Оценка модуляции C60 фуллереном связывания дифенил-N-(трихloroацетил)амидофосфата с ДНК и цитотоксичности в клетках человеческой лейкемии

Аннотация

Синтезирован новый представитель карбациламидофосфатов — дифенил-N-(трихloroацетил)амидофосфат (HL), содержащий два фенокси-заместителя возле фосфорильной группы, идентифицирован элементным анализом, ИК и ЯМР спектроскопией, и протестирован как цитотоксический агент сам по себе и в комбинации с C₆₀ фуллереном.

Согласно результатам молекулярного моделирования, C₆₀ фуллерен и HL могут взаимодействовать с ДНК и формировать жесткий комплекс, стабилизированный стакинговыми взаимодействиями фенильных групп HL с C₆₀ фуллереном и гуаниновым нуклеотидом ДНК, а также взаимодействиями CCl₃ группы HL ионно-π связями с молекулой C₆₀ и электростатическими связями с гуаниновым нуклеотидом ДНК.

С помощью MTT-теста показана цитотоксическая активность HL против человеческих лейкемических клеток CCRF-CM со значением IC₅₀ 10 мкМ при 72 ч инкубации. При совместном действии 16 мкМ C₆₀ фуллерена и HL значение IC₅₀ обнаружено при более низкой концентрации HL 5 мкМ и более ранний период 48 ч, кроме того, цитотоксический эффект HL наблюдался при низкой концентрации 2,5 мкМ, при которой HL сам по себе не влиял на живучесть клеток. Предполагается, что связывание C₆₀ фуллерена и HL с малым бороздью ДНК с образованием стабильного комплекса является одной из возможных причин их синергетического подавления пролиферации клеток CCRF-CЕМ.

Применение C₆₀ фуллерена в комбинации с 2,5 мкМ HL не оказывало вредного влияния на структурную стабильность мембран эритроцитов крови. Таким образом, совместное действие C₆₀ фуллерена и HL в низкой концентрации потенцировало цитотоксический эффект HL против человеческих лейкемических клеток и не сопровождалось гемолитическим эффектом.

Введение

Представитель углеродных наноструктур C₆₀ фуллерен показывает уникальные физико-химические свойства и биологическую активность не только как антиоксидант или фотосенсибилизатор, но и как модификатор токсического действия противоопухолевых препаратов благодаря способности проникать внутрь клетки и функционировать как переносчик лекарств [1–4]. Молекула C₆₀ может взаимодействовать с химиотерапевтическими препаратами, такими как доксорубицин, цисплатин и паклитаксел, и формировать с ними комплексы, усиливающие терапевтический эффект [5–8].

Карбациламидофосфаты (КАФ) — органические молекулы, привлекающие внимание своей структурой, биологической активностью и перспективами биомедицинского применения [9–12]. Наличие пептидных и фосфорамидных групп, объединенных в фрагменте C(O)N(H)P(O) молекулы, определяет ее взаимодействие с биологическими молекулами и клеточными мембранами. Вариация заместителей возле фосфорильной и карбонильной групп дает возможность модулировать стереохимические и фармакологические свойства КАФ. В частности, разные представители КАФ показывали антинеопластическую активность [13, 14].

Недавно мы подтвердили, что представитель КАФ диметил-N-(бензоил)амидофосфат, используемый в миллимолярных концентрациях, снижал живучесть лейкемических клеток L1210, и его токсический эффект усиливался C₆₀ фуллереном [15]. Также показано, что введение дополнительных ароматических заместителей и электроотрицательной CCl₃ группы в структуру КАФ приводило к повышению ее токсичности [16]. Таким образом, показан значительный токсичный эффект диморфолидо-N-трихloroацетилфосфорамида против человеческих лейкемических клеток разного происхождения, но его эффективная концентрация все еще была высокой, и усиления токсичности при совместном действии с C₆₀ фуллереном не наблюдалось. В продолжение этих исследований мы синтезировали новый представитель КАФ дифенил-N-(трихloroацетил)амидофосфат (HL), имеющий два фенокси-заместителя вместо морфолидо групп возле фосфорильной группы (рис. 1).

