Частота-модулированная диэлектрофорез везикул и клеток: предсказуемые U-образные траектории на частоте перехода

Аннотация

Мы вывели комплексную модель для диэлектрофоретческой (DEP) силы, воздействующей на микро- и наноскопические частицы при воздействии частота-модулированных (FM) электрических полей. Настраивая частотный диапазон FM волны для охвата частоты перехода fₓ действительной части фактора Клаузиуса-Моссотти, наша теория предсказывает систематическое обращение DEP силы каждый раз, когда мгновенная частота пересекает fₓ. Экспериментально мы наблюдали периодические U-образные повороты в многослойных везикулах (MLV), клетках человеческой Т-клеточной лейкемии (TL), В-клеточной лейкемии (BL) и эритроцитах (RB) под FM-DEP. Видеотрекинг этих U-поворотов обеспечивает быстрый, <30-секундный и высокоточный метод определения fₓ, полезный как для физиологических растворов, так и для наночастичных суспензий, где поток растворителя, индуцированный электрическим полем, минимизирован. Точность fₓ подтверждена двумя независимыми экспериментами: (1) измерение DEP силы на одиночной везикуле под переменнотоковым (AC) DEP при различных синусоидальных частотах и сравнение полученного fₓ с FM-DEP; и (2) оценка того, как fₓ варьируется с проводимостью окружающей среды для трех типов клеток. Второй подход позволил одновременную оценку цитоплазматических проводимостей и мембранных емкостей с использованием уточненной однооболочечной модели. Цитоплазматические проводимости были слегка ниже ранее сообщенных диапазонов, в то время как мембранные емкости близко соответствовали литературным значениям.

Введение

Клеточная поляризуемость доминируется мембранными и цитоплазматическими электрическими свойствами, которые варьируются с частотой приложенного поля. Эта частота-зависимая диэлектрическая спектра позволяет безмаркерную дискриминацию клеточных фенотипов через импедансную спектроскопию, AC DEP, волновой DEP (twDEP) и электротацию. По сравнению с антителозависимыми или адгезивными методами маркировки, эти электрические техники избегают модификации клеток и потенциальной активации, делая их привлекательными для неинвазивной сортировки клеток.

DEP возникает в неоднородном электрическом поле, генерируя силу, пропорциональную градиенту амплитуды поля и действительной части фактора Клаузиуса-Моссотти (CM). Фазовый градиент порождает twDEP или электротацию, дающие дополнительную диэлектрическую информацию. Наша работа расширяет обычный AC DEP, вводя FM электрические поля, позволяя непрерывное пересечение частоты перехода fₓ и обеспечивая быструю диэлектрическую характеристику.

В типичных AC DEP установках поле приложено между фиксированными микрофабрикационными электродами, ограничивая пространственную гибкость. Электронные пинцеты — где микроманипулируемые игольчатые электроды доставляют поле — предлагают универсальный, бесконтактный альтернативный подход. Однако диэлектрические измерения требуют коротких времени воздействия (<30 с) для уменьшения эффектов потока растворителя, что сложно с многоэлектродными системами. FM-DEP решает это, модулируя частоту при постоянной геометрии электродов.

Наша плагин-система (Рис. 1) использует два вольфрамовых игольчатых электрода, каждый с диаметром кончика 0,5 мкм, позиционированных на 100 мкм друг от друга. Иглы управляются генератором произвольных волн и током усилителем, и вся сборка монтируется на микроманипуляторе патч-клэмпа под инвертированным микроскопом. Эта конфигурация позволяет точное, бесконтактное манипулирование отдельными везикулами или клетками над подложкой.

FM волна определяется как

E(r,t)=A(r)cosθ(t),

с фазой, связанной с мгновенной частотой f(t) через θ̇=2πf(t). Мы используем широкополосную FM модуляцию:

f(t)=f_c+Δf cos(2πf_m t),

где модуляционная частота f_m намного меньше несущего частотного диапазона, удовлетворяя условию широкополосного предела (WBL) Δf/f_m≫1.

Методы

Материалы

MLV готовили из 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолина (DOPC; Avanti Polar Lipids). 1 мл DOPC раствора (20 мМ) в хлороформ/метанол (2:1 об/об) сушили под азотом и вакуум-запечатывали >12 ч. Тонкую пленку регидрировали деионизированной водой и инкубировали при 25 °C несколько часов.

Клеточные линии человеческой Т-клеточной лейкемии (JKT-β-del) и В-клеточной лейкемии (CCRF-SB) культивировали в RPMI 1640 с 10% фетовой говяжьей сыворотки и 100 мМ пирувата натрия при 37 °C, 5% CO₂. Через 1 неделю клетки осаждали (370 g, 3 мин, дважды) и ресуспендировали в 1 мл RPMI 1640. Суспензии затем разбавляли изотоническим 200 мМ сахарозой для достижения желаемых проводимостей.

Человеческие эритроциты (RB) изолировали из полной крови здоровых волонтеров (ранние двадцатилетия). Клетки суспендировали в 3,1% гематокрите RPMI 1640 смеси и разбавляли 200 мМ сахарозой. Все RB эксперименты выполняли в течение 10 мин после забора крови.

Экспериментальная установка

Проводимость суспензий измеряли прибором SevenMulti (Mettler-Toledo). FM или AC поле генерировали генератором Agilent 33220A и усиливали F30PV токовым усилителем. Два вольфрамовых иглы 0,5 мкм, разделенные 100 мкм, доставляли поле. Пара игл позиционировала 50 мкл суспензии на нагреваемой площадке (25 °C). Визуализация выполнялась микроскопом Nikon TE2000-U и CCD камерой Retiga Exi (25 к/с). Разрешение частоты FM волны проверяли в пределах экспериментальной погрешности.

