Полимерные мицеллы для доставки олеаноловой кислоты: повышенная растворимость и доказанная антиморщинная эффективность

Аннотация

Олеанловая кислота использовалась только как вспомогательное средство в косметических продуктах. Цель исследования — показать эффект олеанловой кислоты как активного ингредиента для сглаживания морщин у людей и разработать формулировку полимерных мицелл, позволяющую малорастворимой олеанловой кислоте использоваться как основной ингредиент в косметических продуктах для уменьшения морщин. Растворимость олеанловой кислоты оценивали в солубилизаторах, ПАВ и полимерах. Размеры и формы частиц полимерных мицелл с олеанловой кислотой изучали электрофоретным световым рассеянием и криогенной сканирующей электронной микроскопией. Эффективность инкапсуляции и проникновение в кожу измеряли ВЭЖХ. Стабильность полимерных мицелл, хранившихся при 40 °C в течение 3 месяцев, оценивали визуальным наблюдением, измерением размера частиц и содержанием олеанловой кислоты. Полимерные мицеллы в виде ампул конечного продукта наносили вокруг глаз 23 женщинам в течение 8 недель. Пять параметров кожи оценивали оптической профилометрией каждые 4 недели в течение 8 недель. Кроме того, специалисты проводили визуальное наблюдение кожи и исследование раздражения кожи. Полимерные мицеллы олеанловой кислоты с размером частиц менее 100 нм были приготовлены с использованием Capryol 90® и полоксамера. Скорость проникновения олеанловой кислоты в полимерных мицеллах была выше, чем в других растворах из олеанловой кислоты, диспергированной в двух разных ПАВ. Никаких значимых изменений в размере частиц, цвете или содержании олеанловой кислоты не наблюдалось, и полимерные мицеллы, хранившиеся при 40 °C в течение 3 месяцев, не подвергались фазовому разделению. После 8 недель применения раздражение кожи не развивалось, и все пять параметров, оцененных оптической профилометрией, а также визуальные оценки были значительно улучшены. Это исследование показало, что полимерные мицеллы олеанловой кислоты, приготовленные в этом исследовании, были стабильны и эффективны в сглаживании морщин у людей как основной активный ингредиент. Основываясь на этих результатах, ожидается, что полимерные мицеллы олеанловой кислоты могут быть широко использованы в косметических приложениях.

Введение

Старение кожи включает провисание (лаксность), утончение и морщины. Оно может ускоряться инфекциями, курением, УФ-излучением, травмами, гормональным дисбалансом, стрессом и/или прооксидантами, такими как гидролазы, включая эластиназу или коллагеназу [1]. Реактивные формы кислорода или свободные радикалы, генерируемые упомянутыми причинами, повреждают соседние клетки и приводят к снижению эластичности кожи и утончению [2, 3]. Особенно УФ-известно, что УФ-свет запускает генерацию реактивных форм кислорода, которые повреждают мембранные липиды, клеточные белки и ДНК, и тем самым ускоряют развитие мимических морщин, веснушек и мелазмы [1-4]. Олеанловая кислота — эффективный компонент природного растительного происхождения, извлекаемый из нескольких видов растений и используемый как основной медицинский и косметический ингредиент. Она также содержится в фруктах, таких как яблоки или груши [5]. Как вид гидроксипентациклического терпена, олеанловая кислота была впервые изолирована из листьев оливки (Olea europaea) и широко встречается в растениях, включая восточноазиатскую свертию (Eugenia jambos) и желтую гентьяну (Gentiana lutea). Она способствует антиэйджинг-функциям через синтез не только проколлагена, важного для синтеза коллагена, но также керамидов и филлагрина, а также за счет ингибирования активности MMP-1, фермента, разрушающего белки, такие как коллаген [5, 6]. На основе этих выводов можно предположить, что олеанловая кислота имеет двойной антиэйджинг-эффект, не только способствуя производству коллагена, но и предотвращая его деградацию [7]. В результате олеанловая кислота является очень перспективным антиэйджинг-ингредиентом для косметических продуктов. Однако использование олеанловой кислоты в косметических продуктах как основного ингредиента ограничено ее плохой водной растворимостью; поэтому только небольшие количества олеанловой кислоты как часть эмульгированной формулировки использовались как вспомогательный ингредиент в косметических продуктах [8]. Ее физико-химические свойства, связанные с кожным поглощением, включают температуру плавления, молекулярный вес, коэффициент распределения и гидрофильность. Ее температура плавления выше 300 °C, что указывает на то, что это высококристаллический материал. Высококристаллические материалы требуют больше энергии для растворения, показывают плохую биодоступность из-за ограниченной растворимости и поэтому плохо поглощаются [9]. Кроме того, известно, что высоко гидрофильные или липофильные соединения, или соединения с высоким молекулярным весом не легко проникают через кожу [10, 11]. Наиболее часто используемый метод улучшения кожного проникновения таких молекул — синтез предшественников или использование коллоидных носителей лекарств. В этом контексте липосомы, эмульсии и полимерные мицеллы активно изучались [12].

