Блокировка оси miR-342-5p/Wnt3a стабилизирует атеросклеротические бляшки и подавляет ангиогенез у мышей ApoE−/−

Аннотация

МикроРНК-342-5p (miR-342-5p) связана с атеросклерозом (АС), однако её механистическая роль оставалась неясной. В данном исследовании мы изучили, как miR-342-5p регулирует сигнальный путь Wnt3a и влияет на уязвимость бляшек и неоваскуляризацию в модели АС на мышах ApoE−/−. 24-недельных самцов ApoE−/− кормили высокожирной диетой 16 недель для индукции уязвимых бляшек. Экспрессия miR-342-5p и Wnt3a количественно определили методом РТ-ПЦР в реальном времени и вестерн-блоттингом. Функциональные эффекты ингибирования miR-342-5p (антагомиром) и сверхэкспрессии Wnt3a (вектор oe-Wnt3a) оценивали по уровню липидов сыворотки, воспалительным и оксидативным цитокинам, морфологии бляшек и плотности микрососудов (МВД).

Результаты показали, что miR-342-5p урегулирована, а Wnt3a и β-катенин — даунрегулированы в аортах при АС, при этом miR-342-5p напрямую целевую 3'-UTR Wnt3a. Антагонизация miR-342-5p или сверхэкспрессия Wnt3a снизили общий холестерин, триглицериды, ЛПНП и проинflammаторные цитокины (IL-5, IL-12p70, IFN-γ, TNF-α), повысили ЛПВП и активность СОД, уменьшили площадь липидного ядра, увеличили коллагеновое содержимое, снизили макрофагную инфильтрацию и МВД. Напротив, сверхэкспрессия miR-342-5p ухудшала все эти параметры. Таким образом, miR-342-5p способствует нестабильности бляшек и ангиогенезу, подавляя Wnt3a; восстановление Wnt3a устраняет эти эффекты, что указывает на терапевтическую мишень для АС.

Введение

Атеросклероз (АС) остается ведущей причиной сердечно-сосудистой заболеваемости и смертности во всем мире. Дестабилизация бляшки — характеризующаяся липидными некротическими ядрами, тонкими фиброзными капсулами, макрофагной инфильтрацией и снижением коллагена — ведет к разрыву и острым событиям. Хотя липидснижающая терапия улучшила исходы, многие пациенты продолжают переносить сердечно-сосудистые события, что подчеркивает необходимость новых молекулярных интервенций.

МикроРНК (miRNA) — короткие некодирующие РНК, посттранскрипционно регулирующие множество генов-мишеней. miR-342-5p, локализованная в кластере miRNA 14q32, сообщалось, что влияет на ангиогенез через пути TGF-β и VEGF и модулирует воспалительные ответы в сосудистых заболеваниях. Однако её специфическая роль в АС и взаимодействие с ключевыми сигнальными каскадами остаются не полностью определенными.

Путь Wnt/β-катенин критичен для гомеостаза сосудистых клеток, влияя на пролиферацию гладкомышечных клеток, эндотелиальную целостность и состав бляшки. Предыдущие работы показывали, что miR-342-5p негативно регулирует Wnt3a в других контекстах заболеваний, предполагая потенциальную регуляторную ось в АС.

Здесь мы разъясняем взаимодействие miR-342-5p/Wnt3a в АС и оцениваем его влияние на стабильность бляшки и ангиогенез у мышей ApoE−/−.

Материалы и методы

Животные и этика

Самцы мышей ApoE−/− и C57BL/6J (8 недель) содержали при цикле 12 ч свет/12 ч темнота и получали стандартный корм или высокожирную диету (20% жира, 0,25% холестерина) в течение 16 недель. Все процедуры соответствовали рекомендациям NIH и были одобрены Комитетом по уходу и использованию лабораторных животныхбольницы провинции Цинхай (этический номер 201870726).