Дополнительные фильмы S1–S3 демонстрируют AC DEP манипуляцию диатомовых клеток в деионизированной воде: (S1) вращение при 30 кГц, (S2) толкание к стеклянной стенке при 100 кГц, и (S3) извлечение при 20 МГц.

Результаты и обсуждение

Экспериментальное наблюдение лейкемической клетки под FM-DEP

Плагин иглы позволяют применять поле над подложкой, облегчая точный выбор клетки. Фильм S4 показывает треугольную диатомовую клетку, реагирующую на частотный скачок 100–500 кГц с интервалом 0,5 с. Фильмы S5 и S6 представляют типичные U-образные траектории TL клеток под FM-DEP (0,25 Гц модуляция, 200 кГц ≤ f(t) ≤ 3 МГц). Рис. 2 отображает 3D траекторию (x, y, t), где начало соответствует кончику иглы. Ось x выровнена по касательной к поверхности электрода; ось y отражает амплитуду U-поворота.

U-повороты состоят из трех фаз: уход от иглы, приближение после U-поворота и пребывание на поверхности электрода. Поток растворителя часто предотвращает точное возвращение в ту же точку, но время ухода и начала U-поворота ясны. Наблюдаемый период U-поворота (≈4 с) соответствует периоду модуляции 0,25 Гц.

Теоретическое исследование FM-DEP

Для сферической частицы с внутренней диэлектрической проницаемостью ε_in и проводимостью σ_in и внешней ε_out, σ_out, DEP сила:

F_DEP(r,t)=p(r,t)·∇E(r,t),

с дипольным моментом

p(r,t)=4πR³ε_out K_H{E(r,t)+ (τ/Δτ) Ẽ(r,t)},

где K_H=(ε_in–ε_out)/(ε_in+2ε_out), Δτ⁻¹=τ₀⁻¹–τ⁻¹, и τ₀ и τ — характеристические времена, определенные в тексте. Усреднение за AC цикл дает среднюю DEP силу

⟨F_DEP⟩=χ(f_AC)∇A_RMS²,

где χ(f) пропорциональна действительной части CM фактора.

Заменяя AC поле FM волной и призывая WBL, усредненная DEP сила становится

⟨F_DEP(r,t)⟩=χ{f(t)}∇A_RMS²,

показывая, что направление силы меняется всякий раз, когда f(t) пересекает fₓ. Это объясняет периодические U-повороты, наблюдаемые экспериментально.

Решая для момента, когда f(t)=fₓ, дает

fₓ=f_c–Δf cos(πf_m Δt_n),

где Δt_n — измеренное время от ухода от электрода до U-поворота. Таким образом, FM-DEP метод обеспечивает быстрое определение fₓ из наблюдаемой траектории.

Сравнение частот перехода одиночной MLV, определенных FM- и AC-DEP

Используя безсолевую MLV суспензию, мы сравнили fₓ, полученные от FM-DEP (10–50 кГц FM диапазон, f_m=0,1 Гц, 10 с период) и AC-DEP (30–100 кГц синусоида). Из FM траектории среднее время ухода составляло 5,8 ± 0,2 с, давая fₓ=35 ± 1 кГц. AC-DEP измерения силы движущейся иглой дали силу-частотную кривую, подогнанную модели

F_DEP(f)= [L+(2πfτ)²H]/[1+(2πfτ)²],

с подогнанными параметрами L=–21,02 пН, H=19,03 пН, τ=4,9 мкс, давая fₓ=34,15 кГц, в отличном согласии с FM результатом.

Проводимостные зависимости частот перехода для биологических клеток

Мы применили FM-DEP к TL, BL и RB клеткам в проводимостных диапазонах 60–160 мСм⁻¹ (Δf≈700 кГц, f_m=0,25 Гц). Для каждого типа клеток мы измеряли времена ухода 10 клеток на каплю, усредненные по двум каплям, и выводили fₓ используя Уравнение (10). Рис. 6 строит полученные fₓ versus σ_out. Данные подогнали к расширенной однооболочечной модели

fₓ= [σ_out–(σ_out²)/(2σ_cyt)]/(√2 π R C_m) + fₓ₀,

давая мембранные емкости C_m и цитоплазматические проводимости σ_cyt, согласующиеся с литературными значениями (C_m≈0,5–1,5 мкФ/см², σ_cyt≈0,3–0,8 С/м). Последовательность по типам клеток подтверждает надежность FM-DEP для диэлектрической характеристики.

Заключение

Наша основанная на WBL теория и эксперименты подтверждают, что FM-DEP производит предсказуемые U-повороты на частоте перехода, позволяя быстрое, <30-секундное определение fₓ. FM-DEP измерения MLV совпадают с прямыми AC-DEP измерениями силы, в то время как проводимостно-зависимые fₓ данные дают мембранные емкости, согласующиеся с литературой. FM-DEP поэтому предлагает надежный, бесконтактный метод для диэлектрической спектроскопии везикул и клеток, и может быть расширен к суб-микронным и наноскопическим частицам в on-chip конфигурациях для реального-времени электро кинетической спектроскопии.

Аббревиатуры

AC:

Переменный ток

BL:

В-клеточная лейкемия

CM:

Клаузиус-Моссотти

DEP:

Диэлектрофорез

DOPC:

1,2-Диолеоил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин

FM:

Частота-модулированный

MLV:

Многослойная везикула

RB:

Эритроцит

RMS:

Квадратичное среднее

TL:

Т-клеточная лейкемия

twDEP:

Волновой диэлектрофорез

WBL:

Широкополосный предел