Полимерные мицеллы — это самоорганизующиеся наноразмерные агрегаты, формирующие ядро-оболочку структуры в водном растворе. Полимерные мицеллы часто делают из диблок- или триблок-кополимеров, которые могут образовывать гидрофобное внутреннее ядро и гидрофильную внешнюю оболочку [13, 14]. Полимерные мицеллы считаются более физически стабильными, чем ПАВ мицеллы, поскольку свойства полимерных мицелл варьируются в зависимости от типа и соотношения полимерных мономеров в блок-кополимере и имеют относительно низкие критические мицеллообразовательные концентрации [15, 16].

В этом исследовании мы приготовили полимерные мицеллы олеанловой кислоты и оценили их размер и форму частиц, а также получившуюся эффективность инкапсуляции и скорость кожного проникновения олеанловой кислоты. Физическая стабильность олеанловой кислоты в этой форме также оценивалась в течение 3 месяцев. Антиморщинный эффект олеанловой кислоты в реальной косметической формулировке также изучался на людях.

Материалы и методы

Материалы

Олеанловая кислота, Tween 80, Tween 20 и Tween 60 приобрели у TCI (Токио, Япония). PEG 400, Pluronic F127 и Pluronic F68 получили от BASF (Людвигсхафен, Германия). Пропиленгликоль, PEG 300 и PEG 200 получили от JUNSEI (Токио, Япония). TRANSCUTOL P, LABRASOL, LAUROGLYCOL FCC, LABRAFAC, Capryol® 90 и Capryol™ PGMC приобрели у Gattefossé (Лион, Франция). Диэтилдитиокарбамат натрия (Daejung Chemical & Metals Co., Ltd., Сихун, Корея), аллантоин (Sigma Aldrich, Сент-Луис, США), дипропиленгликоль (Daejung Chemical & Metals Co., Ltd., Сихун, Корея), пропандиол (DuPont Tate & Lyle Bio Products Company, LLC, Лаудон, США), карбомер (The Lubrizol Corporation, Огайо, США), PEG/PPG/полибутиленгликоль-8/5/3 глицерин (NOF Corporation, Токио, Япония), гиалуронат натрия (TCI, Токио, Япония), бета-глюкан (SK Bioland, Чонан, Корея), феноксиэтанол (Daejung Chemical & Metals Co., Ltd., Сихун, Корея), каприлилгликоль (J TWO K BIO CO., Ltd., Чонджу, Корея) и этилгексилглицерин (J TWO K BIO CO., Ltd., Чонджу, Корея) использовали для приготовления косметического продукта, содержащего олеанловую кислоту. Ацетонитрил ВЭЖХ грейда получили от Burdick & Jackson (Маскегон, США). Использовали тройную дистиллированную воду, а остальные растворители и реагенты были ЭП и ГР грейда. Бесшерстные самки мышей Crlori:SKH1-hr приобрели у OrientBio (Сонгнам, Корея).

