Наномицеллы эмодина, загруженные в стеарат-графтированный хитосанилолигосахарид: дизайн, характеристика и антиопухолевая активность

Аннотация

Цель этого исследования — приготовить и охарактеризовать эмодин-загруженные стеарат-графтированные хитосанилолигосахарид (CSO-SA/EMO) и оценить их антиопухолевую активность in vitro. В этом исследовании стеарат-графтированный хитосанилолигосахарид использовался как носитель, и его физикохимические свойства определялись разными методами. Поведение клеточного захвата изучалось с использованием FITC-маркированного стеарат-графтированного хитосанилолигосахарида. CSO-SA/EMO готовился ультразвуковой диализацией. Размер частиц, поверхностный потенциал, эффективность инкапсуляции и поведение выпуска препарата изучались in vitro. Эффекты CSO-SA/EMO на клетки желудочного рака изучались с помощью MTT анализа и потоковой цитометрии. Результаты показали, что размер частиц CSO-SA/EMO был больше, а потенциал меньше, чем у стеарат-графтированного хитосанилолигосахарида. 12-часовое мицеллярное поглощение клетками MGC803 и BGC823 было достаточным, и мицеллы способны были обильно накапливаться в местах поражений у мышей, тем самым достигая хорошей пассивной EPR таргетизации. MTT и анализ ареста клеточного цикла показали, что CSO-SA/EMO значительно усилили антиопухолевую активность по отношению к клеткам MGC803 и BGC823 по сравнению с свободным эмодином. Объем опухоли, гемоксилин-эозиновое окрашивание и терминальная деоксинуклеотидтрансфераза dUTP никельный маркерный анализ (TUNEL) доказали, что CSO-SA/EMO имели значительный антиопухолевой эффект на опухолевые ткани in vivo. В заключение, ультразвуково-диализационный метод предоставил простой и эффективный метод для приготовления CSO-SA/EMO. Доставка эмодина с использованием мицеллярной системы эффективно улучшила его антиопухолевые эффекты.

Введение

Эмодин (EMO) — это натуральный производное антрахинона, которое в основном экстрагируется из традиционных китайских трав, таких как ревень, полигонакус и мультифлорум. Традиционная китайская медицина (ТКМ) широко используется в клинических исследованиях из-за своей низкой токсичности, малого числа побочных эффектов и низкой стоимости [1].

Исследования показали, что EMO обладает широкой фармакологической активностью, включая иммуносупрессию, антитуссивное, антигипертензивное, противовоспалительное, антибактериальное и антираковое действие. Обнаружено, что EMO ингибирует рост раковых клеток [2,3,4] и регулирует связанные гены для контроля апоптоза опухолевых клеток, туморогенеза, пролиферации клеток, инвазии и метастазирования [5,6,7,8,9]. Исследования показали, что EMO может ингибировать различные раковые клетки, такие как человечные колиоректальные аденокарциноматозные клетки, гепатоцеллюлярные карциноматозные клетки, лимфоидные лейкемические клетки [10] и человечные клетки языкового рака SCC-4 [11]. EMO может ингибировать пролиферацию опухолевых клеток в желудочном, грудном и простатическом раках [7, 12]. Однако EMO не демонстрирует цитотоксических эффектов на нормальные клетки, такие как нормальные человечные гингивальные фибробласты [13], человечные бронхиальные эпителиальные клетки [14] и человечные молочные клетки [15]. Это показывает, что EMO демонстрирует селективную цитотоксичность по отношению к опухолевым клеткам по сравнению с нормальными клетками.

Хитозан, натуральный полисахарид, является деацетилированной формой хитина. Этот натуральный полимер обладает отличной водорастворимостью, биофункциональностью, гемокомпатибельностью и микробной деградируемостью, и известен своими различными биомедицинскими применениями. Мы деградировали высокомолекулярный хитосан (450 кДа) с помощью хитосаназы в кислых условиях для получения низкомолекулярного хитосанилолигосахарида (CSO, 18 кДа). CSO может сильно проникать через клеточные мембраны [16], а стеариновая кислота (SA) может входить в ядро через гликопротеиновый путь. CSO был гидрофобно модифицирован SA с использованием карбодиимида (EDC) как агента сцепления для синтеза амфипатичного стеарат-графтированного хитосанилолигосахарида (CSO-SA).

