SOX2 модулирует путь CCAT1/miR-185-3p/FOXP3, контролируя пролиферацию и самообновление раковых стволовых клеток шейки матки

Аннотация

Представлена роль длинных некодирующих РНК (lncRNA) в раке шейки матки (РШМ). Мы стремимся обсудить эффект SOX2/lncRNA CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 на пролиферацию и способность к самообновлению стволовых клеток РШМ. Экспрессию miR-185-3p, SOX2, CCAT1 и FOXP3 измеряли в тканях РШМ и клетках. Связь экспрессии SOX2/CCAT1 с клинико-патологическими признаками у пациентов с РШМ верифицировали. Провели loss- и gain-of-function исследования в CD44⁺HeLa клетках для обсуждения биологических функций и способности к самообновлению. Наконец, верифицировали отношения между SOX2, CCAT1, FOXP3 и miR-185-3p. Экспрессия miR-185-3p была снижена, в то время как SOX2, CCAT1 и FOXP3 — повышены в тканях РШМ и клетках. Экспрессия SOX2 и CCAT1 связана с размером опухоли, метастазами в лимфатических узлах (ЛУ) и FIGO стадией РШМ. Даунрегуляция SOX2 или CCAT1 и апрегуляция miR-185-3p привели к ингибированию пролиферации, инвазии, миграции и числа клетковых сфер, а также ускорению апоптоза CD44⁺HeLa клеток. SOX2 мог связываться с CCAT1, влияя на экспрессию miR-185-3p, а FOXP3 таргетировался miR-185-3p.

Введение

Рак шейки матки (РШМ) — четвертая по частоте причина смертности у женщин с оценкой 570 000 случаев и 311 000 смертей во всем мире в 2018 г. Это сложное заболевание вовлекает множество факторов, включая генетические эффекты и вирусную инфекцию. С развитием ко-тестирования ВПЧ и вакцинации от ВПЧ, ранние диагностические процедуры цервикальной дисплазии и рака привели к снижению инцидентности, заболеваемости и смертности РШМ. Для ранних пациентов с РШМ рекомендуется операция: органосохраняющая хирургия, конусная биопсия, радикальная трахелектомия, лимфодиссекция таза, тазовая радиотерапия и брахитерапия. Из-за метастазирования или рецидива у поздних пациентов с РШМ прогноз остается плохим. Поэтому все еще срочно идентифицировать новые и эффективные прогностические маркеры и терапевтические стратегии для улучшения лечения РШМ.

SOX2 — критически важный член семейства транскрипционных факторов SOX, преимущественно экспрессируемый в эмбриональных и взрослых стволовых клетках, а также в опухолевых стволовых клетках. Показано, что SOX2 модулирует радиорезистентность в РШМ через ежиковый сигнальный путь. Другое исследование продемонстрировало, что SOX2 критически важен для поддержания субпопуляции раковых стволовых клеток в линий клеток РШМ. Длинные некодирующие РНК (lncRNA) — класс РНК молекул длиной 200 нуклеотидов. LncRNA CCAT1 локализована на хромосоме 8q24.21 человека и считается «горячей точкой», приводящей к генетическим мутациям в раке толстой кишки. Исследование сообщило, что CCAT1 ускоряет пролиферацию и инвазию клеток РШМ. Согласно Jia и соавт., CCAT1 драматически усиливает пролиферацию, миграцию и инвазию клеток РШМ. Более того, другое исследование раскрыло, что CCAT1 усиливает злокачественность воспалительного заболевания кишечника через разрушение кишечного барьера за счет снижения miR-185-3p. МикРНК может реверсно контролировать экспрессию гена через снижение мРНК и подавление трансляции. In vitro эксперименты в прежнем исследовании раскрыли, что miR-185-3p модулирует радиорезистентность назофарингеального карциномы. Другое исследование подразумевало, что miR-185 вовлечено в цисплатиновую резистентность яичкового рака in vivo и in vitro. FOXP3 — транскрипционный фактор, принадлежащий семейству FOX белков, впервые найден в регуляторных Т (Treg) клетках и играющий жизненно важную роль в поддержании и процессе Treg клеток. Исследование сообщает, что FOXP3 связано с лимфангиогенезом РШМ. Другое исследование раскрыло, что уровень FOXP3 драматически связан с FIGO стадией и размером опухоли РШМ. В данном исследовании мы поэтому изучили эффекты оси SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 на пролиферацию и способность к самообновлению стволовых клеток РШМ.