ВЭЖХ анализ

Олеанловая кислота анализировали с помощью Shimadzu LC-30 серии ВЭЖХ (Shimadzu Corporation, Киото, Япония). Использовали аналитическую колонку Kromasil 100 C18 250 мм × 4,6 мм, 5 мкм (Teknokroma, Барселона, Испания) при комнатной температуре. Мобильная фаза состояла из ацетонитрила и воды (85:15, об/об), скорость потока 1 мл/мин, объем инъекции 10 мкл. Олеанловая кислота анализировалась на УФ λ = 210 нм. Все измерения проводили при комнатной температуре [17].

Исследование растворимости и оптимизации формулировки

Измеренное количество олеанловой кислоты добавляли к солубилизатору, перемешивали при 60 °C в течение 48 ч и ультразвуковы обрабатывали 5 мин ультразвуковым очистителем. Суспензию центрифугировали при 2000 об/мин с помощью универсальной центрифуги Universal 320R (Hettich, Тюттлинген, Германия), а supernatант затем собирали. Затем supernatант фильтровали через 0,45 мкм PVDF мембранный фильтр (Whatman, Кент, Великобритания). Растворимость олеанловой кислоты в соответствующем солубилизаторе оценивали вычитанием веса оставшихся твердых тел из суммы начальных весов олеанловой кислоты и солубилизатора (таблица 1).

Исследование оптимизации формулировки проводили с использованием полоксамера 188, полоксамера 407, Tween 60 и Tween 80. Различные соотношения амфифильных полимеров и ПАВ пробовали, как суммировано в таблице 2. Каждое из олеанловой кислоты и Capryol® 90 взвешивали, нагревали и перемешивали при более 60 °C до наблюдения прозрачных растворов. Полимеры/ПАВ, показанные в таблице 2, затем добавляли к прозрачному раствору и перемешивали при более 60 °C до наблюдения прозрачных растворов. Растворы затем диспергировали в дистиллированной воде (рис. 1). Полученный раствор оставляли примерно на 48 ч, а затем проводили визуальный осмотр для выбора оптимальной формулировки. Результаты визуальных осмотров каждой формулировки в таблице 2, включая наблюдения осаждения, фазового разделения, прозрачности и гелирования, суммированы в таблице 3.

Приготовление полимерных мицелл олеанловой кислоты

Полимерные мицеллы олеанловой кислоты (PMO) приготовляли с использованием формулировок G и H в таблице 2 по методу, показанному на рис. 1. PMO-G и PMO-H использовали для последующих экспериментов и PMO-H в косметических продуктах для клинических испытаний.

Тест на окрашивание

Полимерная мицеллизация, когда формулировка G или H диспергировалась в воде, подтверждалась визуальным наблюдением, то есть прозрачностью. Формирование PMO (PMO-G или PMO-H) также подтверждалось тестом на окрашивание. Метеновый синий добавляли к смесям воды и Capryol® 90, воде, Capryol® 90, PMO-G и PMO-H, и цвет растворов визуально наблюдали и фотографировали.

Измерение размера частиц

Метод ELS (электрофоретное световое рассеяние) измеряет флуктуации интенсивности рассеяния от частиц как функцию времени, когда частицы демонстрируют как случайное броуновское движение, так и ориентированное электрофоретное движение в четко определенном электрическом поле. Электрофоретная подвижность частиц измеряется методом ELS [18] и позволяла оценить размер частиц как PMO-G, так и PMO-H с помощью электрофоретного светового рассеяния спектрофотометра (ELS-Z, Photal, Otsuka Electronics, Япония).