Хотя EMO обладает обширной биологической активностью, его антрахиноновая структура слабо растворима в воде. Поскольку терапевтические лекарства транспортируются через кровоток, их растворимость напрямую влияет на их абсорбцию и распределение. CSO-SA графты могут самоассемблироваться в водном растворе, образуя наномицеллы, которые гидрофобны внутри и гидрофильны снаружи. Мы диспергировали наномицеллы из собранного состояния с помощью ультразвукового зонда. Поскольку и EMO, и CSO были гидрофобны, EMO инкапсулировался в центре мицелл.

Несколько модельных лекарств применялись к CSO-SA, что требует молекулярного веса, структуры и гидрофобности модельных лекарств. Существующие исследования включают куркумин [17], доксорубицин [18], стират ламивудина [19] и оксалиплатин [20], которые могут значительно улучшить антиопухолевые эффекты. Мы исследовали оптимальные условия загрузки CSO-SA/EMO. CSO-SA/EMO создает новые дозированные формы с более высокой растворимостью и эффективностью использования. CSO-SA/EMO может дать идеи для выбора модельных лекарств или носителей и клинического применения мицелл.

Экспериментальные материалы и методы

Экспериментальные материалы

Самцы голых мышей BALB/C+/nu получены из Центра экспериментальных животных Чжэцзянского университета. Низко дифференцированные линии клеток желудочного рака MGC803 и BGC823 приобретены из банка клеток ATCC. Культуральная среда RPMI-1640 и FBS получены от Hangzhou Holly Leaf Biotechnology Company. EMO, MTT, FITC, Hoechst 33342, DiR, тринитробензол сульфокислота и пирен поставлялись Sigma Aldrich. Чжэцзянский университет предоставил CSO-SA. Другие реактивы приобретены были AR класса.

Определение CMC и ¹H NMR спектров CSO-SA

В этом отчете критическая мицеллярная концентрация (CMC) CSO-SA определялась флуоресцентной спектрофотометрией с использованием пирена в качестве флуоресцентного зонда. Различные концентрации раствора CSO-SA добавлялись в ацетоновый раствор пирена, после чего ацетон испарялся на ночь. Эмиссионные спектры и пиковые значения пирена в растворах CSO-SA различных концентраций анализировались флуоресцентной спектрофотометрией. Первая пика (I₁ = 374 нм) и третья пика (I₃ = 385 нм) спектра записывались. Мы строили логарифмическую концентрацию (Log C) как абсциссу и I₁/I₃ как ординату и рассчитывали CMC для полимерных мицелл.

CSO и CSO-SA растворялись в D₂O при концентрации 10 мг/мл. ¹H NMR спектры записывались, сравнивались и анализировались для характеристических пиков CSO и CSO-SA.

Определение степени замещения аминовой группы

Степень замещения аминовой группы (SD%) определялась методом тринитробензол сульфокислоты (TNBS).

Подготавливались растворы CSO и CSO-SA различных концентраций, после чего последовательно добавляли 4% NaHCO₃ и 0.1% TNBS. После инкубации при 37 °C в течение 2 ч в водяной бане, добавляли 2 моль/л соляную кислоту. Абсорбция измерялась при 344 нм ультрафиолетово-видимой спектрофотометрией через 30 мин ультразвуковой обработки. Стандартная кривая строилась и SD% образца CSO-SA рассчитывался.

Размер частиц и потенциал CSO-SA

Подготавливался 1.0 мг/мл раствор CSO-SA, и мицеллы полностью диспергировались ультразвуковым зондом разрушения клеток. Размер частиц и потенциал CSO-SA определялись анализатором размера частиц и поверхностного потенциала.

Клеточный захват CSO-SA

Растворы FITC и CSO-SA смешивались, перемешивались на ночь и переносились в диализационный мешок. Нереагировавший FITC и абсолютный этанол удалялись диализом с деионизированной водой в течение 24 ч. Наконец, получался раствор FITC-маркированного CSO-SA (FITC-CSO-SA) с концентрацией 1.0 мг/мл.