Цель исследования — оценить биологическую активность дифенил-N-(трихloroацетил)амидофосфата (HL) отдельно или в комбинации с C₆₀ фуллереном с использованием in silico анализа их взаимодействия с ДНК и in vitro изучения цитотоксических эффектов против линии человеческих лейкемических клеток.

Методы/Эксперимент

Реактивы

Жидкая среда RPMI 1640, Фетальная тельнячья сыворотка (FBS), Пенициллин/Стрептомицин и L-глутамин (Biochrom, Германия), Диметилсульфоксид (DMSO) (Carl Roth GmbH+Co, Германия), МТТ [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид] (Sigma-Aldrich Co, Ltd., США), HCl (Харьковреахим, Украина).

Характеризация химического соединения

Для повышения растворимости получен натриевая соль дифенил-N-(трихloroацетил)амидофосфата (HL) по следующим реакциям (рис. 2).

Раствор трифеноксифосфозотрихloroацетила (0,035 М) в 200 мл хлороформа медленно добавляли к хорошо перемешиваемой суспензии натрийфенолата (0,106 М, 12,3 г) в 150 мл хлороформа (рис. 2; стадия 1). Температура смеси не допускали выше 40–50 °C. Перемешивание продолжали около 1 ч, затем раствор нагревали до 70 °C и перемешивали 20 мин при этих условиях. Полученный продукт трифеноксифосфозотрихloroацетил испаряли. Затем добавляли 40 мл 1 М NaOH и рефлюксировали 90 мин (рис. 2; стадия 2. Полученная смесь испаряли. Твердый осадок натриевой HL промывали три раза диэтилового эфира и рекристаллизовывали из изопропанола в виде белого кристаллического порошка (выход 80%). Бесцветные кристаллы NaL·3H₂O, подходящие для рентгеновского анализа, получены медленным испарением раствора изо-PrOH:H₂O (9:1 v/v). Соединение стабильно в воздухе, высокорастворимо в воде и спиртах. Т.пл. 215 °C.

HL идентифицирован элементным анализом и ИК и ЯМР спектроскопией: элементный анализ (C, H, N) выполняли на универсальном элементном анализаторе EL III CHNOS. ИК спектры измеряли для образцов в виде KBr таблеток на спектрометре Perkin–Elmer Spectrum BX FT-IR с разрешением 2 см⁻¹ и 8 накоплениями, усредненными для исключения случайных артефактов поглощения в спектральном диапазоне 4000–400 см⁻¹. ¹H ЯМР спектры в растворах DMSO-d₆ записывали на спектрометре AVANCE 400 Bruker при комнатной температуре.

HL: ИК (см⁻¹): 1639 vs, sh (νCO); 1353 s, sh (Амид II); 1194 s, sh (νPO); 941 s, sh (νPN).

¹H ЯМР (DMSO-d₆): 7,05 (t, 2H, γ-CH₂); 7,205, 7,255 (dt, 8H, α- и β-CH₂).

Для CCl₃C(O)N(Na)P(O)(OC₆H₅)₂ элементный состав определен, %: C 40,58, H 2,35, N 3,15; и расчетный, %: C 40,37, H 2,42, N 3,36.

Синтез и характеристика C₆₀ фуллерена

Высокостабильное водное коллоидное растворение C₆₀ фуллерена (200 мкМ, чистота >99,5%, средний размер наночастиц до 50 нм) синтезирован в Техническом университете Ильменау (Германия) как описано в [17, 18].

Клеточная культура

Эксперименты проводили на линии человеческих острых Т-клеточных лейкемий CCRF-CM. Клеточная линия приобретена в Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures: CCRF-CM (ACC 240). Клетки культивировали в среде RPMI 1640 с 10% FBS, 1% Пенициллин/Стрептомицин, 2 мМ Глутамин, в флаконах 25 см² при 37 °C с 5% CO₂ в увлажненном инкубаторе.

Клетки в среде RPMI 1640 инкубировали с C₆₀ фуллереном (16 мкМ) или HL (2,5, 5 и 10 мкМ) раздельно и вместе в течение 24, 48 и 72 ч. Живучесть клеток без добавления HL или C₆₀ фуллерена принималась за 100% (контрольный образец содержал 0,05 М DMSO).