Криогенная сканирующая электронная микроскопия (Cryo-SEM) анализ

Криогенная сканирующая электронная микроскопия или сканирующая электронная криомикроскопия (cryo-SEM) — мощная техника для визуализации состояния микроструктуры или наноструктуры коллоидных полимерных суспензий или дисперсий после их иммобилизации быстрой заморозкой и разлома для изображения. Разлом делают и изучают при −196 °C, нормальной точке кипения жидкого азота и далеко ниже температуры стекловидного перехода как объемных, так и полностью коалесцированных частиц. Cryo-SEM изображения раскрывают диапазон ответов частиц на разломы, распространяющиеся мимо них через лед [19]. Сканирующая электронная криомикроскопия (Tescan Mira 3 LMU FEG/Quorum Technologies PP3000T Cryo-SEM Sample Preparation System) использовалась для наблюдения формы PMO.

Эффективность инкапсуляции

Эффективность инкапсуляции полимерных мицелл олеанловой кислоты оценивали. PMO центрифугировали при 2000 об/мин в течение 15 мин, supernatант собирал и анализировал ВЭЖХ. Эффективность инкапсуляции рассчитывалась как количество олеанловой кислоты в полимерных мицеллах, деленное на количество олеанловой кислоты, изначально добавленной (мг) при приготовлении PMO.

Стабильность PMO-H

Физическая стабильность PMO-H оценивали хранением при 40 °C в течение 3 месяцев. Изменения цвета, фазовое разделение, наличие осадка и изменения мутности визуально оценивали. Образцы PMO-H, взятые через регулярные интервалы времени, анализировали ВЭЖХ для определения количества оставшейся олеанловой кислоты и ELS-Z для определения размера частиц PMO-H. Результаты представлены на рис. 9.

In vitro тест кожного проникновения

In vitro исследование кожного проникновения проводили с использованием диффузионной ячейки Франца для изучения усиления кожного проникновения олеанловой кислоты. Тест проводили на PMO-G, PMO-H, смеси олеанловой кислоты и Tween 80, диспергированной в дистиллированной воде, и смеси олеанловой кислоты и пропиленгликоль, диспергированной в дистиллированной воде. Кожу 6-недельной самки бесшерстной мыши резали на куски требуемого размера. Вертикальные ячейки Франца использовали, и кожу фиксировали между двумя камерами со стратным слоем, обращенным вверх. 330 мкл выбранной формулировки наносили на кожу, а ячейки Франца закрывали парафилмом. Рецептор заполняли раствором PBS (pH 7,4) и этанолом в соотношении 9:1 (об/об). Рецепторный раствор пополняли свежим раствором PBS в каждый момент отбора проб. Пробу отбирали в 2, 4, 6, 8, 10, 20 и 24 ч и анализировали ВЭЖХ. Через 24 ч излишки формулировки, оставшиеся на коже, удаляли салфетками Kimwipes (Kimberly-Clark professional, NSW, Австралия). Кожу, использованную в исследовании проникновения, очищали раствором PBS, а олеанловая кислота, оставшаяся в коже, измерялась ВЭЖХ. Все эксперименты по проникновению проводили в триplicates.

Статистика исследования

Эксперименты проводили в трех независимых повторениях, и результаты этого исследования сообщали как среднее ± SD. Статистический анализ проверяли независимым t-тестом, и значение p < 0,05 считалось статистически значимым.

Подготовка ампулы с PMO-H

Для клинического теста PMO-H использовали как тестовый продукт. PMO-H, очищенную воду, диэтилдитиокарбамат натрия, аллантоин, дипропиленгликоль, пропандиол, карбомер и PEG/PPG/полибутиленгликоль-8/5/3 глицерин добавляли и перемешивали 10~15 мин с помощью магнитного перемешивателя, а затем гидроксид калия добавляли и смесь перемешивали еще 5~10 мин. После однородного смешивания ингредиентов, гиалуронат натрия и бета-глюкан добавляли и перемешивали еще 2~5 мин, а затем феноксиэтанол, пропандиол, каприлилгликоль и этилгексилглицерин добавляли и перемешивали 2~5 мин. Финальную формулу наполняли в ампулу как тестовый продукт. Пузырьки воздуха в ампуле удаляли с помощью вакуумной сушильной печи перед тестом. Контроль приготовляли следующим тем же методом для тестового продукта, за исключением того, что олеанловая кислота исключалась.