Клетки MGC803 и BGC823 использовались как мишенные клетки для изучения клеточного захвата CSO-SA. Основываясь на скорости пролиферации клеток, клетки посеивались в 24-колодчатые пластинки и культивировались на ночь до полного адгезирования. 80 мкл раствора FITC-CSO-SA добавлялись в заданную временную точку. Клетки инкубировались с 10 мкл Hoechst 33342 (1 мг/мл) в течение 15 мин для окраски ядра клетки. Захват CSO-SA через FITC-CSO-SA детектировался лазерным сканирующим конфокальным микроскопом.

In Vivo распределение CSO-SA

Распределение CSO-SA in vivo определялось окрашиванием флуоресцентным красителем DiR. Раствор CSO-SA/DiR готовился диализом.

Шестинедельные самцы голых мышей использовались как экспериментальная модель. Голы мыши инокулировали подкожно 1 × 10⁸/мл клетками MGC803. CSO-SA/DiR вводили через хвостовую вену при объеме опухоли примерно 200 мм³. Мыши затем анестезировали в заданные временные точки. Временное распределение CSO-SA/DiR in vivo записывалось с использованием малободного в vivo образателя (диапазон длины волны 580-700 нм, время экспозиции 1000 мс).

Определение концентрации EMO HPLC

Концентрация EMO определялась HPLC. EMO применялся к упакованной колонке Eclipse XDB-C18 (4.6 × 250 мм, 5 мкм) с защитной колонкой (4.6 × 10 мм, 5 мкм). Температура колонки устанавливалась при 30 °C, скорость потока 1.0 мл/мин, длина волны детектирования 254 нм, объем инъекции 20 мкл. Мобильная фаза — метанол/0.1% фосфорная кислота (85:15, v/v). Концентрация EMO наносилась как абсцисса, площадь пика — как ордината. Стандартные кривые EMO строились для определения оптимального линейного диапазона. Все HPLC-инъецируемые образцы фильтровались через 0.45-мкм органический фильтр для защиты колонки.

Приготовление CSO-SA/EMO

В этом исследовании EMO инкапсулировали ультразвуковым зондом. Начальное соотношение формулировки 10% (EMO: CSO-SA, w/w) использовалось как исходная точка. Раствор EMO медленно добавлялся капельно в мицеллярный раствор в ледяной бане. Ультразвуковой зонд затем применялся 20 циклов (400 Вт, работа 2 с, пауза 3 с).

Лекарственно-нагруженные мицеллы переносились в диализационный мешок (MWCO, 3.5 кДа) и диализировались против деионизированной воды 24 ч для удаления этанола из растворителя. Чистый CSO-SA/EMO получался центрифугированием диализата для удаления свободного EMO.

Свойства CSO-SA/EMO (Диаметр частицы, потенциал, TEM, EE%)

Размер частиц и поверхностный потенциал CSO-SA/EMO измерялись анализатором размера частиц и поверхностного потенциала.

0.1 мг/мл раствор CSO-SA/EMO капально наносился на углеродную пленку, покрывающую медную проволоку, окрашивался 2% фосфовольфрамной кислотой и сушился. Морфология и размер частиц CSO-SA/EMO наблюдали передаточной электронной микроскопией.

Эффективность инкапсуляции (EE%) и загрузка лекарства (DL%) CSO-SA/EMO детектировались органическим растворителем экстракции и HPLC. В 200 мкл образца мицеллярного раствора CSO-SA/EMO добавляли 1.8 мл метанола для диспергации мицелл и экстракции лекарства. Концентрация EMO измерялась как C_EMO. Другие 400 мкл мицеллярного раствора CSO-SA/EMO помещали в ультрафильтрационную центрифугированную пробирку и центрифугировали (12 000 об/мин, 5 мин) для получения супернатанта. EE% и DL% рассчитывались по следующим формулам:

$$ EE\% = (10 \times C_{EMO} - C) \times V / M_{EMO} \times 100\% $$

$$ DL\% = (10 \times C_{EMO} - C) \times V / [(10 \times C_{EMO} - C) \times V + M_{CSO-SA}] \times 100\% $$

где C_EMO — концентрация EMO в мицеллах, C — концентрация EMO лекарственно-нагруженных мицелл после ультрафильтрационной центрифуги, V — объем лекарственно-нагруженной мицеллы, подвергшейся диализу, M_EMO — количество EMO, введенное при загрузке лекарства, M_CSO-SA — масса CSO-SA.