Материалы и методы

Этическое одобрение и согласие на участие

Эксперименты с участием людей проводились в соответствии с принципами Декларации Хельсинки. Исследование одобрено Институциональным ревью-бордом Первой больницы Цзилинского университета. Все участники подписали документ информированного согласия.

Объекты исследования

С декабря 2016 по декабрь 2018 г. собрано 39 случаев тканей РШМ и соответствующих смежных нормальных тканей у пациентов с РШМ, сохраненных в жидком азоте. Критерии включения: (1) пациенты подтверждены РШМ патологией биопсий в трансцервикальных и цервикальных каналах, цервикальной цитологии мазка, йодным тестом, вагинальным спекулом и ресекцией цервикального позвонка. (2) пациенты не получали лучевую и химиотерапию 2 недели до операции. Критерии исключения: (1) пациенты, проходящие лучевую или химиотерапию, (2) пациенты, не согласные на сбор образца, (3) пациенты с нарушениями иммунной системы.

Выбор и культура клеток

Клеточные линии РШМ (SiHa, HeLa, CaSki, HCC94, C33A) и иммортализированная линия человеческих цервикальных эпителиальных клеток H8 приобрели в Shanghai Bioleaf Biotech Co., Ltd. (Шанхай, Китай). Клетки SiHa, HeLa, HCC94 культивировали в высокоглюкозном DMEM с 10% FBS, CaSki, C33A и H8 — в RPMI-1640 с 10% FBS (37°C, 5% CO₂). Клетки отщепляли и пассажировали каждые 2 дня.

Сортировка стволовых клеток РШМ (CD44⁺HeLa клетки)

Стволовые клетки РШМ разделяли из линии HeLa подвесным культивированием. Клетки HeLa культивировали в бессывороточном IMDM в ультра-ниzkoадгезивной Петри-чаше 21 день с полуколичественным обменом среды каждые 3–5 дней. Часть клеток подвешивалась в сферы, получали HeLa-образующие сферы клетки (SFCs). Свойства сферических клеток идентифицировали и анализировали. Клетки отщепляли трипсином, корректировали до 1×10⁶ клеток/мл. Клетки добавляли анти-CD47 антитело и сортировали потоковой цитометрией. HeLa клетки с положительным CD44 были опухолевыми стволовыми клетками, с отрицательным — не стволовыми. Стволовые клетки РШМ культивировали в DMEM/F12 с 20 нг/мл bFGF, 20 нг/мл EGF и B27. Среда содержала 1% пенициллина и стрептомицина.

Обработка клеток

CD44⁺HeLa клетки трансфектировали sh-SOX2, sh-SOX2 NC, sh-CCAT1, sh-CCAT1 NC, mimic miR-185-3p, mimic NC, sh-CCAT1 и ингибитор miR-185-3p, а также sh-CCAT1 и ингибитор NC. Все олигонуклеотидные последовательности поставлены GenePharma (Шанхай, Китай). Отщепленные трипсином клетки посеяли в 6-лунковую пластину 3×10⁶ клеток/лунку. При достижении 60% конфлюэнтности клетки меняли на бессывороточную среду и инкубировали 1 ч. Трансфекцию облегчал Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, California, USA).

RT-qPCR

РНК в тканях и клетках извлекали Trizol (Invitrogen). РНК (1 мкг) обратно транскрибировали в кДНК набором moloney murine leukemia virus RTase kit (Invitrogen). кДНК добавляли в систему real-time PCR. Праймеры проектировали Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd. (Шанхай, Китай) (Таблица 1). U6 был контролем загрузки для miR-185-3p, GAPDH — для SOX2, CCAT1 и FOXP3. Результаты анализировали методом 2^−ΔΔCt.