Экспериментальный дизайн

Мышей ApoE−/− случайно распределили на шесть групп (n = 12 каждая): АС, НК (физраствор), miR-342-5p агомир, miR-342-5p антагомир, oe-Wnt3a и miR-342-5p агомир + oe-Wnt3a. Лечение (40 мг/кг, в хвостовую вену) проводили дважды в неделю в течение 8 недель. Мыши C57BL/6J служили нормальными контролями.

Биохимические анализы

В сыворотке определяли общий холестерин (ОХ), триглицериды (ТГ), ЛПНП, ЛПВП, малоновый диальдегид (МДА) и супероксиддисмутазу (СОД) коммерческими наборами (NanJing JianCheng Bioengineering Institute). Цитокины (IL-5, IL-12p70, IFN-γ, TNF-α) измеряли методом ЭЛИСА (MultiSciences).

Обработка тканей

После 12-часового голодания животных эвтаназировали; аорты извлекали, промывали безРНКазной ПБС и делили на части для гистологии (ГЭ, масло-красное О, сириус-красное) или молекулярных анализов (РТ-ПЦР, вестерн-блоттинг). Образцы для гистологии парафинировали, делали срезы (4 мкм) и окрашивали по стандартным протоколам.

Анализ экспрессии генов и белков

РТ-ПЦР в реальном времени количественно определяли miR-342-5p, Wnt3a, β-катенин и референс-гены (U6, β-актин) методом 2^−ΔΔCt. Вестерн-блоттинг оценивали Wnt3a, β-катенин, CD34, α-СМА и β-актин с денситометрией ImageJ.

Иммуногистохимия

Срезы окрашивали антителами к MOMA-2 (макрофаги), α-СМА (гладкомышечные клетки) и CD34 (эндотелиальные клетки). Интенсивность окраски количественно определяли в Image Pro Plus 6.0, индекс уязвимости бляшки рассчитывали как (макрофаги + липиды %) / (гладкомышечные клетки + коллаген %). МВД определяли подсчетом CD34⁺ микрососудов/мм².

Люциферазный репортерный тест

3'-UTR Wnt3a (дикий тип и мутант) клонировали в GP-miRGLO. Эндтелиальные клетки аорты мышей ко-трансфектировали с репортером и различными концентрациями агомира miR-342-5p; активность люциферазы измеряли через 48 ч.

Статистический анализ

Данные представлены как среднее ± СД. Для сравнения двух групп использовали непарный t-критерий; для множественных групп — однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с пост-хок тестом Тьюки. Значимость устанавливали при *p* < 0,05.

Результаты

miR-342-5p урегулирована, а Wnt3a даунрегулирована в аортах при АС

РТ-ПЦР показал значительное увеличение miR-342-5p (≈3,5-кратное, *p* < 0,01) и одновременное снижение Wnt3a (≈0,4-кратное, *p* < 0,01) у мышей с АС по сравнению с нормальными. Вестерн-блоттинг подтвердил снижение уровней белков Wnt3a и β-катенина. Люциферазные тесты продемонстрировали, что miR-342-5p напрямую связывается с 3'-UTR Wnt3a, снижая активность репортера до 64% при 100 пМ, эффект устранялся мутацией сайта связывания.

Антагомир miR-342-5p или сверхэкспрессия Wnt3a улучшают липидный профиль

Антагомир miR-342-5p и oe-Wnt3a значительно снизили ОХ, ТГ и ЛПНП (≈30–40% снижение, *p* < 0,01) и повысили ЛПВП (≈20% увеличение, *p* < 0,05) относительно групп АС и НК. Агомир miR-342-5p ухудшал дислипидемию. Сверхэкспрессия Wnt3a спасала неблагоприятные эффекты сверхэкспрессии miR-342-5p.

Ингибирование miR-342-5p подавляет маркеры воспаления и оксидативного стресса

У мышей с АС в сыворотке были повышены IL-5, IL-12p70, IFN-γ, TNF-α и МДА (*p* < 0,01). Антагомир miR-342-5p или oe-Wnt3a снизили эти цитокины и МДА на ~40% и увеличили активность СОД на ~35% (*p* < 0,01). Агомир miR-342-5p дальнейший усиливал воспалительные и оксидативные маркеры.