Оценка выпуска препарата In Vitro

Выпуск препарата из CSO-SA/EMO изучался с использованием ФСБ (pH 7.2) как среды выпуска. Один миллилитр лекарственно-нагруженного мицеллярного раствора помещали в 3.5 кДа диализационный мешок, запечатанный с обоих концов, затем помещали в соответствующую среду выпуска, содержащую пробирку. Диализационный мешок помещали в 37 °C горизонтальный термостатированный шейкер. Образцы забирали в заданные временные точки и заменяли тем же объемом свежей среды выпуска. Содержание EMO в образцах определялось HPLC, и кумулятивное количество выпущенного EMO рассчитывалось.

Цитотоксичность CSO-SA/EMO

Выживаемость клеток желудочного рака, обработанных CSO-SA/EMO, CSO-SA и EMO, детектировалась MTT анализом. Клетки посеивались в 96-колодчатые пластинки при концентрации примерно 10⁵/мл. CSO-SA/EMO, CSO-SA и EMO добавлялись при различных концентрациях. После инкубации в течение различных временных периодов, 20 мкл рабочего раствора MTT добавлялись. После 4 ч инкубации, 200 мкл DMSO добавлялись и оптическая плотность (OD) раствора при 570 нм измерялась микропластинковым ридером.

Эффект CSO-SA/EMO на клеточный цикл

Клетки двух линий посеивались в 6-колодчатую пластинку при плотности 10⁵/мл. После 12 ч культивирования, CSO-SA, CSO-SA/EMO и EMO добавлялись и инкубировались 24 ч. Клетки затем дигестировались, собирались и промывались. 500 мкл PI окрашивающего раствора затем добавлялись к каждому клеточному образцу, клеточный осадок медленно ресуспендировался, и клетки инкубировались в темноте при 37 °C 30 мин. Красная флуоресценция детектировалась потоковым цитометром при длине волны возбуждения 488 нм. Содержание ДНК анализировалось программным обеспечением FlowJo.

Антиопухолевые эффекты CSO-SA/EMO, оцененные In Vivo и гистологическими анализами

Животноводческие эксперименты проводились согласно Руководству по уходу и использованию животных, Чжэцзянский университет. Клетки MGC803 (1 × 10⁶) инъецировались подкожно в правую переднюю боковину самцов голых мышей в возрасте 5-6 недель. Опухоли позволяли расти до диаметра примерно 5 мм. В этот момент мыши случайно делились на контрольную группу, группу инъекции EMO и группу инъекции CSO-SA/EMO, по 3 животных в каждой группе. Все мыши инъецировали внутривенно соответствующими реактивами через хвостовую вену раз в день в течение 2 недель. Электронный штангенциркуль использовался для измерения длинной (a) и короткой (b) диаметров опухоли (b). Объем опухоли рассчитывался по формуле V = a × b²/2. Масса тела каждой мыши записывалась, после чего опухоли собирались для гистологического анализа. Скорость ингибирования опухоли определялась в опухолевых тканях после гемоксилин-эозинового (HE) окрашивания. Терминальная деоксинуклеотидтрансфераза dUTP никельный маркерный анализ (TUNEL) проводился для детектирования клеточного апоптоза в терминальной илеальной ткани с использованием набора для обнаружения in situ клеточной гибели согласно инструкциям производителя.

