшей верификации с результатами, объясняющими, что нокаут miR-18а или экспрессия TGFBR3 сдерживает рост опухоли у голых мышей. Как демонстрировало в предыдущем исследовании, miR-18а-инъецированные голые мыши показывали усиленный рост опухоли [5], и наоборот, miR-18а антагомир-инъецированные голые мыши отображали подавленный рост опухоли в НКР [4]. В свете снижения TGFBR3 в росте опухоли, предполагают, что слабо экспрессированный TGFBR3 провоцирует формирование опухоли в светлоклеточном почечном карциноме [27]. Напротив, увеличение TGFBR3 признается как препятствующее росту опухоли в легком раке при присутствии длинной некодирующей РНК ADAM металлопептидазы с тромбоспондиновым типом 1 мотивом, 9 антисенс РНК 2 экспрессии и подавления miR-223-3p [35]. Данное исследование также предсказало и верифицировало, что TGFBR3 является целевым геном miR-18а. Но больше исследований все еще нужно для дальнейшей верификации.

Заключение

Вообще говоря, данное исследование разъясняет конкретные механизмы, что miR-18а от М2 макрофагов ингибирует экспрессию TGFBR3 для усугубления прогрессии НКР через TGF-β сигнальный путь, результаты которых аннулируются нокаутом miR-18а или экспрессией TGFBR3. Это исследование обновляет терапевтическую мишень для НКР. Однако крупные когортные исследования все еще нужны для глубоких изучений.