Тест живучести клеток (MTT)

Живучесть клеток оценивали MTT-тестом [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид] редукции [19]. В указанные временные точки инкубации 100 мкл аликвот (0,5×10⁴ клетки) размещали в 96-колодчатых микроплитках Sarstedt (Нюмбрехт, Германия), добавляли 10 мкл раствора МТТ (5 мг/мл в ФСБ) в каждую колодку, и плашки инкубировали еще 2 ч при 37 °C. Культурная среда затем заменяли на 100 мкл DMSO; образование диформазана определяли измерением абсорбции при 570 нм на микроплиточном ридере Tecan Infinite M200 Pro (Меннедорф, Швейцария).

Животные

Исследование проводили на белых крысах линии «Вистар» массой 170±5 г. Животные содержали в стандартных условиях в виварии ЕНЦ «Институт биологии и медицины», Тарас Шевченко Киевский национальный университет. Животные имели свободный доступ к корму и воде. Все эксперименты проводили в соответствии с международными принципами Европейской конвенции по защите позвоночных животных под контролем Биоэтического комитета вышеуказанного учреждения.

Оценка гемолиза эритроцитов

Эритроциты получали из гепаринизированной крови крыс линии «Вистар» и разбавляли в 0,85% растворе NaCl до 0,700 опт. плотности при 630 нм на спектрофотометре Scinco (Германия). Гемолиз эритроцит вызывали 0,001 N HCl. Кинетику гемолиза измеряли спектрофотометрически (λ=630 нм) каждые 10 с в течение 2 мин. Процент гемолизированных эритроцитов рассчитывали как в [20]. Эритроциты инкубировали в 0,85% NaCl с C₆₀ фуллереном (16 мкМ) или HL (2,5 и 10 мкМ) раздельно и вместе в течение 1 ч. Эритроциты без добавления HL или C₆₀ фуллерена принимались за 100% (контрольный образец содержал 0,05 М DMSO).

In silico исследование

Двухспиральная молекула ДНК использовалась как шаблон из базы PDB (Protein Data Bank). Изучалось взаимодействие молекулы ДНК с HL раздельно и в комбинации с C₆₀ фуллереном. Учитывались следующие структуры ДНК: 2MIW (CCATCGCTACC — интеркаляция соединения в малую борозду спирали ДНК), 1XRW (CCTCGTCC — интеркаляция в малую борозду), и 2M2C (GCGCATGCTACGCG — связывание с большой и малой бороздами ДНК). Применяли алгоритм систематического докинга (SDOCK+), встроенный в пакет QXP (этот метод демонстрирует все возможные конформации изучаемых структур с минимальным значением среднеквадратичного отклонения RMSD) [21]. Генерировали 300 потенциально возможных комплексов с ДНК, десять лучших отбирали для следующей стадии, используя функцию скоринга, встроенную в QXP [22].

Взаимодействия молекулы ДНК с HL раздельно и в комбинации с C₆₀ фуллереном характеризовались параметрами: (1) число водородных связей, (2) площадь контактирующих поверхностей ДНК и соответствующей структуры, (3) расстояние между ДНК и докингованной структурой, и (4) полная энергия связывающей структуры.

Для оценки стабильности комплексов химического соединения с C₆₀ фуллереном проводили короткую молекулярную динамику (MD, 100 пс) с использованием Gromacs [23] по алгоритму Нозе-Пуанкаре-Андерсона (NPA) [24, 25] на основе силовое поля OPLS-AA [26, 27].

Расчеты выполняли при параметрах: температура (Кельвины) — 300; давление (килопаскали) — 100; связывание с участием водородного атома или лиганда ограничивалось алгоритмом [25].

Статистический анализ

Данные представлены как среднее ± SD более четырех независимых экспериментов. Среднее (M) и стандартное отклонение (SD) рассчитывали для каждой группы. Статистический анализ выполняли двухфакторным дисперсионным анализом (ANOVA) с последующими тестами Бонферрони. Значение p < 0,05 считалось статистически значимым. Обработка данных и построение графиков выполняли на IBM PC с использованием специализированных приложений GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc., США).

