Оптимизация липосом глицирретиновой кислоты через лиофилизацию монофазного раствора: преформуляция, дизайн и in-vitro оценка

Аннотация

В этом исследовании липосомы глицирретиновой кислоты (GA) успешно сформулированы методом лиофилизации монофазного раствора. Преформуляционная работа изучала растворимость соевой фосфатидилхолина (SPC), холестерина и GA в ко-растворителяхtert-бутиловый спирт/вода (TBA/вода). Мы исследовали, как объемный процент TBA влияет на скорость сублимации, и характеризовали лиофилизированный GA DSC, XRD и FTIR. XRD указал на аморфное состояние GA, в то время как FTIR подтвердил отсутствие химических изменений. Тесты растворимости выявили заметный рост водной растворимости GA. Используя Бокс-Бенкена дизайн и выбор лиопротектанта, мы идентифицировали оптимальную формуляцию — 508 мг SPC, 151 мг холестерина, 55% TBA и весовое соотношение трегалоза/SPC 4:1. При этих условиях реконституированные липосомы демонстрировали эффективность инкапсуляции 74,87% и средний диаметр 191 нм. In-vitro исследования выпуска показали устойчивый выпуск в двух средах, и клеточные тесты улавливания продемонстрировали время-зависимое улавливание клетками Hep G2.

Преамбула

Глицирретиновая кислота (GA), тритерпеновый сапонин, экстрагированный из корней Glycyrrhiza, демонстрирует антимикробную, антивирусную и антиопухолевую активность и клинически используется для хронического гепатита и рака печени. Согласно Биофармацевтической Классификационной Системе, GA — препарат класса II; его низкая полярность, высокая гидрофобность и плохая растворимость ограничивают оральную биодоступность и могут вызывать дозозависимое задержание натрия и потерю калия, ведущие к гипертонии. Улучшение абсорбции и поддержание терапевтических концентраций через целевую формуляцию поэтому критично.

Липосомы широко признаны своей биосовместимостью, способностью таргетировать лимфоузлы и опухоли через эффект усиленного проникновения и удержания, и универсальностью в переносе как гидрофобных, так и гидрофильных лекарств. Однако конвенциональные водные липосомные суспензии нестабильны, склонны к утечке, слиянию и гидролизу фосфолипидов, что препятствует длительному хранению. Пролипосомы — сухие, текучие порошки, реконституирующиеся в липосомы при гидратации — предлагают решение. Традиционное производство пролипосом спрей-сушкой или сублимационной сушкой имеет недостатки: спрей-сушка может повредить термочувствительные лекарства, а сублимационная сушка трудоемка и дорога из-за длительного удаления воды.

Недавняя инновация, метод лиофилизации монофазного раствора, растворяет липиды, лекарство и водорастворимый лиопротектант в ко-растворителе tert-бутиловый спирт/вода, затем сублимационная сушка производит сухой порошок, спонтанно формирующий липосомы при добавлении воды. Преимущества включают быструю сублимацию, одностадийную обработку, подходящую для крупномасштабного производства, низкий риск остаточного растворителя (TBA класс 3), стерильный порошковый выход и совместимость с плохо водорастворимыми или нестабильными лекарствами.

Несмотря на эти преимущества, остаются пробелы в знаниях: влияние концентрации TBA/воды на скорость сублимации, твердотельно-состоятельные изменения лекарства после лиофилизации и процесс гидратационно-сборки порошка. Это исследование использует GA как модель для адресации этих вопросов, оптимизируя формуляционные и процессные переменные через Бокс-Бенкена дизайн, оценивая эффекты лиопротектанта и оценивая in-vitro выпуск и клеточное улавливание.

Методы / Экспериментальная часть

Материалы

Глицирретиновая кислота (≥ 98% чистоты) получена от Dalian Meilun Biology Technology Co., Ltd. Соевая фосфатидилхолин (Lipoid S100) и холестерин получены от Lipoid GmbH и J&K Scientific Ltd. соответственно. FITC-PEG-DSPE (МВ 2000) от Shanghai Ponsure Biotech, Inc. Терт-бутиловый спирт (≥ 98%) и все остальные реактивы приобретены у Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Деионизированная вода произведена системой Milli-Q.

Исследования растворимости

Насыщенные растворы GA, SPC и холестерина приготовили в TBA/вода смесях при температурах 25 °C до 45 °C. Растворимость GA kvantифицировали HPLC с C18 колонкой (4,6 × 250 мм, 5 мкм) и метанол/вода (90:10 v/v) мобильной фазой при 1,0 мл мин⁻¹, детектируя при 250 нм. Растворимость SPC и холестерина оценивали турбидиметрическим методом, мониторя абсорбцию при 655 нм.

Приготовление лиофилизации монофазного раствора

GA, SPC и холестерин растворили в TBA при 45 °C; выбранный лиопротектант (маннитол, лактоза, сахароза или трегалоза) растворили в воде при 45 °C. Два раствора смешали для получения изотропного монофазного раствора (60 мл). После фильтрации (0,22 мкм), 2,0 мл аликвоты помещали в 10 мл флаконы для сублимационной сушки, предварительно заморожали при −40 °C на 12 ч и лиофилизировали при −50 °C на 24 ч (давление камеры 1–20 Па).

Размер частиц и эффективность инкапсуляции

Реконституированные липосомы приготовили диспергированием 5 мг пролипосомного порошка в 5 мл очищенной воды, вихревое перемешивание 1 мин, повторение через 15 мин. Размер измеряли динамическим световым рассеянием (Nano ZS90, Malvern). Эффективность инкапсуляции (EE) определяли ультрафильтрационно-центрифугацией: 1 мл дисперсии фильтровали через 50 кДа MWCO фильтр, фильтрат kvantифицировали HPLC, и EE рассчитывали через EE = (1 − W_free/W_total) × 100%.