Тесты применения на людях

Исследование раздражения кожи человека

Тест-накладка косметического продукта, содержащего PMO-H в ампуле, проводили на 25 мужчинах и женщинах в возрасте 22-56 лет, согласившихся участвовать в тесте раздражения кожи. Каждое тестовое вещество капали на верхнюю руку и фиксировали накладкой. Накладку держали 24 ч, а степень стимуляции наблюдали 2 специалистами через 30 мин, 24 ч и 48 ч после снятия накладки согласно критериям Международной исследовательской группы контактного дерматита (ICDRG).

Клиническое испытание на улучшение морщин

Полимерные мицеллы, содержащие олеанловую кислоту в ампуле как конечную форму продукта, наносили вокруг глаз 23 женщинам в возрасте 30-65 лет, согласившимся участвовать в тесте улучшения морщин. Испытуемые соответствовали критериям включения и ни одного из критериев исключения и согласились участвовать в тесте применения на людях. Двойной слепой метод следовали как исследователи, так и испытуемые. Тест проводили 8 недель, а оценка выполнялась каждые 4 недели. Двойной слепой метод и случайное распределение использовали. Тестовый продукт и контроль наносили отдельно случайно либо на левую, либо на правую сторону лица одного и того же испытуемого. Пять параметров оценивали оптической профилометрией с помощью Skin Visiometer SV 700 (Courage + Khazaka electronic GmbH, Кёльн, Германия) каждые 4 недели в течение 8 недель — средняя шероховатость (R3) была первичной конечной точкой, а четыре параметра шероховатости кожи (R1), максимальной шероховатости (R2), глубины гладкости (R4) и арифметической средней шероховатости (R5) были вторичными конечными точками. Увеличения или уменьшения пяти параметров на одной и той же области испытуемого измеряли во времени, и средние значения увеличения или уменьшения пяти параметров рассчитывали и сравнивали между лечением тестовым продуктом и контролем. Кроме того, визуальное наблюдение кожи проводили специалистами. Фотографии глазных морщин делали с помощью Janus 1 Mark II (PIE Co., Ltd., Сувон, Корея). Критерии, используемые для определения визуальных оценок, показаны на рис. S1, а визуальные результаты представлены на рис. 13. Параметры сравнивали и анализировали с помощью парного t-теста при надежности 95% [20-25].

Результаты и обсуждение

Определение солубилизатора, ПАВ и полимера

Растворимость олеанловой кислоты в биосовместимых солубилизаторах, в частности ПАВ и полимерах, показана в таблице 1. Олеанловая кислота склонна растворяться в гидрофобных маслах с низким гидрофильно-липофильным балансом (HLB). Capryol® 90 имеет слегка более высокое значение HLB по сравнению с обычными маслами [26]. Однако олеанловая кислота показывает относительно высокую растворимость в Capryol® 90. Кроме того, Capryol® 90 может быть легко стабилизирован как внутреннее ядро мицелл [27]. После выбора Capryol® 90, несколько типов ПАВ или полоксамеров отбирали для оболочечной части мицелл олеанловой кислоты [27-30]. Композиции мицелл олеанловой кислоты, показанные в таблице 2, — это те, которые были прозрачными сразу после разбавления дистиллированной водой. Однако некоторые композиции были нестабильны и подвергались осаждению, фазовому разделению или гелированию в течение 24 ч. Представительные изображения осажденного, фазово разделенного, прозрачного жидкого и гелевого состояний показаны на рис. 2. Финальное состояние каждой формулы суммировано в таблице 3. Композиции G и H оставались прозрачными даже через 24 ч. Хотя композиция I оставалась прозрачной, она была гелем, а не жидкостью. Композиции A-D становились непрозрачными с осадком через 24 ч. Учитывая эти результаты, композиции G и H выбрали для дальнейшей разработки.