Результаты и обсуждение

In silico исследование

Взаимодействие HL с ДНК

Показано, что HL может интеркалировать в ДНК и формировать стабильный комплекс при связывании в малой борозде ДНК через нуклеотиды AGC-GCTA (рис. 3a). В этом случае формировалось стакинговое взаимодействие между азотной основой нуклеотида А и фенильной группой HL, а также электростатическое взаимодействие между CCl₃ группой и нуклеотидом Ц. После MD моделирования значения RMSD для двойной спирали ДНК и HL составили 3,3 и 1,62 Å соответственно. Нуклеотидное окружение HL (GCA-CTA) частично изменилось, стакинговое взаимодействие потерялось, а сформировалась водородная связь между нуклеотидом G и CO группой HL.

Связывание HL с большой бороздой ДНК происходило через нуклеотиды TCG-AT (рис. 3b). В этом случае формировалась водородная связь между CO группой HL и азотной основой нуклеотида А, и стакинговые взаимодействия между обеими фенильными группами HL и азотными основаниями нуклеотидов Ц и G. Кроме того, возникала вероятность электростатической связи между CCl₃ группой HL и азотными основаниями AT нуклеотидов.

После MD моделирования изменений в нуклеотидном окружении HL не обнаружено. Значения RMSD для ДНК и HL составили 2,77 и 1,58 Å соответственно. Из-за этого стакинговое взаимодействие между нуклеотидом Ц и фенильной группой исчезло.

В случае интеркаляции HL в ДНК его окружение состояло из CG-CG нуклеотидов (рис. 3c). Появлялось стакинговое взаимодействие с CG нуклеотидами: одна фенильная группа зажималась между азотными основаниями, а другая формировала стакинговое взаимодействие с нуклеотидом Ц.

После MD моделирования значения RMSD для двойной спирали ДНК и HL были 1,71 и 1,89 Å соответственно. Нуклеотидное окружение HL не изменилось. Одна из фенильных групп формировала ионно-π взаимодействие с азотной основой нуклеотида G, который сдвинулся на 1,12 Å.

Полученные энергетические параметры свидетельствовали, что энергия стерических столкновений между ДНК и HL, а также внутри HL самой, была незначительной (Таблица 1).

Проведен сравнительный анализ энергетических параметров связывания HL с малой и большой бороздами ДНК или его интеркаляции в малую борозду. Значения Bump составляли 6,2 кДж/моль при интеркаляции HL в ДНК и 2,5 кДж/моль при связывании с малой и большой бороздами ДНК (Таблица 1). Значения Int были 8,7 кДж/моль при интеркаляции, 6,3 кДж/моль при связывании с большой бороздой, и 3,6 кДж/моль при связывании с малой бороздой. Эти данные показали, что связывание HL с малой бороздой ДНК было наиболее стабильным.

Комбинированное взаимодействие HL и C₆₀ фуллерена с ДНК

Ранее с помощью компьютерного моделирования мы демонстрировали, что молекула C₆₀ может взаимодействовать с ДНК и формировать стабильный комплекс C₆₀+ДНК при связывании с малой бороздой ДНК [15]. Как показано на рис. 4, C₆₀ фуллерен также может формировать ионно-π связи с CCl₃ группами молекулы HL.

Использовали две версии молекулярного моделирования взаимодействия HL, C₆₀ фуллерена и ДНК, предложенные в [16] и доказавшие свою полезность для интерпретации результатов MD моделирования. Использовали структуру 1XRW PDB ДНК в версии, когда сначала HL, а затем молекула C₆₀ интеркалируют в ДНК (HL+C₆₀) и структуру 2MIW PDB ДНК — в версии, когда сначала молекула C₆₀, а затем HL интеркалируют в ДНК (C₆₀+HL).

Связывание с малой бороздой ДНК в случае версии HL+C₆₀ происходило через нуклеотиды GCTA-GCAT (рис. 4a). Фенильные группы заполняли малую борозду и входили в стакинговые взаимодействия: одна группа с C₆₀ фуллереном, а другая с азотной основой нуклеотида G. Электростатические взаимодействия возникали между CCl₃ группой HL и как азотной основой нуклеотида G, так и C₆₀ фуллереном.

Согласно результатам MD моделирования, двойная спираль ДНК в этом случае характеризовалась значительной подвижностью (значение RMSD 3,08 Å), значение RMSD для HL было 2,04 Å, в то время как C₆₀ фуллерен оставался практически неподвижным. В результате нуклеотидное окружение структуры HL+C₆₀ изменилось на TGC-GCATG. Кроме того, появилась водородная связь между аминогруппой HL и ДНК и стакинговые взаимодействия между нуклеотидами азотных оснований GC и C₆₀ фуллереном.