Вестерн-блот анализ

Общий белок в клетках и тканях извлекали. Концентрацию белка определяли наборами бинхониновой кислоты (AmyJet Scientific, Ухань, Хубэй, Китай). Белок смешивали с загрузочным буфером, кипятили 5 мин, затем ледяная бань и центрифугация. Белок обрабатывали 10% SDS-PAGE и переносили на мембрану. Мембрану блокировали 5% обезжиренным молоком 1 ч, пробовали первичными антителами SOX2 (1:1000, Jiangsu Rui sitan Co., Ltd., Цзянсу, Китай), FOXP3 (1:1000, Abcam Inc., Кембридж, MA, USA), GAPDH (1:1000, Cell Signaling Technology, Беверли, MA, USA) и повторно пробовали вторичным антителом, маркированным пероксидазой конюшинного редища, покрывали консервирующей пленкой и экспонировали. Bio-rad Gel Doc EZ imager (Bio-rad, Калифорния, USA) использовали для детекции. Белковые изображения анализировали ImageJ2x.

CCK-8 тест

CCK-8 тест проводили наборами (Beyotime, Шанхай, Китай). Клетки (1×10⁴) посеяли в 96-лунку и инкубировали. Культивировали 0, 24, 48, 72 ч, добавляли 10 мкл/лунку CCK-8 раствора, инкубировали 1 ч. Оптическую плотность определяли Multiskan Spectrum фулл-волновым микроплатным ридером при 450 нм. Шесть лунок брали для подсчета среднего значения. Кривая роста клеток строилась со временем как ординатой и относительной жизнеспособностью как ординатой. OD значение представляло пролиферацию клеток.

Потоковая цитометрия

Клетки (1×10⁶) центрифугировали 1500 об/мин, ресуспендировали в 200 мкл связывающего буфера, инкубировали с 5 мкл PI и 5 мкл Annexin V-FITC по очереди, добавляли 400 мкл буфера. Апоптический уровень верифицировали потоковым цитометром (BD Biosciences, NJ, USA).

Scratch-тест

Трансфектированные клетки отщепляли и готовили в подвеску. Подвески (1×10⁶ клеток/мл) посеяли в 6-лунковую пластину, культивировали до 80–90% конфлюэнтности. Поперечные и продольные царапины на 6-лунке равномерно делали 10-мкл асептичной пипеткой вдоль линейки. Исходную среду заменяли полной средой, клетки продолжали культивировать. Миграцию клеток наблюдали под микроскопом в 0 ч и 72 ч и фотографировали в одной точке.

Transwell-анализ

Трансфектированные клетки трипсинизировали, центрифугировали 1000 g, промывали DMEM. Полностью гидратированную Transwell-камеру помещали в 24-лунковую пластину с 10% FBS-DMEM (600 мкл/лунку). Клеточную подвеску (5×10⁵ клеток/мл, 200 мкл) добавляли в верхнюю камеру Transwell (покрытую 1:8 Matrigel 80 мкл), а 500 мкл 20% FBS-DMEM — в нижнюю. Клетки культивировали 24 ч, фиксировали 500 мкл 4% PFA, окрашивали 0,1% кристаллическим фиолетом. Затем клетки на поверхности и краю верхней камеры вытирали ватной палочкой. 5 случайных полей выбирали, клетки считали под микроскопом Nikon Eclipse TE2000-S (Nikon, Япония).

Сферообразующий анализ

Клетки посеяли в низкоадсорбирующую 6-лунковую пластину с бессывороточной подвесной средой 200 клеток/лунку. Через 2 недели скорость образования сфер наблюдали под микроскопом Nikon Eclipse TE2000-S (Nikon), скорость образования сфер рассчитывали как среднее число сфер / число посеянных клеток × 100%.

Хроматинный иммунопреципитационный анализ (ChIP)

ChIP-анализ проводили набором ChIP kit (Upstate, NY, USA). Антитела SOX2 (1:1000, Re-stem Biotech, Цзянсу, Китай) и нормального кроличьего IgG (12–370, Millipore, USA) использовали для иммунопреципитации перекрестно-связанного белок-ДНК комплекса. CD44⁺HeLa клетки фиксировали 1% PFA, инкубировали для производства ДНК-белковых перекрестных связей. Затем ДНК фрагментировали ультразвуком до 200–300 bp хроматинных фрагментов. Преципитированная хроматинная ДНК восстанавливали и анализировали RT-qPCR.