Результаты и обсуждение

CMC и ¹H NMR спектры CSO-SA

Амфифильные полимеры самоассемблировались в мицеллы в гидрофильной среде. Ниже CMC приводило к большему формированию мицелл. Это было полезно для поддержания структуры мицелл после внутривенного введения. Когда CSO-SA формировал мицеллы, флуоресцентный зонд пирен мог легко входить в гидрофобное ядро мицелл, увеличивая интенсивность флуоресценции заряженного пирена, что увеличивало интенсивность эмиссионного спектра. В этот момент I₃ увеличивалось значительно быстрее, чем I₁, следовательно, отношение интенсивности флуоресценции I₁/I₃ резко уменьшалось. Значительная точка изгиба могла быть замечена на графике I₁/I₃ и значениях Log C (рис. 1). Расчеты точки изгиба показали, что CMC составлял 179.02 мкг/мл. Чем меньше CMC, тем сильнее способность формировать мицеллы и тем сильнее сопротивление разбавлению, что улучшало защиту структуры мицелл после внутривенного введения.

Вариация отношения интенсивности флуоресценции (I₁/I₃) против логарифма концентрации CSO-SA.

EDC использовался как агент перекрестного сцепления для реакции с карбоксильной группой SA и формирования активного промежуточного -OO-ацил изоуреа производного. Это может реагировать с первичной аминовой группой CSO для формирования амидной связи. Структура CSO-SA определялась и подтверждалась на основе протонного ядерно-магнитного резонансного спектра. ¹H NMR (400 МГц, D₂O) δ 1.06 (m, CH₂), 1.02 (m, CH₃) соответствуют метilenовому протону и метиловому протону SA соответственно.

Степени замещения аминовой группы

SD% CSO-SA — это процент стеариновой кислоты замещенных аминовых групп на хитосане. TNBS реагировал с свободными аминовыми группами на хитосане и формировал тринитробензол производные с UV поглощением при 344 нм. Стандартная кривая тринитробензол производного хитосана определялась UV поглощением при 344 нм. SD% CSO-SA рассчитывался как 9.3 ± 8%. Это подтвердило, что CSO и SA успешно сцеплены на основе их графтирования соотношения.

Размер частиц и потенциал CSO-SA, CSO-SA/EMO

Таблица 1 показывает, что Z-average CSO-SA составлял 139.3 ± 2.2 нм. PDI был 0.179 ± 0.03, указывая на относительно равномерную дисперсию. По сравнению с CSO-SA, Z-average и PDI CSO-SA/EMO увеличились. После загрузки EMO поверхностный положительный заряд CSO-SA/EMO был выше, чем у CSO-SA.

Клеточный захват

FITC не влиял на физикохимические свойства CSO-SA. Мы получили FITC-CSO-SA путем графтирования флуоресцеина FITC в CSO-SA. После окраски клеток Hoechst 33342, захват FITC-CSO-SA клетками наблюдался с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа. Мы обнаружили, что захват MGC803 постепенно увеличивался с увеличением времени, и флуоресценция FITC постепенно увеличивалась. Мицеллярный захват BGC823 был похож на MGC803 в временнозависимом режиме. FITC-CSO-SA имел хорошую проникающую способность в клетки и равномерно распределялся в цитоплазме клеток желудочного рака (рис. 2).

In vitro временнозависимый клеточный захват CSO-SA мицелл в клетках MGC803 (a) и BGC823 (b) для 1, 4, 8, 12 ч соответственно (синий, Hoechst 33342; зеленый, FITC; масштаб = 50 мкм).

Распределение CSO-SA In Vivo

Ближний инфракрасный (NIR) образовательный технологический подход преимущественен для проникновения биоматериалов и тканей. После введения CSO-SA/DiR в хвостовую вену голых мышей, распределение CSO-SA/DiR наблюдалось и записывалось в разное время с использованием малободного in vivo образателя. Как показано на рис. 3, распределение CSO-SA/DiR было похоже на другие мицеллы через 4 ч после внутривенного введения и в основном распределялось в печени, селезенке и опухолевых тканях. Распределение наномицелл в опухоли постепенно увеличивалось в интенсивности с увеличением времени. Это указывало на то, что CSO-SA графт имел хорошую пассивную таргетирующую способность, главным образом благодаря EPR эффекту наномицелл (рис. 3).

Полное тело изображение CSO-SA/DiR в разное время после i.v. инъекции.