Связывание HL+C₆₀ с большой бороздой ДНК происходило через нуклеотиды C-ATCC (рис. 4b). Водородные связи формировались между CO группой HL и азотной основой нуклеотида А. Фенильные группы заполняли большую борозду ДНК и входили в стакинговое взаимодействие с C₆₀ фуллереном.

Согласно результатам MD моделирования, нуклеотидное окружение структуры HL+C₆₀ не изменилось: значения RMSD для ДНК и HL были 3,14 и 2,24 Å соответственно, C₆₀ фуллерен оставался практически неподвижным. В этом случае все взаимодействия между HL и C₆₀ фуллереном исчезали и HL стерически взаимодействовала только с ДНК. Предполагается, что в результате C₆₀ фуллерен, как и HL, будут вытеснены из большой борозды ДНК.

Когда HL+C₆₀ интеркалировали в малую борозду ДНК (рис. 4c), происходило связывание с нуклеотидами CGT-GAG. C₆₀ фуллерен оказался встроенным в малую борозду ДНК и стерически взаимодействовал с ней. Фенильные группы HL формировали стакинговые взаимодействия с азотными основаниями CG-CG нуклеотидов. Согласно MD моделированию, значения RMSD для ДНК и HL были 2,29 и 2,13 Å соответственно, C₆₀ фуллерен оставался практически неподвижным, и CCl₃ группа HL входила в электростатическое взаимодействие с азотной основой нуклеотида G.

В случае версии C₆₀+HL, связывание с малой бороздой ДНК (рис. 4d) происходило через нуклеотиды CGC-GCC. Одна из фенильных групп HL формировала стакинг с C₆₀ фуллереном, а другая с нуклеотидом G. CCl₃ группа HL образовывала электростатическую связь с азотной основой нуклеотида Ц. Согласно MD анализу, значения RMSD для ДНК и HL в этом случае были 2,35 и 2,75 Å соответственно, C₆₀ молекула оставалась неподвижной, и нуклеотидное окружение структуры C₆₀+HL изменилось на CGCT-GC. Кроме того, молекула C₆₀ проникала глубже в ДНК и формировала стакинговое взаимодействие с азотной основой нуклеотида Ц.

Согласно расчетным энергетическим параметрам, комплекс, сформированный в случае интеркаляции C₆₀+HL в малую борозду ДНК, был самым жестким (значение Bump 20,0 кДж/моль) (Таблица 1). В отличие от этого, в случае взаимодействия HL+C₆₀ с ДНК, этот параметр был только 6,2 кДж/моль при интеркаляции HL+C₆₀ в малую борозду, 7,8 кДж/моль при связывании с малой бороздой, и 8,8 кДж/моль при связывании с большой бороздой. Кроме того, энергетические параметры показывали, что формирование сильных водородных связей внутри комплекса HL+C₆₀+ДНК возможно только при связывании с большой бороздой ДНК, когда значение Hbnd было −2,3 кДж/моль, в других типах взаимодействия оно равно нулю или −1,0 кДж/моль (Таблица 1). Более того, согласно результатам MD в этом случае и C₆₀ фуллерен, и HL оказывались вытесненными из большой борозды ДНК.

Следовательно, связывание C₆₀+HL с малой бороздой ДНК предлагается как наиболее вероятный вариант комбинированного взаимодействия C₆₀ фуллерена, HL и ДНК.

In vitro изучение биологических эффектов HL

Живучесть клеток CCRF-CЕМ

В in vitro экспериментах длительное влияние дифенил-N-(трихloroацетил)амидофосфата (HL) в диапазоне 2,5–10 мкМ на живучесть человеческих лейкемических клеток CCRF-CЕМ оценивали MTT-тестом. Клетки инкубировали 24, 48 и 72 ч в среде RPMI 1640 с 16 мкМ C₆₀ фуллереном или HL отдельно или их комбинацией. Живучесть клеток, инкубированных без C₆₀ или HL, считалась 100%.

