Двухмодальный МРТ/флуоресцентный нанозонд cRGD-Gd-Cy5.5 для таргетированной визуализации интегрину αvβ3-позитивных опухолей

Аннотация

Злокачественные опухоли остаются ведущей причиной смертности во всем мире, и способность обнаруживать раннее заболевание и предсказывать метастатическое распространение критична для выбора наиболее эффективной стратегии лечения. Интегрину α_vβ₃ — хорошо валидированный биомаркер опухолевой ангиогенеза, делая его привлекательной мишенью для молекулярной визуализации. Здесь мы сообщаем о синтезе и in vitro оценке липосомно-базированного двухмодального зонда, cRGD-Gd-Cy5.5, сочетающего T₁-взвешенный магнитный резонанс (МР) контраст с ближним инфракрасным флуоресцентом. Наночастицы ~60 нм в диаметре, демонстрируют отличную водную дисперсию, положительный дзета-потенциал (+39,5 мВ) и r₁ релаксативность 10,5 мМ⁻¹ с⁻¹ — более чем в два раза выше клинического агента Магневист. Цитотоксичность анализы показывают >70% клеточной жизнеспособности при Gd концентрациях до 400 мкМ. Флуоресцентные и МР исследования в клетках A549 и SUNE-1-5-8F демонстрируют селективное поглощение в интегрину-αvβ₃-богатых клетках, в то время как нормальные MCF-10A клетки демонстрируют пренебрежимое связывание. In vivo визуализация в голой мышиной модели назофарингеальной карциномы раскрывает опухоль-специфическое усиление сигнала, сохраняющееся минимум 6 ч пост-инъекции. Эти выводы устанавливают cRGD-Gd-Cy5.5 как безопасный, высокоотзывчивый двухмодальный зонд для реального времени мониторинга опухолевых метастазов.

Введение

Метастатическое распространение — главная причина неудачи лечения солидных опухолей. Признак этого процесса — ремоделирование внеклеточного матрикса (ECM) и формирование новой сосудистости, оба посредствованы интегрином α_vβ₃. Этот интегрин экспрессируется на высоких уровнях на эндотелиальных клетках опухолевой неоваскулятуры и на многих типах опухолевых клеток, но низок или отсутствует в нормальных тканях, делая его идеальной мишенью для визуализации.

Недавние достижения в молекулярной визуализации сделали возможным неинвазивное допрашивание опухолевой биологии. Эффективные зонды требуют таргетинговой моети и детектируемого сигнала. RGD пептидная последовательность, связывающая интегрину α_vβ₃ с высокой аффинностью, стала стандартным таргетинговым лигандом. Комбинирование этого с магнитным резонансом, предлагающим высокий мягкотканевой контраст и глубокое проникновение, и ближним инфракрасным флуоресцентом, обеспечивающим высокую чувствительность для внутриоперационной навигации, дает мощный двухмодальный подход.

В то время как Gd-базированные T₁ агенты широко используются клинически, им не хватает врожденной опухолевой специфичности. Инкапсулируя Gd ионы в липосомы и декорируя поверхность RGD и Cy5.5 флуорофором, мы создали зонд, который не только улучшает релаксативность, но и доставляет высокоспецифическую таргетинговую способность.

Результаты

Характеристика cRGD-Gd-Cy5.5 нанозонда

Зонд появляется как бледно-розовая, прозрачная жидкость без осадка после стояния, указывая на хорошую коллоидную стабильность. Трансляционная электронная микроскопия (ТЭМ) показывает равномерно размерные, сферические липосомы (~60 нм) без агрегации (рис. 1a). Динамическое световое рассеяние (DLS) дает гидродинамический диаметр 124,2 ± 0,215 нм и положительный дзета-потенциал 39,5 ± 1,65 мВ, подтверждая поверхностную амино-групповую функционализацию (рис. 1b,c).

Флуоресцентная спектроскопия подтверждает успешную Cy5.5 конъюгацию, с отличительным эмиссионным пиком на 685 нм при 600-нм возбуждении (рис. 2a). In vivo мелкое-животное визуализация демонстрирует яркое красное флуоресцентное в липосом-Cy5.5, в то время как пустые липосомы не показывают сигнал (рис. 2b).

МР релаксометрия cRGD-Gd-Cy5.5 нанозонда

Линейная аппроксимация T₁ релаксационных времен против Gd концентрации дает r₁ релаксативность 10,515 мМ⁻¹ с⁻¹, более чем в два раза выше Магневиста (4,56 мМ⁻¹ с⁻¹). Зонд показывает дозо-зависимый рост сигнальной интенсивности, подтверждая его пригодность как положительного контрастного агента (рис. 3a,b).

Цитотоксичность исследования cRGD-Gd-Cy5.5 нанозонда

CCK-8 анализы по A549, SUNE-1-5-8F, HUVEC и MCF-10A клеткам показывают >70% жизнеспособности при Gd концентрациях до 400 мкМ после 24 ч, указывая на отличную биосовместимость (рис. 4).

Иммунофлуоресцентное окрашивание и потоковая цитометрия интегрину αvβ3

Конфокальное визуализация показывает сильное интегрину αvβ3 окрашивание на мембранах A549 и SUNE-1-5-8F клеток, с пренебрежимым сигналом в MCF-10A клетках (рис. 5a). Потоковая цитометрия квантифицирует поверхностную экспрессию: A549 (89,07%), SUNE-1-5-8F (63,84%), MCF-10A (1,56%).

Клеточное поглощение cRGD-Gd-Cy5.5

Красное флуоресцентное очевидно на мембранах A549 и SUNE-1-5-8F клеток после 1 ч инкубации, с интенсивностью пропорциональной интегрину экспрессии. Никакого сигнала не наблюдается в MCF-10A клетках, подтверждая таргетинговую специфичность.