Приготовление CSO-SA/EMO

Влияние различных pH сред на загрузку лекарства

Мы приготовили раствор CSO-SA и скорректировали pH CSO-SA для изучения эффекта pH на загрузку лекарства. Как показано на рис. 4, CSO-SA имел хорошую способность к загрузке лекарства и демонстрировал параболическую тенденцию в диапазоне pH 6.4-6.8. Наивысший уровень загрузки лекарства наблюдался при pH 6.6, делая это значение оптимальным pH для загрузки лекарства (рис. 4).

Эффекты различных pH значений CSO-SA графтов на загрузку лекарства. Данные представлены как средние ± SD (n = 3).

Эффективность инкапсуляции, TEM и загрузка лекарства

CSO-SA самоассемблируется в оболочечно-ядерные нанокомпозитные мицеллы. Гидрофобные остатки спонтанно формируют гидрофобные ядерные структуры для отталкивания гидрофильной среды. Эта структура обеспечивает ключевой транспорт для загрузки лекарства, потому что EMO может легко инкапсулироваться в гидрофобном ядре из-за своей гидрофобной структуры. Мы исследовали эффект CSO-SA на емкость загрузки EMO, варьируя дозировку EMO. Как показано на рис. 5, с увеличением дозировки EMO количество загрузки лекарства увеличивается. Скорость загрузки CSO-SA достигала 21.16% при соотношении 30% (рис. 5).

Влияние различных соотношений EMO и CSO-SA (5-30%) на загрузку лекарства. Данные представлены как средние ± SD (n = 3).

CSO-SA/EMO увеличивался в 30 000 раз передаточным электронным микроскопом. Форма и размер наномицелл наблюдались и записывались.

Выпуск EMO из CSO-SA/EMO

Лекарственно-нагруженный мицеллярный раствор добавлялся в 3.5 кДа диализационный мешок с ФСБ (pH 7.2) как средой выпуска. Каждый раз, когда образец забирался, он заменялся тем же объемом свежей среды выпуска.

Концентрация EMO в различные временные точки определялась HPLC, после чего рассчитывался кумулятивный процент выпуска. Как показано на рис. 6, CSO-SA/EMO демонстрировал значительный устойчивый эффект выпуска по сравнению с свободным EMO. Эти результаты показывают, что процент выпуска свободного EMO составлял 38.4% при 0.5 ч, в то время как процент выпуска EMO из CSO-SA/EMO составлял примерно 6.6%. При 4 ч процент выпуска свободного EMO был 83.7%, а процент выпуска CSO-SA/EMO составлял примерно 32.5%. В течение 72 ч выпуск свободного EMO достиг 97.2%, в то время как выпуск EMO из CSO-SA/EMO составил 78.4%. EMO выпускался из лекарственно-нагруженных мицелл CSO-SA/EMO двумя основными путями: через диссоциацию EMO от мицеллярного ядра и проникновением из мицеллярного ядра в среду выпуска.

Профиль выпуска EMO из CSO-SA/EMO за 72 ч. Полоски ошибок на графике представляют стандартные отклонения (n = 3).

Токсичность CSO-SA/EMO для клеток желудочного рака

MTT анализ — стандартный метод для детектирования живучести клеток. Цитотоксичность свободного EMO, CSO-SA и CSO-SA/EMO для клеток желудочного рака MGC803 и BGC823 измерялась MTT анализом. Показало, что EMO и CSO-SA/EMO могли ингибировать MGC803 и BGC823 клетки в дозависящем и временнозависимом режиме. Однако при той же концентрации CSO-SA/EMO имел более высокий ингибирующий эффект на MGC803 и BGC823 клетки по сравнению с свободным EMO раствором. IC₅₀ значения (Таблица 2) EMO и CSO-SA/EMO для клеток желудочного рака рассчитывались. IC₅₀ CSO-SA/EMO был значительно ниже, чем у EMO в каждой временной точке (24 ч, 48 ч, 72 ч). IC₅₀ значения CSO-SA показывали, что CSO-SA был безопасным биологическим носителем с малой биологической токсичностью, что подтвердило, что цитотоксичность CSO-SA/EMO была вызвана EMO (рис. 7).

