Графеноксид-интегрированные nHAC/PLGA скаффолды стимулируют пролиферацию остеобластов и регенерацию кости

Аннотация

Биоразлагаемые пористые скаффолды являются центральными в костной тканевой инженерии. В этом исследовании нано-гидрок시아патит/коллаген (nHAC), смешанный с поли(лактид-ко-гликолидной кислотой) (PLGA) и переменными количествами графитного оксида (GO), изготавливали методом лиофилизации. Полученные композиты демонстрировали непрерывную трехмерную пористую сеть. GO слегка улучшил гидрофильность и значительно увеличил модуль Юнга, с образцом 1,5 мас.% GO достигающим 10,20 ± 1,28 ГПа по сравнению с 7,53 ± 1,25 ГПа для скаффолда без GO. In vitro, остеобласты MC3T3-E1 демонстрировали значительно более высокую адгезию и пролиферацию на скаффолде 1,5 мас.% GO, как подтвердили CCK-8 тесты и SEM изображения. Эти результаты демонстрируют, что nHAC/PLGA/GO скаффолды сочетают отличную цитокомпатибельность с превосходной механической производительностью, позиционируя их как перспективных кандидатов для приложений регенерации кости.

Введение

Трехмерные пористые скаффолды, эмулирующие внеклеточную матрицу кости, необходимы для успешного восстановления кости. Конвенциональные техники fabricación — электроспининг, компьютерный топологический дизайн (CTD) в сочетании с твердотельной свободной формацией (SFF) и лиофилизация — предлагают разные степени структурного контроля и масштабируемости. Лиофилизация в частности предоставляет прямой путь к генерации высоко взаимосвязанных пор путем сублимации замороженного растворителя под вакуумом.

Родная кость состоит из иерархической сборки коллагена и гидрок시아патита (HA). Нано-гидроксияпатит/коллаген (nHAC) композиты имитируют эту природную архитектуру, обеспечивая благоприятную биокомпатибельность и биоресорбируемость. Однако внутренняя ломкость коллагена и быстрая деградация ограничивают его использование. Поли(лактид-ко-гликолидная кислота) (PLGA) вводит механическую надежность и настраиваемые скорости деградации, в то время как GO предлагает уникальные физико-химические свойства — высокую площадь поверхности, механическое усиление и функциональные группы, которые могут модулировать поведение клеток.

Предыдущие работы показывали, что GO-усиленные скаффолды улучшают остеогенное дифференцирование и пролиферацию клеток. Здесь мы систематически оценили, как инкрементная загрузка GO (0,0; 0,5; 1,0 и 1,5 мас.%) влияет на структурные, механические, гидрофильные и биологические характеристики nHAC/PLGA композитов.

Результаты и обсуждение

Структура композитных скаффолдов nHAC/PLGA/GO

Процесс fabricación включал растворение коллагена типа I в уксусной кислоте, ко-осаджение ионов Ca и P для формирования nHAC, смешивание с PLGA и диспергированным GO, за которым следовала лиофилизация. Растровой электронной микроскопии (SEM) раскрыла высокопористую архитектуру с взаимосвязанными порами от 0 до 200 нм. Распределение пор квантифицировали автоматическим анализатором площади поверхности (рис. 2ф), подтверждая преобладание суб-100 нм пор, диапазон размеров, благоприятный для инфильтрации остеобластов.

Схема фабрикации скаффолда через лиофилизацию.

Физико-химическая и механическая характеристика

Порошковая рентгеновская дифракция (XRD) подтвердила наличие гексагонального HA; GO сигналы были неразличимы из-за низкой загрузки. FT-IR спектры показывали характерные амидные полосы коллагена и фосфатные пики, с тонкими сдвигами, указывающими на химическое взаимодействие между коллагеном, HA, PLGA и GO.

Количественные нано-механические AFM измерения (QNM-AFM) раскрыли монотонное увеличение модуля Юнга с содержанием GO: 7,53 ± 1,25 ГПа (0 мас.%), 8,34 ± 1,00 ГПа (0,5 мас.%), 9,15 ± 0,85 ГПа (1,0 мас.%) и 10,20 ± 1,28 ГПа (1,5 мас.%). Скаффолд 1,5 мас.% GO демонстрировал статистически значимое преимущество в жесткости по сравнению с GO-свободным аналогом, отражая усиливающий эффект GO.