RNA pull-down анализ

Биотинированные плазмиды miR-185-3p wild-type (WT) и mutant-type (MUT) (50 нМ) трансфектировали в CD44⁺HeLa клетки соответственно. Клетки инкубировали с специфическим лизатом (Ambion, Остин, Техас, USA) через 48 ч после трансфекции. Лизат (50 мл) субпакетировали. Остаточный лизат инкубировали с M-280 стрептавидиновыми бусинами (Sigma, Сент-Луис, MO, USA), предварительно покрытыми RNase-free и дрожжевым tRNA (Sigma). Затем клетки очищали дважды холодным лизатом, трижды низкосолевым буфером и один раз высокосолевым буфером. Антагонистический зонд miR-185-3p устанавливали как NC. Общую РНК извлекали Trizol, уровень CCAT1 тестировали RT-qPCR.

Двойной люциферазный репортерный анализ

Потенциальные сайты связывания E1 и E2 SOX2 в промоторной области CCAT1 предсказывали на https://jaspar.genereg.net/. Промоторная последовательность CCAT1, содержащая сайт связи SOX2 и CCAT1 E1, синтезировали, и сформировали векторы CCAT1 3′UTR WT (E1-WT) и CCAT1 3′UTR MUT (E1-MUT). Векторы клонировали в pmirGLO (Beyotime). Затем CCAT1-WT/pmirGLO или CCAT1-MUT/pmirGLO ко-трансфектировали с sh-SOX2 или sh-SOX2 NC в CD44⁺HeLa клетки соответственно на 2 дня, затем лизировали. Люциферазная активность тестировалась системой детекции люциферазы (Takara, Далянь, Китай).

Биоинформатический сайт использовали для предсказания и анализа сайтов связи CCAT1 и miR-185-3p. Сайты связи CCAT1 и miR-185-3p верифицировали двойным люциферазным репортерным анализом. CCAT1 3′UTR, содержащий сайт связи miR-185-3p, составили. CCAT1 3′UTR WT и CCAT1 3′UTR MUT построили и ко-трансфектировали с mimic NC и mimic miR-185-3p в CD44⁺HeLa клетки на 2 дня. Затем клетки лизировали, люциферазная активность тестировалась системой детекции люциферазы (Takara). Тот же метод применяли для верификации таргетных отношений между miR-185-3p и FOXP3.

Статистический анализ

Все данные оценивали SPSS 21.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA). Измерительные данные указывали как среднее ± стандартное отклонение. t-тест применяли для расхождения между двумя группами, однофакторный ANOVA с последующим тестом Тьюки для множественных сравнений — для расхождения среди групп. Классификационная переменная оценивали точным тестом Фишера. P < 0,05 считалось значимым.

Результаты

Экспрессия miR-185-3p снижается, в то время как SOX2, CCAT1 и FOXP3 повышаются в тканях РШМ, и экспрессия SOX2 и CCAT1 связана с размером опухоли, метастазами в ЛУ и FIGO стадией

При обнаружении роли оси SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 на пролиферацию и способность к самообновлению стволовых клеток РШМ, экспрессию miR-185-3p, SOX2, CCAT1 и FOXP3 в тканях РШМ и смежных нормальных тканях тестировали RT-qPCR и вестерн-блотом. Проявилось (Рис. 1a–c), что экспрессия miR-185-3p снижена, в то время как SOX2, CCAT1 и FOXP3 повышены в тканях РШМ.

Рис. 1. Экспрессия miR-185-3p снижается, SOX2, CCAT1 и FOXP3 повышаются в тканях РШМ. а сравнение мРНК SOX2, CCAT1, miR-185-3p и FOXP3 в РШМ и смежных нормальных тканях. б белковые полосы SOX2 и FOXP3 в РШМ и смежных нормальных тканях. в сравнение белковой экспрессии SOX2 и FOXP3 в РШМ и смежных нормальных тканях. *p < 0,05 vs смежные нормальные ткани. Данные: среднее ± SD, t-тест для двух групп.

Связь экспрессии SOX2/CCAT1 с клинико-патологическими признаками РШМ анализировали (Таблица 2). Переэкспрессированные SOX2 и CCAT1 в РШМ были связаны с размером опухоли, метастазами в ЛУ и FIGO стадией, указывая на то, что экспрессия SOX2 и CCAT1 была выше у пациентов с большим размером опухоли, метастазами в ЛУ и продвинутой FIGO стадией.