In vitro МР и флуоресцентная визуализация

T₁-взвешенные МР изображения становятся прогрессивно ярче с увеличивающимися Gd концентрациями в A549 клетках, со статистически значимой разницей (p < 0,05). Флуоресцентная визуализация показывает соответствующий рост Cy5.5 сигнала, превосходящий нетаргетированный Gd-Cy5.5 контроль (рис. 6).

In vivo МР и флуоресцентная визуализация

В голых мышах с назофарингеальной карциномой ксенограффом, опухолевой контраст улучшается заметно через 5 мин пост-инъекции и остается стабильным до 6 ч. Рецептор-блокированная группа показывает лишь маргинальное усиление, подтверждая интегрину-медированное поглощение. Флуоресцентная визуализация зеркалит МР выводы, с пиковым опухолевым сигналом в 6 ч и почечным экскреционным явным в 6 ч (рис. 7).

Обсуждение

Интегрину α_vβ₃ высоко экспрессируется на опухолевой сосудистости и многих злокачественных типах клеток, делая его убедительной мишенью для неинвазивной визуализации. Традиционные Gd хелаты не имеют опухолевой специфичности и предлагают ограниченную релаксативность. Инкапсулируя Gd в липосомы и декорируя поверхность циклическим RGD пептидом и Cy5.5, мы достигли двухмодального зонда, комбинирующего высокое пространственное разрешение T₁ МР с чувствительностью NIR флуоресценции.

r₁ зонда 10,5 мМ⁻¹ с⁻¹ превосходит клинические агенты, в то время как положительный поверхностный заряд и ~60 нм размер способствуют эффективному опухолевому накоплению и удержанию. Цитотоксичность исследования подтверждают отличную безопасность, с жизнеспособностью выше 70% даже при сверхклинических Gd дозах. Важно, поглощение зонда сильно коррелирует с уровнями интегрину экспрессии, как показано иммунофлуоресценцией, потоковой цитометрией и in vitro визуализацией.

In vivo данные демонстрируют специфическое опухолевое таргетирование, устойчивый контраст до 6 ч и почечную клиренс, указывая на благоприятный фармакокинетический профиль. Эти атрибуты позиционируют cRGD-Gd-Cy5.5 как перспективную платформу для реального времени, мультимодального мониторинга опухолевого прогрессирования и метастазирования.

Заключение

Липосомный двухмодальный зонд cRGD-Gd-Cy5.5 — надежный, безопасный и высокоотзывчивый инструмент для таргетирования интегрину α_vβ₃. Его превосходная релаксативность, специфическое опухолевое связывание и низкая цитотоксичность обеспечивают твердую основу для будущей клинической трансляции в неинвазивной, реального времени визуализации опухолевых метастазов.

Методы

Синтез cRGD-Gd-Cy5.5

Липосомы приготовили растворением лецитина, холестерина и DSPE-PEG₂₀₀₀-NH₂ в хлороформе, за чем следовала ротационная испарение для формирования тонкой пленки. Пленку гидратировали GdCl₃ раствором (10 мг) в карбонатном буфере (pH 8,5) при 50 °C, затем ультразвуково обрабатывали и фильтровали (0,22 мкм) перед ультрафильтрацией (10 кДа) для удаления свободного Gd. RGD пептид активировали EDC/NHS и конъюгировали с Cy5.5, затем сцепляли с поверхностью липосомы при pH 8,4. Финальная формулировка хранили при 4 °C.

Характеристика наночастиц

Размер частиц и морфология оценивали ТЭМ и DLS. Оптические свойства измеряли микроплейт ридером (400–800 нм абсорбция, 600-нм возбуждение). FT-IR и UV-ВИС спектры подтверждали поверхностную функционализацию.

Измерение скорости релаксации

Серийные разбавления зонда сканировали на 3,0-Т МР сканере используя MOLLI последовательность (TR = 5,8 мс, TE = 3,66 мс). T₁ значения извлекали из 0,3 см² ROI и строили против Gd концентрации для расчета r₁.

Клеточная культура и цитотоксичность анализ

Человеческие опухолевые и нормальные клеточные линии (A549, SUNE-1-5-8F, HUVEC, MCF-10A) культивировали в DMEM с 10% FBS. CCK-8 анализы выполняли при 50–400 мкМ Gd 24 ч для определения жизнеспособности.

Иммунофлуоресцентное окрашивание и потоковая цитометрия интегрину αvβ3

Клетки фиксировали, блокировали и инкубировали с анти-αvβ3 антителом, за чем следовало флуоресцентное вторичное антитело и DAPI окрашивание. Конфокальная микроскопия и потоковая цитометрия (488 нм возбуждение) квантифицировали поверхностную экспрессию.

Связывающий анализ молекулярного зонда к интегрину αvβ3

Клетки инкубировали с зондом 1 ч, промывали и визуализировали конфокальной микроскопией для оценки связывания.

In vitro МР визуализация и флуоресцентная визуализация опухолевых клеток

A549 клетки инкубировали с варьирующими Gd концентрациями (0–0,08 мМ) 2 ч, затем промывали, встраивали в агароз и визуализировали на 3,0-Т МР сканере. Флуоресцентная визуализация выполняли на мелко-животной системе.

In vivo МР и флуоресцентная визуализация

Balb/c голые мыши с назофарингеальной карциномой ксенограффом получали хвостово-венозные инъекции 0,05 ммоль Gd/кг cRGD-Gd-Cy5.5. МР и флуоресцентная визуализация выполняли до-инъекции, 30 мин, 2 ч и 6 ч пост-инъекции. Рецептор-блокированная группа получала свободный RGD (10 мг) 1 ч до зонда инъекции.