Характеристики полимерных мицелл олеанловой кислоты

Структуры полимерных мицелл олеанловой кислоты изучали тестом на окрашивание. На рис. 3 показаны изображения смеси Capryol® 90 и дистиллированной воды, Capryol® 90, дистиллированной воды и полимерных мицелл композиции G (PMO-G) и композиции H (PMO-H) после добавления метенового синего в раствор. Четкое фазовое разделение произошло для смеси Capryol® 90 и дистиллированной воды. Осаждение метенового синего наблюдалось в случае Capryol® 90. Дистиллированная вода стала темно-синей после добавления метенового синего. PMO-G и PMO-H также стали синими, что указывает на то, что полимерные мицеллы состояли из масляной фазы внутреннего ядра и водной фазы внешней оболочки. Другими словами, амфифильный полимер, полоксамер 407 в композициях G и H, служит внешней оболочкой и помогает успешно формировать полимерные мицеллы олеанловой кислоты, инкапсулируя внутреннее ядро Capryol® 90, содержащее олеанловую кислоту [31].

Размер частиц, распределение размера и форма могут быть хорошими индикаторами для прогнозирования физической стабильности мицеллярных формулировок. Средний размер частиц PMO-G составлял 80,4 нм, а PMO-H — 57 нм (рис. 4). Гистограммы PMO-A, G и H показаны на рис. 5 для сравнения распределений размеров, влияемых фазовым состоянием. Как показано в таблице 3, PMO-A непрозрачен из-за осадка, а PMO-G и H прозрачны. Размер частиц PMO-A более 100 нм, и PMO-A показывает более широкое распределение размеров, чем PMO-G и H (рис. 5). PMO-H показывает более узкое распределение размера частиц, чем PMO-G, и демонстрирует текучесть, подходящую для косметических продуктов.

Эффективность инкапсуляции для PMO-G и PMO-H составляла 99-100%, что указывает на то, что почти 100% олеанловой кислоты была инкапсулирована во внутреннем ядре PMO (рис. 6).

Форма PMO-G и PMO-H изучали сканирующей электронной криомикроскопией (Cryo-SEM). Cryo-SEM показал, что PMO-G и PMO-H были сферическими полимерными мицеллами. Однако PMO-H полимерные мицеллы были более последовательны в размере и форме, чем PMO-G полимерные мицеллы (рис. 7).

In vitro исследование кожного проникновения PMO

Общее количество олеанловой кислоты, оставшейся в коже, и общее количество олеанловой кислоты, проникшей сквозь кожу как функция времени, измеряли используя кожу 6-недельной самки бесшерстной мыши. Четыре различные формулировки, PMO-G, PMO-H, смесь олеанловой кислоты и Tween 80, диспергированная в дистиллированной воде (OTw), и смесь олеанловой кислоты и пропиленгликоль, диспергированная в дистиллированной воде (OPG), сравнивали в терминах эффективности кожного проникновения олеанловой кислоты. Общие количества олеанловой кислоты, проникшей сквозь кожу через 24 ч, составляли 29,49 ± 4,00% для PMO-H, 21,39 ± 5,91% для PMO-G, 13,66 ± 0,81% для OTw и 5,90 ± 2,47% для OPG. Как показано на рис. 7, первое обнаружение олеанловой кислоты в случае PMO-G и PMO-H было возможно в 8 ч, в то время как первое обнаружение олеанловой кислоты в OTw было возможно в 10 ч, и OPG в 20 ч. Доли олеанловой кислоты, оставшейся в коже, составляли 56,22 ± 13,50% для PMO-H, 36,74 ± 0,72% для PMO-G, 27,44 ± 7,02% для OTw и 26,28 ± 5,42% для OPG. PMO-H показал наибольшее количество как проникшей сквозь кожу олеанловой кислоты, так и оставшейся в коже олеанловой кислоты (рис. 8). Эти результаты указывают на то, что PMO могут проникать быстрее и больше, чем формулировки, не формирующие мицеллы.