Экспрессия miR-185-3p снижается, в то время как SOX2, CCAT1 и FOXP3 повышаются в CD44⁺HeLa клетках

Далее, экспрессию miR-185-3p, SOX2, CCAT1 и FOXP3 в иммортализированной линии цервикального эпителия H8 и линиях РШМ SiHa, CaSki, HeLa, HCC94, C33A тестировали. Предположили (Рис. 2a–c), что экспрессия miR-185-3п деградировала, в то время как SOX2, CCAT1 и FOXP3 были повышены в линиях РШМ. Среди них SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 в HeLa клетках имели наибольшую разницу экспрессии от H8; поэтому HeLa выделили и сортировали; HeLa-SFCs получили подвесным культивированием, CD44 экспрессию на поверхности клетки до и после сортировки идентифицировали потоковой цитометрией. Результаты подчеркнули, что положительный уровень CD44 в HeLa-SFCs был заметно выше, чем до сортировки, указывая на успешную сортировку стволовых клеток РШМ (Рис. 2d). Отсортированные стволовые клетки назвали CD44⁺HeLa. Затем экспрессию miR-185-3p, SOX2, CCAT1 и FOXP3 тестировали в HeLa и CD44⁺HeLa (Рис. 2e–g). Проявилось, что SOX2, CCAT1 и FOXP3 были апрегулированы, а miR-185-3p даунрегулирован в CD44⁺HeLa.

Рис. 2. Экспрессия miR-185-3p снижается, SOX2, CCAT1 и FOXP3 повышаются в CD44⁺HeLa. а сравнение мРНК SOX2, CCAT1, miR-185-3p, FOXP3 в H8 и линиях РШМ. б белковые полосы SOX2 и FOXP3 в H8 и линиях РШМ. в сравнение белковой экспрессии SOX2 и FOXP3 в H8 и линиях РШМ. г детекция CD44 экспрессии в HeLa до и после сортировки потоковой цитометрией. д сравнение мРНК SOX2, CCAT1, miR-185-3p между HeLa и CD44⁺HeLa. е белковая полоса SOX2 в HeLa и CD44⁺HeLa. ж сравнение белковой экспрессии SOX2 между HeLa и CD44⁺HeLa. ^p < 0,05 vs H8. &p < 0,05 vs HeLa. Данные: среднее ± SD, t-тест для двух групп, ANOVA с пост-хок Тьюки для множественных.

Даунрегуляция SOX2 и даунрегуляция CCAT1 снижают пролиферацию, миграцию, инвазию и скорость образования сфер и увеличивают апоптоз CD44⁺HeLa клеток

Затем SOX2 и CCAT1 сенсилировали в CD44⁺HeLa для изучения их эффектов на пролиферацию и самообновление стволовых клеток РШМ. Детектированные CCK-8, потоковой цитометрией, scratch-тестом, Transwell и сферообразующим экспериментом, пролиферация, миграция, инвазия и скорость образования сфер были подавлены, а апоптоз CD44⁺HeLa клеток был стимулирован ингибированием SOX2 и CCAT1 (Рис. 3a–i). Это указывало, что сенсинг SOX2 или CCAT1 ингибировал пролиферацию и самообновление стволовых клеток РШМ.

Рис. 3. Даунрегуляция SOX2 и даунрегуляция CCAT1 снижают пролиферацию, миграцию, инвазию и скорость образования сфер и увеличивают апоптоз CD44⁺HeLa. а CCK-8 тест кривая роста клеток при sh-CCAT1 или sh-SOX2. б потоковая цитометрия детекция апоптоза при sh-CCAT1 или sh-SOX2. в сравнение апоптического уровня при sh-CCAT1 или sh-SOX2. г миграция клеток при sh-CCAT1 или sh-SOX2 scratch-тестом. д сравнение миграции при sh-CCAT1 или sh-SOX2. е детекция инвазивной способности при sh-CCAT1 или sh-SOX2 Transwell. ж сравнение инвазивной способности при sh-CCAT1 или sh-SOX2. з сферообразующий эксперимент самообновления при sh-CCAT1 или sh-SOX2. и сравнение скорости образования сфер при sh-CCAT1 или sh-SOX2. a p < 0,05 vs sh-SOX2 NC. b p < 0,05 vs sh-CCAT1 NC. Данные: среднее ± SD, ANOVA с пост-хок Тьюки для множественных групп.