Живучесть клеток MGC803 и BGC823 желудочного рака, обработанных CSO-SA, EMO и CSO-SA/EMO на 24 ч, 48 ч и 72 ч. Данные представлены как средние ± SD (n = 3).

Таблица 2 и рис. 7 показали, что цитотоксичность CSO-SA/EMO системы доставки лекарства была значительно выше, чем у свободного EMO. Однако когда выпуск CSO-SA/EMO и свободного EMO в in vivo среде моделировался, выпуск свободного EMO достиг 38.4% при 0.5 ч, в то время как выпуск CSO-SA/EMO был только 6.6%. В целом, концентрация свободного EMO была выше, чем CSO-SA/EMO в каждой временной точке.

Это явление легко объяснимо. Хотя CSO-SA/EMO выпускал EMO относительно медленно, антиопухолевой эффект CSO-SA/EMO не замедлялся и не снижался. Многие исследования показали, что наносистемы доставки лекарств могут улучшить антиопухолевую активность химиотерапевтических лекарств [21].

Во-первых, хотя свободный EMO демонстрирует начальный всплеск активности, EMO не может быть эффективно захвачен клетками, в то время как CSO-SA значительно ускорял клеточный захват через эндоцитоз или фагоцитоз.

Во-вторых, когда CSO-SA/EMO приближается к клеточным мембранам, взаимодействие между наночастицами и клеточными мембранами может влиять на структуру и свойства наномицелл, а также на функцию биологических макромолекул, таких как ионные каналы. Следовательно, присоединение CSO-SA/EMO к клеточным мембранам не приводит к простой физической адсорбции, но может изменить динамическое равновесие клетки и тем самым дополнительно способствовать цитотоксичности CSO-SA/EMO.

В-третьих, свободный EMO имеет гидрофобную антрахиноновую структуру, приводящую к плохому распределению в крови. Система доставки лекарства CSO-SA/EMO увеличивает растворимость EMO и улучшает растворение, приводя к более высокой молекулярной концентрации в окружающих клетках.

Детекция ареста клеточного цикла FCM

Анализ клеточного цикла — важный аспект клинического лечения злокачественных опухолей. Применение цикло-специфических лекарств к опухолевым клеткам в лекочувствительные периоды показывало большую эффективность. Хотя аналоги этидиевого бромида не могут проникать в нормальные клетки, они могут окрашивать ядра клеток, проникая через поврежденные клеточные мембраны. PI-внедренная двойноцепочечная ДНК производит красную флуоресценцию, а интенсивность флуоресценции пропорциональна уровню двойноцепочечной ДНК. Содержание ДНК определялось потоковой цитометрией (FCM) после окраски ДНК PI. Распределение клеточного цикла и апоптоз анализировались на основе распределения содержания ДНК.

Исследования показывали, что EMO влияет на распределение клеточного цикла [11, 22]. FCM анализ показал, что CSO-SA/EMO и EMO могли блокировать MGC803 и BGC823 клетки в фазе G2/M клеточного цикла.

Клетки MGC803 подвергались воздействию той же концентрации (20 мкМ) CSO-SA, свободного EMO и CSO-SA/EMO раствора в течение 24 ч. Процент клеток MGC803 в фазе G2/M составлял 8.95%, 15.29% и 23.12% соответственно. Процент контрольной группы был 6.47%. Проценты клеток BGC823 в фазе G2/M, обработанных 20 мкМ CSO-SA, свободным EMO или CSO-SA/EMO при тех же условиях, составляли 14.25%, 16.79% и 35.71% соответственно, что было выше значений в контрольной группе (13.66%). Эти данные показали, что CSO-SA/EMO блокировал фазу G2/M клеток MGC803 и BGC823 более эффективно и значительно, чем свободный EMO при той же концентрации. CSO-SA не показывал разницы от контрольных групп (рис. 8).

Распределение клеточного цикла клеток MGC803 и BGC823, обработанных EMO и CSO-SA/EMO на 24 ч. t-тест Стьюдента рассчитан и данные представлены как средние ± SD (n = 3), (*p < 0.05, **p < 0.005, ***p < 0.001).