При 24 ч инкубации эффекта HL на живучесть CCRF-CЕМ не наблюдалось (рис. 5). Все же при более длительной инкубации цитотоксическая активность HL в концентрациях 5 и 10 мкМ стала очевидной, живучесть клеток при 48 ч ингибировалась на 25 и 33% соответственно и продолжала падать при 72 ч.

Следует отметить, что 50% снижение живучести CCRF-CЕМ клеток (IC₅₀) обнаруживалось при 72 ч под действием HL в концентрации 10 мкМ (рис. 5). Недавно мы показывали, что другой представитель КАФ диморфолидо-N-трихloroацетилфосфорамид вызывал 50% снижение живучести CCRF-CЕМ клеток при 72 ч в концентрации 1 мМ [16]. Сравнительный анализ этих данных демонстрирует, что введение фенокси вместо морфолидо групп в структуру производного КАФ позволило снизить на два порядка его эффективную токсичную концентрацию против лейкемических клеток. Предполагаем, что конформационная гибкость ядра –P(O)(OC₆H₅) обеспечила более эффективное взаимодействие этого соединения с ДНК.

Влияния C₆₀ фуллерена, используемого отдельно, на живучесть клеток в период инкубации не обнаружено (данные не представлены). В то же время результаты на рис. 6 демонстрируют, что C₆₀ фуллерен интенсифицировал цитотоксическую активность HL против клеток CCRF-CЕМ. При совместном действии C₆₀ фуллерена и HL, 50% снижение живучести наблюдалось при более низкой концентрации HL (5 мкМ) и более ранний период (48 ч) инкубации, чем под действием HL отдельно. Более того, при 72 ч совместного действия C₆₀ фуллерена и HL цитотоксический эффект HL обнаруживался в низкой концентрации 2,5 мкМ, при которой HL сам по себе не влиял на живучесть клеток (рис. 6).

Таким образом, C₆₀ фуллерен показан как потенцирующий цитотоксические эффекты HL и значительно повышающий чувствительность лейкемических клеток к его действию в низкой концентрации. Учитывая, что C₆₀ фуллерен способен аккумулироваться внутри лейкемических клеток более 24 ч [28] и локализоваться внутриклеточных отсеках [29–31], в частности в ядре [32, 33], его взаимодействие с ядерной ДНК активно пролиферирующих раковых клеток не должно исключаться.

Так, полученные in vitro данные согласуются с результатами in silico исследования и демонстрируют, что первоначальное связывание молекулы C₆₀, а затем HL с малой бороздой ДНК с образованием стабильного комплекса может быть одной из возможных причин их синергетического подавления пролиферации клеток CCRF-CЕМ.

Сопротивляемость эритроцитов гемолизу

При оценке противоопухолевого потенциала комбинации HL и C₆₀ фуллерена важно учитывать возможные эффекты на незлокачественные клетки, в частности на клетки крови.

Изучение сопротивляемости эритроцитов кислотному гемолизу позволяет прояснить влияние фармакологического агента на мембранном уровне. Динамика гемолиза отражает динамику разрушения плазматической мембраны эритроцита и, следовательно, стабильность ее структурной организации. На рис. 7 показана зависимость процента гемолиза эритроцитов, инкубированных 1 ч в растворе NaCl без добавок (контроль) и с HL или C₆₀ фуллереном отдельно или в комбинации. Влияния 16 мкМ C₆₀ фуллерена на гемолиз эритроцитов не обнаружено (не показано). HL в концентрации 2,5 мкМ отдельно или в комбинации с C₆₀ не влиял на сопротивляемость эритроцитов гемолизу (рис. 7). В то же время, под действием HL в концентрации 10 мкМ обнаруживалось ускорение гемолиза с максимумом на 20 с. Совместное действие 10 мкМ HL и C₆₀ фуллерена сопровождалось дальнейшим усилением гемолиза с 60% гемолизированных эритроцитов на 20 с.

Полученные данные показали, что применение C₆₀ фуллерена в комбинации с 2,5 мкМ HL не оказывало вредного влияния на структурную стабильность мембран эритроцитов крови и в то же время позволяло значительно повысить цитотоксическую активность HL в этой низкой концентрации против лейкемических клеток. Несмотря на синергетический цитотоксический эффект C₆₀ фуллерена и HL в концентрации 10 мкМ против лейкемических клеток, применение их комбинации оказывалось ограниченным усилением гемолитического эффекта.