Истощенная miR-185-3p обращает роль даунрегуляции CCAT1 в CD44⁺HeLa клетках

Затем изучали, вовлечена ли miR-185-3p в процесс регуляции пролиферации и самообновления стволовых клеток РШМ CCAT1. CD44⁺HeLa трансфектировали mimic miR-185-3p или ко-трансфектировали sh-CCAT1 и ингибитор miR-185-3p. Результаты представили, что апрегуляция miR-185-3p заметно снизила пролиферацию, миграцию, инвазию и скорость образования сфер, в то время как повысила апоптический уровень CD44⁺HeLa. Клетки, обработанные ингибитором miR-185-3p, могли обратить роль даунрегуляции CCAT1 в пролиферации, миграции, инвазии, апоптозе и образовании сфер CD44⁺HeLa (Рис. 4a–i).

Рис. 4. Апрегулированная miR-185-3p подавляет пролиферацию, миграцию, инвазию и скорость образования сфер и повышает апоптоз CD44⁺HeLa. а CCK-8 кривая роста при mimic miR-185-3p. б потоковая цитометрия апоптоза при mimic miR-185-3p. в сравнение апоптического уровня при mimic miR-185-3p. г миграция при mimic miR-185-3p scratch-тестом. д сравнение миграции при mimic miR-185-3p. е детекция инвазии при mimic miR-185-3p Transwell. ж сравнение инвазивной способности при mimic miR-185-3p. з сферообразующий эксперимент самообновления при mimic miR-185-3p. и сравнение скорости образования сфер при mimic miR-185-3p. a p < 0,05 vs sh-SOX2 NC. b p < 0,05 vs sh-CCAT1 NC. c p < 0,05 vs mimic NC. d p < 0,05 vs sh-CCAT1 + ингибитор NC. Данные: среднее ± SD, ANOVA с пост-хок Тьюки для множественных групп.

Низкоэкспрессированные SOX2 и низкоэкспрессированные CCAT1 снижают экспрессию FOXP3 и повышают экспрессию miR-185-3p в CD44⁺HeLa клетках

После этого изучали экспрессию SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 в CD44⁺HeLa после трансфекции sh-SOX2, sh-CCAT1, mimic miR-185-3p и ко-трансфекции sh-CCAT1 и ингибитора miR-185-3p. Экспрессия SOX2, CCAT1 и FOXP3 снижалась, в то время как miR-185-3p повышалась в клетках с sh-SOX2. Экспрессия CCAT1 и FOXP3 снижалась, miR-185-3p повышалась в клетках с sh-CCAT1. Экспрессия miR-185-3p повышалась, FOXP3 снижалась в клетках с mimic miR-185-3p. Экспрессия FOXP3 повышалась, miR-185-3p снижалась в клетках, последовательно трансфектированных sh-CCAT1 и ингибитором miR-185-3p (Рис. 5a–d).

Рис. 5. Низкоэкспрессированные SOX2 и CCAT1 снижают FOXP3 и повышают miR-185-3p в CD44⁺HeLa. а экспрессия SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 в sh-SOX2 NC и sh-SOX2 группах. б экспрессия в sh-CCAT1 NC и sh-CCAT1 группах. в экспрессия в mimic NC и mimic miR-185-3p группах. г экспрессия в sh-CCAT1 + ингибитор NC и sh-CCAT1 + ингибитор miR-185-3p группах. a p < 0,05 vs sh-SOX2 NC. b p < 0,05 vs sh-CCAT1 NC. c p < 0,05 vs mimic NC. d p < 0,05 vs sh-CCAT1 + ингибитор NC. Данные: среднее ± SD, ANOVA с пост-хок Тьюки для множественных групп.