Стабильность жидких полимерных мицелл олеанловой кислоты

На основе характеристик и in vitro исследований проникновения, PMO-H был окончательно выбран для подготовки ампулы. Перед подготовкой ампулы стабильность PMO-H оценивали. Для исследования стабильности PMO-H хранили в флаконах под ускоренными условиями стабильности при 40 °C/75% RH в течение 3 месяцев. Осаждение, фазовое разделение, изменения цвета и прозрачность затем визуально оценивали. Доля олеанловой кислоты затем измеряли ВЭЖХ, а изменения размера частиц также проверяли во времени. Стабильность проверяли во времени. PMO-H оставался прозрачным без осадка или фазового разделения, и его цвет не менялся в течение 3 месяцев под ускоренными условиями стабильности. Доля олеанловой кислоты, измеренная ВЭЖХ, и изменения размера частиц во времени показаны на рис. 9. Доля олеанловой кислоты оставалась более 98%, а размер частиц 49,6 ± 5 нм оставался почти постоянным в течение 3-месячного периода исследования стабильности. Эти результаты показывают, что PMO-H физически и химически стабилен в течение 3 месяцев под ускоренными условиями стабильности.

Клиническое испытание

Тест раздражения человека

Перед клиническим испытанием проводили тест раздражения человека на 25 здоровых волонтерах женщин и мужчин в возрасте 22-56 лет. Тестовый продукт наносили накладкой на верхнюю руку испытуемых на 24 ч, а индекс раздражения кожи измеряли через 30 мин, 24 ч и 48 ч после снятия накладки. Раздражение не наблюдалось с косметической ампульной формулой, содержащей PMO-H, через 1 ч или 48 ч после снятия накладки.

Клиническое испытание

Клиническое испытание проводили на 23 женщинах в возрасте 30-65 лет с морщинами вокруг глаз; исключая 3 отсева, 20 испытуемых завершили испытание, нанося отдельно и тестовый продукт, ампулу PMO-H, и контроль либо на левую, либо на правую сторону лица в течение 8 недель. Изменения кожи оценивали по пяти параметрам — средняя шероховатость (R3) как первичная конечная точка, и четыре дополнительных параметра как вторичные конечные точки, а именно шероховатость кожи (R1), максимальная шероховатость (R2), глубина гладкости (R4) и арифметическая средняя шероховатость (R5). Визуальная оценка добавила еще одну вторичную конечную точку. Результаты суммированы в таблице 4.

Первичная конечная точка R3 уменьшилась на 0,673% через 4 недели использования тестового продукта и статистически значимо на 7,835% через 8 недель использования (p = 0,006). С применением контроля R3 увеличилась на 5,127% через 4 недели использования и статистически значимо на 9,971% через 8 недель использования (p = 0,010). Разница в значении R3 между областями, обработанными тестовым продуктом и контролем, была статистически значимой через 8 недель использования (p = 0,000), но не статистически значимой через 4 недели использования, возможно, из-за межсубъектной вариации (рис. 10).