Скорость сублимации и парциальное давление

TBA/вода смеси переменных TBA объемных процентов (10–90%) предварительно заморожали и лиофилизировали; время до полной сублимации записывали для расчета скорости (мкл мин⁻¹). Парциальное давление измеряли статическим эбуллиометром и уравнением Антуана.

Физикохимическая характеристика

DSC (HSC-1, 25–350 °C, 10 °C мин⁻¹, атмосфера N₂) оценивал тепловые переходы. XRD (D8 Focus, Cu-Kα, 5°–60°, 5° мин⁻¹) оценивал кристалличность. FTIR (Nicolet 6700, 4000–400 см⁻¹, 4 см⁻¹ разрешение) верифицировал химическую целостность.

Стабильность

Пролипосомные порошки хранили при 25 °C, азот-заполненные, в темноте. Через 6 месяцев EE и размер частиц реконституированных липосом переоценивали.

In-vitro выпуск

Выпуск изучали диализом (MWCO 8000–14000 Da) в PBS (pH 7,4) или 0,1% Tween 80 физрастворе при 37 °C, перемешивании 300 об/мин. Образцы забирали до 12 ч, заменяли свежей средой, и GA kvantифицировали HPLC.

Клеточное улавливание

FITC-маркированные GA липосомы инкубировали с HepG2 клетками (1×10⁴ клеток мл⁻¹) на 0,5, 1, 2 и 4 ч. После промывки и карантинирования трипан-синим, клетки лизировали Тритоном X-100. Флуоресценция (возбуждение 495 нм, эмиссия 520 нм) измеряли и нормировали к белковому содержанию (BCA анализ).

Результаты и обсуждение

Растворимость и сублимация

Растворимость GA в TBA/вода прогрессивно росла с обоими TBA объемным процентом и температурой; растворимость превышала 0,5 мг мл⁻¹ когда TBA > 40%. SPC и холестерин требовали убывающих TBA объемов при температуре выше 35 °C, подтверждая благоприятный растворительный эффект TBA.

Скорость сублимации росла от 4 мкл мин⁻¹ при 10% TBA до более 10 мкл мин⁻¹ выше 60% TBA, атрибутируемая более высокому насыщенному парциальному давлению и более тонким иголообразным ледовым кристаллам, наблюдаемым в оптической микроскопии.

Физикохимические изменения после лиофилизации

DSC показал сдвиг пика плавления GA к более низким температурам по мере снижения TBA содержания, в то время как XRD подтвердил полную потерю кристаллических пиков, указывая на аморфное состояние. FTIR спектры остались неизменными, доказывая химическую стабильность. Аморфизация усилила водную растворимость от 6,36 мкг мл⁻¹ (сырой) до 19–64 мкг мл⁻¹ в зависимости от TBA соотношения.

Однофакторный скрининг

Оптимальные SPC (480 мг), холестерин (120 мг) и TBA (50%) идентифицированы на основе наивысшего комбинированного балла EE и среднего диаметра.

Бокс-Бенкен оптимизация

Используя SPC, холестерин и TBA как независимые переменные, модель предсказала оптимальные условия: 508 мг SPC, 151 мг холестерина, 55% TBA, давая EE = 68,55% и средний диаметр = 220 нм. Графики взаимодействия подтвердили синергетические эффекты.

Выбор лиопротектанта

Трегалоза превзошла лактозу, сахарозу и маннитол. Соотношение трегалоза/SPC 4:1 максимизировало EE (74,87%) и минимизировало размер частиц (191 нм), с превосходной защитой при циклах заморозка-разморозка.

Передающая электронная микроскопия

Изображения показали начальную гидратацию с дисперсным GA и липидными фрагментами, эволюционирующую в равномерные, ~200 нм сферические липосомы с билипидной оболочкой и заключенным лекарством.

Стабильность

Через 6 месяцев при 25 °C EE оставалась 72,82% и диаметр 198 нм, указывая на надежную физическую стабильность.

In-vitro выпуск

Обе среды PBS и физиологический раствор демонстрировали устойчивый выпуск: 65,25% и 69,46% GA выпущено за 12 ч, с быстрой начальной фазой, следующей плато, подтверждая устойчивое освобождение.

Клеточное улавливание

Улавливание HepG2 увеличилось от 1480 нг мл⁻¹ белка при 30 мин до 2030 нг мл⁻¹ при 240 мин, с флуоресцентной микроскопией, подтверждающей время-зависимую интернализацию.

Заключение

Эта работа демонстрирует, что метод лиофилизации монофазного раствора, связанный с Бокс-Бенкена дизайном и трегалозой лиопротектантом, производит GA-загруженные липосомы с высокой эффективностью инкапсуляции (74,87%), малым размером частиц (191 нм) и устойчивым выпуском за 12 ч. Метод дает стабильный сухой порошок, подходящий для крупномасштабного производства, и предлагает перспективную платформу для доставки гидрофобных терапевтиков.

Аббревиатуры

BBD

Бокс-Бенкен дизайн

DSC

Дифференциальное сканирующее калориметрия

EE

Эффективность инкапсуляции

FTIR

Фурье-трансформ инфракрасная спектроскопия

GA

Глицирретиновая кислота

MD

Средний диаметр

SPC

Соевый фосфатидилхолин

TBA

Терт-бутиловый спирт

TEM

Передающая электронная микроскопия

XRD

Рентгеновское дифракционное анализ