SOX2 связывается с CCAT1, влияя на экспрессию miR-185-3p, а FOXP3 является таргеном miR-185-3p

Потенциальные сайты связывания промоторной области CCAT1 транскрипционным фактором предсказывали и анализировали на https://jaspar.genereg.net/, показали, что SOX2 и CCAT1 имели потенциальные сайты связывания в промоторной области CCAT1 (Рис. 6a). ChIP-qPCR сообщил (Рис. 6b): в противовес IgG группе, больше фрагментов промотора CCAT1 были обогащены в SOX2 группе на сайте связи E1, что доказало, что SOX2 связывался с промотором CCAT1 на сайте E1 и SOX2 участвовал в регуляции CCAT1. Двойной люциферазный репортерный анализ показал (Рис. 6c): люциферазная активность подавлялась в клетках, ко-трансфектированных sh-SOX2 и E1-WT, указывая, что SOX2 может связываться с CCAT1.

Рис. 6. SOX2 может связываться с CCAT1, влияя на экспрессию miR-185-3p, а FOXP3 — тарген miR-185-3p. а предсказание сайтов связи в промоторных областях SOX2 и CCAT1 биоинформационными сайтами. б ChIP-qPCR верифицировал связь SOX2 и CCAT1. в сайт связи SOX2 и CCAT1 верифицирован двойным люциферазным анализом. г предсказание сайтов связи CCAT1 и miR-185-3p биоинформационными сайтами. д верификация связи CCAT1 и miR-185-3p двойным люциферазным анализом. е связь CCAT1 и miR-185-3p в клетках верифицирована RNA pull-down. ж предсказание таргетных отношений miR-185-3p и FOXP3 биоинформационным сайтом. з идентификация таргетных отношений miR-185-3p и FOXP3 двойным люциферазным анализом. Данные: среднее ± SD, t-тест для двух групп.

Jefferson сайт предсказал, что CCAT1 может связываться с miR-185-3p (Рис. 6d). Двойной люциферазный репортерный анализ сообщил (Рис. 6e): люциферазная активность снижалась в клетках, введенных mimic miR-185-3p и CCAT1-WT, предполагая, что miR-185-3p может связываться с CCAT1. RNA pull-down анализ использовали для верификации, может ли CCAT1 связываться с miR-185-3p. Результаты раскрыли (Рис. 6e): уровень обогащения CCAT1 в клетках с Bio-miR-185-3p-WT заметно увеличился, в то время как уровень обогащения CCAT1 в клетках с Bio-miR-185-3p-MUT не показывал значимой разницы. Этот результат демонстрировал, что CCAT1 может адсорбировать miR-185-3p, тем самым влияя на экспрессию miR-185-3p.

Таргетные отношения между miR-185-3p и FOXP3 предсказывали Jefferson сайтом (Рис. 6g). Двойной люциферазный репортерный анализ верифицировал (Рис. 6h): относительная люциферазная активность клеток драматически снижалась после ко-трансфекции FOXP3-WT и mimic miR-185-3p в CD44⁺HeLa, в то время как FOXP3-MUT ко-трансфектированный с mimic miR-185-3p не влиял на относительную люциферазную активность, предполагая, что miR-185-3p таргетирует FOXP3.

Обсуждение

РШМ — четвертое по частоте злокачественное новообразование у женщин в мире, после рака груди, толстой кишки и легкого. Сообщалось, что клетки РШМ с положительной экспрессией SOX2 показывают характеристики раковых стволовых клеток. Исследование сообщило, что CCAT1 — существенный онкогенный lncRNA, связанный с РШМ, и оказывает фасилитирующую роль в росте и инвазии клеток РШМ. Другое исследование раскрыло, что miR-185-3p может предсказывать радиосенситивность назофарингеального карциномы и регулировать рост и апоптоз раковых клеток. Сообщалось, что циркулирующий аутоантитело к FOXP3 отражает непрерывный прогресс цервикальной лезии и может быть потенциальным биомаркером для ранней прогнозной оценки РШМ. Текущее исследование было спроектировано для изучения того, как ось SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 влияла на пролиферацию и способность к самообновлению стволовых клеток РШМ.