Анализ вторичной конечной точки R1 показал, что значение уменьшилось на 4,629% через 4 недели использования тестового продукта и статистически значимо на 9,973% через 8 недель использования (p = 0,017). С применением контроля R1 увеличилось на 8,037% через 4 недели использования и 4,799% через 8 недель использования. Разница в значениях R1 между областями, использующими тестовый продукт и контроль, не была статистически значимой через 4 недели использования, но была через 8 недель использования (p = 0,024). Вторичная конечная точка R2 уменьшилась на 1,048% через 4 недели использования тестового продукта и 5,803% через 8 недель. С применением контроля она увеличилась на 7,261% через 4 недели и 9,536% через 8 недель. Разница в значении R2 между областями, обработанными тестовым продуктом и контролем, была статистически значимой через 8 недель использования (p = 0,016), но не через 4 недели. Вторичная конечная точка R4 статистически значимо уменьшилась на 8,594% (p = 0,039) через 4 недели использования тестового продукта и на 9,747% через 8 недель использования. С контролем R4 увеличилось на 10,764% через 4 недели использования и 3,491% через 8 недель использования. Интересно, что разница в значении R4 между областями, использующими тестовый продукт и контроль, была статистически значимой через 4 недели использования (p = 0,008), но не через 8 недель. Вторичная конечная точка R5 уменьшилась на 6,333% через 4 недели использования тестового продукта и 8,556% через 8 недель использования. Разница в значении R5 между областями использования тестового продукта и контроля не была статистически значимой ни после 4, ни после 8 недель использования.

Анализ дополнительной вторичной конечной точки, визуальной оценки морщин, показал, что визуальная оценка уменьшилась на 2,917% через 4 недели использования тестового продукта и статистически значимо уменьшилась на 8,333% через 8 недель использования (p = 0,034). С применением контроля визуальная оценка увеличилась на 1,667% через 4 недели и 4,167% через 8 недель. Разница визуальной оценки между областями, обработанными тестовым продуктом и контролем, была статистически значимой через 8 недель использования (p = 0,046), но не через 4.

Подводя итог, анализ морщинистой области вокруг глаз показал, что разница в значении первичной конечной точки R3 между областями, обработанными тестовым продуктом и контролем, была статистически значимой через 8 недель использования. В терминах вторичных конечных точек, все значения уменьшились после использования тестового продукта и увеличились после использования контроля. Разница в значениях R4 между областями, обработанными тестовым продуктом и контролем, была статистически значимой через 4 недели использования, но разница значений R1 и R2 была статистически значимой только через 8 недель использования (рис. 11). Визуальная оценка специалистами показала, что все средние визуальные оценки морщин уменьшились через 4 и 8 недель лечения тестовым продуктом по сравнению с контролем (таблица 5). Разница в визуальной оценке между областями, обработанными тестовым продуктом и контролем, была статистически значимой через 8 недель использования (рис. 12). В целом, согласно всем конечным точкам, косметическая формула, содержащая PMO-H как основной ингредиент, помогала улучшать морщины через 8 недель использования (рис. 13).

Заключения

ПАВ обычно используются как вспомогательные вещества в косметических продуктах для улучшения растворимости плохо растворимых материалов. Одно предостережение — количество, включаемое в продукт. ПАВ должны добавляться в достаточном количестве для растворения плохо растворимых материалов без осадка. Только минимальное количество должно добавляться по соображениям безопасности. Мицеллярная формулировка может быть решением этой проблемы. Полимерные мицеллы олеанловой кислоты, разработанные в этом исследовании, улучшают растворимость олеанловой кислоты с минимальным количеством ПАВ и усиливают проникновение олеанловой кислоты через кожу. Стабильные полимерные мицеллы олеанловой кислоты были разработаны с использованием Capryol 90 и полоксамера. Полимерные мицеллы олеанловой кислоты, разработанные в этом исследовании, были стабильны, то есть они не показывали никакого осадка, фазового разделения или деградации при 40 °C через 3 месяца. Клиническое испытание показало, что как основной активный ингредиент, олеанловая кислота в полимерной мицеллярной формулировке эффективна для сглаживания человеческих морщин. Основываясь на этих выводах, можно заключить, что олеанловая кислота, которая плохо растворима в воде и поэтому непригодна в нативной форме как основной ингредиент для сглаживания кожных морщин, может быть сформулирована в применимые полимерные мицеллы. Кроме того, ожидается, что полимерные мицеллы олеанловой кислоты, разработанные в этом исследовании, окажутся очень полезными для сглаживания человеческих морщин и будут широко применимы в косметических приложениях.