Измерения угла смачивания показали постепенное снижение от 125,1° (без GO) до 101,4° (1,5 мас.%), указывая на улучшенную смачиваемость поверхности благодаря гидрофильным функциональным группам GO (рис. 4ф).

AFM изображения (а–д) и карты жесткости (i) четырех вариантов скаффолдов; углы смачивания (k) измеренные сессильным каплевым методом.

Клеточное культивирование и цитотоксичность

Остеобласты MC3T3-E1, засеянные на скаффолдах, демонстрировали возрастающую метаболическую активность в течение 7 дней (CCK-8 тест). В то время как ранняя пролиферация на скаффолдах 0,5 мас.% и 1,0 мас.% GO была слегка ниже, чем у GO-свободного контроля, скаффолд 1,5 мас.% GO сравнялся и превзошел контроль на 3, 5 и 7 днях (рис. 5). SEM изображения подтвердили обширное расспрастание клеток и формирование сети, с клетками на GO-нагруженных скаффолдах, демонстрирующими более крупные, более сплюснутые морфологии (рис. 6).

Фибробласты NIH-3T3, экспонированные суспензиям скаффолдов на 24 ч, не показали значительной цитотоксичности; живучесть оставалась выше 97% при всех загрузках GO, подтверждая биокомпатибельность композитов (рис. 7).

Живучесть клеток MC3T3-E1 на четырех вариантах скаффолдов (*** p < 0,01).

SEM изображения клеток MC3T3-E1 на 1, 3, 5 и 7 днях на четырех типах скаффолдов.

Относительная живучесть клеток NIH-3T3 после 24-часовой экспозиции суспензиям скаффолдов.

Заключение

Лиофилизация позволила изготовить nHAC/PLGA/GO скаффолды с взаимосвязанной пористостью, улучшенной механической жесткостью и улучшенной гидрофильностью. Скаффолд 1,5 мас.% GO продемонстрировал превосходную адгезию и пролиферацию остеобластов, сохраняя отличную цитокомпатибельность, подчеркивая его потенциал как скаффолда для костной тканевой инженерии.

Методы

Материалы

Коллаген типа I, PLGA (75:25, Mw = 95 кДа), GO и реагенты для клеточной культуры приобрели у проверенных поставщиков. Остеобласты MC3T3-E1 и фибробласты NIH-3T3 получили из авторитетных клеточных банков.

Подготовка скаффолдов

Коллаген растворяли в 0,5 М уксусной кислоте (4 г/л). Кальций и фосфат растворы (Ca/P = 1,66) добавляли капельно со скоростью 100 капель/мин, перемешивали и титровали до pH 9 аммиаком при 37 °C. Через 24 ч осадок собирали, лиофилизировали и измельчали для получения nHAC порошка.

GO диспергировали в диоксане (0,0; 0,5; 1,0; 1,5 г/л) ультразвуком, затем смешивали с PLGA (10% м/об) и перемешивали 12 ч. nHAC добавляли в соотношении 1:1 по весу к PLGA, за чем следовала 4-часовая ультразвуковая обработка. Смесь замораживали при –20 °C на ночь и лиофилизировали для получения итоговых скаффолдов.

Характеристика

SEM, AFM (QNM режим), FT-IR, XRD, угол смачивания и пористость измерения проводили стандартными протоколами. Все данные собирали в трипликате.

Клеточная культура и тесты

Клетки MC3T3-E1 засевали при 2,5 × 10⁴ клеток/мл на дисках скаффолдов и культивировали в DMEM +10% FBS +3% антибиотиков при 37 °C, 5% CO₂. Пролиферацию оценивали CCK-8 на 1, 3, 5 и 7 днях. Для SEM клетки фиксировали 4% параформальдегидом, дегидратировали, критической-точкой сушили и распыляли золотом.

Цитотоксичность тест

Клетки NIH-3T3 экспонировали 100 мг/мл суспензиям скаффолдов на 24 ч, за чем следовал CCK-8 тест. Живучесть клеток рассчитывали относительно контрольных культур.

Статистический анализ

Данные выражаются как среднее ± SD. Стьюдентов t-тест применялся; p < 0,05 считался значимым.