Антиопухолевой эффект CSO-SA/EMO In Vivo

Для дальнейшего изучения антиопухолевого эффекта CSO-SA/EMO, скорость ингибирования опухоли и уровень клеточного апоптоза оценивались in vivo. Результаты показали, что и CSO-SA/EMO, и EMO имели заметный ингибирующий эффект на рост опухоли (рис. 9a). Скорость ингибирования опухоли группы CSO-SA/EMO была в три раза выше, чем у группы EMO (рис. 9d). Масса мышей в каждой группе не менялась значительно (рис. 9b). Это показало, что и CSO-SA/EMO, и EMO были относительно безопасны. Морфологические изменения и апоптоз в опухолевых тканях каждой группы показали, что CSO-SA/EMO имел значительный антиопухолевой эффект (рис. 9e, f).

Антиопухолевой эффект CSO-SA/EMO in vivo. a Форма опухоли в каждой группе. b Масса тела мыши в каждой группе. c Объем опухоли в каждой группе. d Скорость ингибирования опухоли. e Репрезентативные изображения TUNEL-окрашенной опухолевой ткани из каждой группы (масштаб = 200 мкм). f Репрезентативные изображения HE-окрашенной опухолевой ткани из каждой группы (масштаб = 200 мкм).

Заключение

В этом исследовании мы определили структуру, CMC, SD%, размер частиц и потенциал CSO-SA разными методами. Результаты доказали, что амфифильный CSO-SA хорошо работал как носитель. Интенсивность флуоресценции клеток желудочного рака показала, что CSO-SA был быстро захвачен в течение 12 ч. Голы мыши использовались как модель для изучения распределения CSO-SA в течение 72 ч. Со временем распределение CSO-SA в поражении становилось более концентрированным, демонстрируя хороший пассивный таргетирующий эффект.

CSO-SA/EMO приготовлен ультразвуково-диализационным методом. CSO-SA имел сильную способность к загрузке лекарства. Когда pH среды устанавливался при 6.6, уровень загрузки лекарства достигал 21.6% при 30% соотношении формулировки. По сравнению с CSO-SA, CSO-SA/EMO имел больший размер частиц и дзета-потенциал. Форма CSO-SA/EMO могла быть записана напрямую с использованием TEM. Выпуск EMO из CSO-SA/EMO составил 78.4% в течение 72 ч, это указывало на гладкий и непрерывный процесс в организме. Учитывая антиопухолевой эффект CSO-SA/EMO по сравнению с свободным EMO, мы подтвердили это различными экспериментами.

Токсичность CSO-SA для клеток желудочного рака детектировалась MTT анализом. Результаты показали, что CSO-SA был безопасным биологическим носителем. По сравнению с свободным EMO, CSO-SA/EMO значительно усилил антиопухолевую активность против клеток желудочного рака. Клеточный цикл MGC803 и BGC823 мог быть арестован в фазе G2/M более эффективно CSO-SA/EMO. Объем опухоли, HE окрашивание и TUNEL анализ доказали более значительный антиопухолевой эффект CSO-SA/EMO, чем свободный EMO.

Основываясь на вышеуказанных результатах, CSO-SA является и биосовместимым, и безопасным носителем. CSO-SA/EMO в этом исследовании использует новую и эффективную дозированную формуляцию для лечения рака и демонстрирует хороший пассивный таргетирующий эффект in vivo.

Доступность данных и материалов

Все данные, сгенерированные или проанализированные в ходе этого исследования, включены в эту опубликованную статью.

Аббревиатуры

CSO-SA:

Хитосанилолигосахарид-стеариновая кислота

EMO:

Эмодин

FITC:

Флуоресцеин изотиоцианат

MTT:

Тиазолил синий тетразолиевый бромид

TEM:

Передаточный электронный микроскоп

¹H NMR:

Протонное ядерно-магнитное резонансирование

EPR:

Эффект усиленного проникновения и удержания

TCM:

Традиционная китайская медицина

CMC:

Критическая мицеллярная концентрация

Log C:

Логарифм концентрации