Наконец, в контексте вышеуказанного in vitro исследования важно подчеркнуть, что твердо/водный интерфейс имеет конфинированную воду, которая также может влиять на транспортные, термодинамические свойства наноструктур [34, 35] и их взаимодействие с клеточными мембранами [36].

Существуют литературные данные о внутриклеточной локализации производных карбациламидофосфатов, в частности, проникновении фосфорамидатов в клетки. Таким образом, производные фосфорамидатов могут проникать через мембрану раковых клеток молочной железы MDA-231 и легких (H460, H383, H2009) [37]. Нитробензил фосфорамидат мустарды показывали проникновение через клеточные мембраны и локализацию в митохондриях NTR⁺ млекопитающих клеток [10]. Не исключено, что C₆₀ фуллерен, способный проникать мембрану раковой клетки за счет пассивной диффузии или эндоцитоза [28, 30, 32] с аккумуляцией в ядре и митохондриях [30, 32, 33], может быть транспортером малых противоопухолевых молекул [38–40].

Выводы

Синтезирован и протестирован новый представитель производных карбациламидофосфатов с двумя фенокси-заместителями возле фосфорильной группы — дифенил-N-(трихloroацетил)амидофосфат (HL) как цитотоксический агент сам по себе и в комбинации с C₆₀ фуллереном. Согласно результатам молекулярного моделирования, когда C₆₀ фуллерен, а затем HL связывались с малой бороздой ДНК, формировался жесткий комплекс, стабилизированный стакинговыми взаимодействиями фенильных групп HL с C₆₀ фуллереном и нуклеотидом G ДНК, а также взаимодействиями CCl₃ группы HL ионно-π связями с молекулой C₆₀ и электростатическими связями с нуклеотидом G ДНК.

С помощью MTT-теста показана цитотоксическая активность HL против человеческих лейкемических клеток CCRF-CM с IC₅₀ 10 мкМ при 72 ч обработки. Цитотоксический эффект HL усиливался C₆₀ фуллереном. При совместном действии 16 мкМ C₆₀ фуллерена и HL значение IC₅₀ обнаруживалось при более низкой концентрации HL 5 мкМ и более ранний период 48 ч инкубации, а также цитотоксический эффект HL наблюдался при низкой концентрации 2,5 мкМ, при которой HL сам по себе не влиял на живучесть клеток.

Ранее мы показывали значительный токсический эффект диморфолидо-N-трихloroацетилфосфорамида против человеческих лейкемических клеток разного происхождения, но его эффективная концентрация была высокой, и усиления токсичности при совместном действии с C₆₀ фуллереном не наблюдалось [16]. Предполагаем, что введение гибких –P(O)(OC₆H₅) групп вместо морфолидо групп в производное КАФ способствовало снижению его токсичной концентрации против человеческих лейкемических клеток, обеспечивая его эффективное взаимодействие с молекулой C₆₀ и ДНК. Связывание C₆₀ фуллерена и HL с малой бороздой ДНК с образованием стабильного комплекса предполагается как одна из возможных причин их синергетического подавления пролиферации клеток CCRF-CЕМ.

Выявлено, что применение C₆₀ фуллерена в комбинации с 2,5 мкМ HL не оказывало вредного влияния на структурную стабильность мембран эритроцитов крови, в то время как комбинация C₆₀ фуллерена с 10 мкМ HL оказывалась ограниченной усилением гемолитического эффекта.

Таким образом, C₆₀ фуллерен показан как потенцирующий цитотоксический эффект HL и значительно повышающий чувствительность человеческих лейкемических клеток к его действию в низкой концентрации. Комбинация C₆₀ фуллерена с HL в низкой концентрации 2,5 мкМ может быть перспективной для дальнейших биомедицинских исследований.

Аббревиатуры

DMSO:

Диметилсульфоксид

DNA:

Дезоксирибонуклеиновая кислота

FBS:

Фетальная тельнячья сыворотка

HL:

Дифенил-N-(трихloroацетил)амидофосфат

IR:

Инфракрасная спектроскопия

MD:

Молекулярная динамика

MTT:

3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2-H-тетразолий бромид

NMR:

Ядерно-магнитный резонанс

RPMI — 1640 среда:

Среда Росвелл Парк Мемориал Институт