Основываясь на наших находках, экспрессия SOX2 и CCAT1 была повышена в тканях и клетках РШМ, связанная с размером опухоли, метастазами в ЛУ и продвинутой FIGO. Функционально доказано, даунрегуляция SOX2 и CCAT1 снижала пролиферацию, миграцию, инвазию и число сферических клеток, увеличивала апоптоз стволовых клеток РШМ. Аналогично нашему исследованию, экспрессия SOX2 тенденциозно повышается в РШМ. Более того, экспрессия SOX2 также апрегулирована в клетках РШМ, полученных из раковых стволовых клеток. Переэкспрессированная SOX2 предлагалась связана с клинико-патологическими характеристиками пациентов с несколькими типами рака, не ограниченными РШМ. Например, предлагалось, что апрегулированная SOX2 проявляется у пациентов с плоскоклеточным карциномой шейки матки на FIGO I-II стадиях. Более того, экспрессия SOX2 связана с метастазами в ЛУ при плоскоклеточном карциноме полости рта. Когда речь идет о молекулярной функции SOX2 для прогрессии рака, существует наблюдательная работа, представляющая, что даунрегулированная SOX-2 подавляет миграцию и инвазию клеток плоскоклеточного карциномы шейки матки. Тем временем другое исследование предложило доказательство, что апрегулированная SOX2 усиливает клоногеничность, пролиферацию и туморогеничность клеток РШМ in vitro и in vivo по сравнению с контролем.

Что касается регуляторных отношений между SOX2 и CCAT1, существовавшее исследование представило, что сенсинг SOX2 заметно снижает уровень мРНК CCAT1. Что касается роли CCAT1 в раках, исследование показало, что экспрессия CCAT1 заметно повышена в тканях РШМ против смежных нормальных тканей. Особенно, переэкспрессия CCAT1 в РШМ положительно связана с размером опухоли. В терминах роли CCAT1 в активности раковых клеток, есть исследование, подчеркивающее, что переэкспрессированная CCAT1 ускоряет пролиферацию, колониобразование и инвазию клеток РШМ. Интересно, предыдущее исследование продемонстрировало, что жизнеспособность, инвазивная и миграционная способности снижаются через нокаут CCAT1. В любом случае, функциональный эффект SOX2 и CCAT1 в других раках был аналогичен тому в РШМ.

После этого наше исследование раскрыло, что CCAT1 может связываться с miR-185-3p, даунрегулированная CCAT1 в РШМ и переэкспрессия miR-185-3p подавляли пролиферацию и способность к самообновлению стволовых клеток РШМ. Сообщается, что CCAT1 и miR-185-3p негативно коррелированы. Более того, результат сообщил, что снижение видно в экспрессии miR-185-3p в радиорезистентных случаях назофарингеального карциномы. Что касается супрессивной функции miR-185-3p в агрессивности раковых клеток, исследование раскрыло, что апрегуляция miR-185-3p подавляет инвазивные и метастатические свойства клеток назофарингеального карциномы. Более того, Zou и соавт. предложили, что восстановленная miR-185 подавляет рост и инвазию клеток рака груди. Есть статья, обнаруживающая, что апрегуляция miR-185 снижает пролиферацию, инвазию и колониобразующую способность клеток неклеточного рака легкого in vitro. Представлено, что in vitro пролиферация, инвазия, миграция и in vivo рост опухоли подавляются через переэкспрессию miR-185 в клетках неклеточного рака легкого. Из этих исследований антиопухолевую роль miR-185-3p в настоящем исследовании было согласовано с предыдущими исследованиями.

Чтобы продолжить, мы раскрыли, что miR-185-3p таргетирует FOXP3, онкоген в РШМ для регуляции активности стволовых клеток РШМ. Фактически, FOXP3, регулятор маркера раковых стволоподобных клеток SOX2 в раке толстой кишки, изучался в РШМ, показывая апрегуляцию в клетках РШМ. Было подтверждено, что элевация FOXP3 способствует образованию опухолевых сфер и стимулирует стволовость клеток неклеточного рака легкого.

Заключение

Коллективно, мы впервые исследовали, что транскрипция SOX2 может активировать CCAT1, тем самым ингибируя miR-185-3p и регулируя FOXP3 для стимуляции пролиферации и самообновления стволовых клеток РШМ, что является потенциальным путем для лечения РШМ. Дополнительно, однако, ограничения в настоящем исследовании все еще существуют в относительно небольшом размере выборки в спроектированном эксперименте. Таким образом, клинические исследования могут быть дальше проведены для детекции эффективности для лечения РШМ.

Доступность данных и материалов

Не применимо.