Морфология бляшки улучшается при ингибировании miR-342-5p или сверхэкспрессии Wnt3a

ГЭ-окраска показала, что в группах с антагомиром miR-342-5p и oe-Wnt3a площадь бляшек была меньше, фиброзные капсулы толще, липидные ядра меньше, коллагеновое содержимое (сириус-красное) выше по сравнению с группами АС и НК (*p* < 0,01). Количественный анализ масло-красного О подтвердил ~30% снижение липидного содержимого в лечимых группах. Индекс уязвимости бляшки снизился на 45% в группах с антагомиром и oe-Wnt3a, тогда как агомир miR-342-5p увеличил его на 60% (*p* < 0,01).

Макрофагное накопление и наличие гладкомышечных клеток модулируются

Иммуногистохимия показала, что антагомир miR-342-5p и oe-Wnt3a снизили процент MOMA-2⁺ макрофагов на ~50% и увеличили α-СМА⁺ гладкомышечные клетки на ~30% относительно групп АС и НК (*p* < 0,01). Комбинированное лечение (агомир miR-342-5p + oe-Wnt3a) восстановило уровни макрофагов и гладкомышечных клеток к базовым.

Ангиогенез аттенуируется при воздействии на ось miR-342-5p/Wnt3a

Иммуногистохимия по CD34 и вестерн-блоттинг продемонстрировали, что антагомир miR-342-5p и oe-Wnt3a снизили МВД на ~55% по сравнению с мышами АС (*p* < 0,01). Агомир miR-342-5p увеличил МВД на ~70% (*p* < 0,01). Комбинированное лечение умеренно модулировало ангиогенез.

Обсуждение

Наши данные раскрывают ранее нехарактеризованную ось miR-342-5p/Wnt3a, управляющую липидным обменом, воспалением, оксидативным стрессом, составом бляшки и неоваскуляризацией при атеросклерозе. Урегуляция miR-342-5p в аортах при АС напрямую подавляет Wnt3a, тем самым ослабляя сигнальный путь β-катенина и способствуя фенотипу уязвимой бляшки. Напротив, ингибирование miR-342-5p или восстановление Wnt3a восстанавливают защитные липидные профили, снижают проинflammаторные цитокины, усиливают антиоксидантную защиту, стабилизируют архитектуру бляшки и подавляют патологический ангиогенез.

Эти результаты согласуются с сообщениями об участии miR-342-5p в активации макрофагов и воспалении, а также с установленной ролью Wnt-сигналинга в сосудистой биологии. Терапевтический потенциал модуляции этой оси подчеркивается надежным обращением признаков АС in vivo.

Заключение

Это исследование впервые демонстрирует, что miR-342-5p способствует уязвимости бляшек и ангиогенезу, целевуюя Wnt3a у мышей ApoE−/−. Фармакологическое ингибирование miR-342-5p или урегуляция Wnt3a стабилизируют атеросклеротические бляшки и могут представлять перспективную стратегию для лечения АС.

Доступность данных и материалов

Все данные, полученные в ходе этого исследования, включены в статью и её дополнительные материалы. Дополнительные запросы можно направить корреспондирующему автору.

Аббревиатуры

miR-342-5p

МикроРНК-342-5p

АС

Атеросклероз

α-СМА

α-гладкомышечный актин

МВД

Плотность микрососудов

miRNA

МикроРНК

oe

Сверхэкспрессия

НК

Негативный контроль

ПБС

Фосфатно-буферный раствор

ОХ

Общий холестерин

ТГ

Триглицерид

ЛПНП

Холестерин липопротеинов низкой плотности

ЛПВП

Холестерин липопротеинов высокой плотности

ЭЛИСА

Иммуноферментный анализ

IL

Интерлейкин

TNF-α

Некрозный фактор опухоли альфа

IFN

Интерферон

МДА

Малоновый диальдегид

СОД

Супероксиддисмутаза

РТ-ПЦР

Обратная транскрипция количественная полимеразная цепная реакция