Получение и оценка новых наномицелл, содержащих эмодин-стеариновую кислоту-g-хитозан, олигосахарид

Введение

Эмодин (ЭМО) - это натуральное производное антрахинона, которое добывается в основном из традиционных китайских трав, таких как ревень, куспидатум и мультифлорум. Традиционная китайская медицина (ТКМ) широко используется в клинических исследованиях из-за ее низкой токсичности, небольшого количества побочных эффектов и низкой стоимости [1].

Исследования показали, что EMO обладает широкой фармакологической активностью, включая иммуносупрессивную, противококлюшную, гипотензивную, противовоспалительную, антибактериальную и противоопухолевую активность. Было обнаружено, что ЭМО подавляет рост раковых клеток [2,3,4] и регулирует родственные гены для контроля апоптоза опухолевых клеток, туморогенеза, клеточной пролиферации, инвазии и метастазирования [5,6,7,8,9]. Исследования показали, что ЭМО может подавлять различные раковые клетки, такие как клетки колоректальной аденокарциномы человека, клетки гепатокарциномы, клетки лимфоидной лейкемии [10] и рак языка человека SCC-4 [11]. EMO может подавлять пролиферацию опухолевых клеток при раке желудка, груди и простаты [7, 12]. Однако ЭМО не проявляет цитотоксического действия на нормальные клетки, такие как нормальные фибробласты десны человека [13], клетки бронхиального эпителия человека [14] и клетки молочной железы человека [15]. Они показывают, что EMO проявляет избирательную цитотоксичность в отношении опухолевых клеток по сравнению с нормальными клетками.

Хитозан, природный полисахарид, представляет собой деацетилированную форму хитина. Этот природный полимер обладает превосходной растворимостью в воде, био-функциональностью, совместимостью с кровью и способностью к микробному разложению и известен своими различными биомедицинскими приложениями. Мы разложили хитозан с высокой молекулярной массой (450 кДа) с использованием хитозаназы в кислых условиях для получения олигосахарида хитозана с низким молекулярным весом (CSO, 18 кДа). CSO может сильно проникать через клеточные мембраны [16], а стеариновая кислота (SA) может проникать в ядро ​​через гликопротеиновый путь. CSO был гидрофобно модифицирован SA с использованием карбодиимида (EDC) в качестве связывающего реагента для синтеза олигосахарида амфипатической стеариновой кислоты-g-хитозана (CSO-SA).

Хотя EMO обладает обширной биологической активностью, его антрахиноновая структура плохо растворяется в воде. Поскольку терапевтические препараты транспортируются через кровоток, их растворимость напрямую влияет на их абсорбцию и распределение. Трансплантаты CSO-SA могут самоорганизовываться в водном растворе с образованием наномицел, которые являются гидрофобными внутри и гидрофильными снаружи. Мы диспергировали наномицеллы из собранного состояния с помощью ультразвукового зонда. Поскольку и EMO, и CSO были гидрофобными, EMO был инкапсулирован в центре мицелл.

Несколько модельных лекарств применяются к CSO-SA, что требует молекулярной массы, структуры и гидрофобности модельных лекарств. Существующие исследования включают куркумин [17], доксорубицин [18], стеарат ламивудина [19] и оксалиплатин [20], которые могут значительно улучшить противоопухолевые эффекты. Мы исследовали оптимальные условия загрузки CSO-SA / EMO. CSO-SA / EMO создает новые лекарственные формы с более высокой растворимостью и эффективностью использования. CSO-SA / EMO может предложить идеи для выбора модельных лекарств или носителей и клинического применения мицелл.

Экспериментальные материалы и методы

Экспериментальные материалы

Самцы голых мышей BALB / C + / nu были получены из Центра экспериментальных животных Чжэцзянского университета. Клеточные линии низкодифференцированного рака желудка MGC803 и BGC823 были приобретены из банка клеток АТСС. Питательная среда RPMI-1640 и FBS были получены от Hangzhou Holly Leaf Biotechnology Company. EMO, MTT, FITC, Hoechst 33342, DiR, тринитробензолсульфоновая кислота и пирен были поставлены Sigma Aldrich. Чжэцзянский университет предоставил CSO-SA. Остальные закупленные реагенты относятся к категории AR.

Определение CMC и ¹ Спектры ЯМР 1Н CSO-SA

В этом отчете критическая концентрация мицелл (CMC) CSO-SA была определена флуоресцентной спектрофотометрией с использованием пирена в качестве флуоресцентного зонда. К раствору пирена в ацетоне добавляли различные концентрации раствора CSO-SA, после чего ацетон выпаривали в течение ночи. Спектры испускания и значения пиков пирена в растворах CSO-SA различной концентрации анализировали с помощью флуоресцентной спектрофотометрии. Первый пик ( I ₁ =374 нм) и третий пик ( I ₃ =385 нм) спектра. Мы отложили логарифмическую концентрацию (Log C) по оси абсцисс и I ₁ / Я ₃ по оси ординат и рассчитал ККМ для полимерных мицелл.

CSO и CSO-SA растворяли в D ₂ О в концентрации 10 мг / мл. ¹ Спектры ЯМР 1Н регистрировали, сравнивали и анализировали на предмет характерных пиков CSO и CSO-SA.

Обнаруженная степень замещения амина

Степень замещения амина (SD%) определяли с использованием метода тринитробензол-серной кислоты (TNBS).

Были приготовлены различные концентрации растворов CSO и CSO-SA, после чего 4% NaHCO ₃ и последовательно добавляли 0,1% TNBS. После инкубации при 37 ° C в течение 2 ч на водяной бане добавляли 2 моль / л соляной кислоты. Поглощение измеряли при 344 нм спектрофотометрией в ультрафиолетовой и видимой области через 30 мин обработки ультразвуком. Была построена стандартная кривая и рассчитано SD% для образца CSO-SA.

Размер и потенциал частиц CSO-SA

Готовили раствор CSO-SA с концентрацией 1,0 мг / мл и мицеллы полностью диспергировали с помощью ультразвукового зонда-разрушителя клеток. Размер частиц и потенциал CSO-SA были определены с помощью анализатора размера частиц и поверхностного потенциала.

Использование соты CSO-SA

Растворы FITC и CSO-SA смешивали, перемешивали в течение ночи и переносили в мешок для диализа. Непрореагировавший FITC и абсолютный этанол удаляли диализом с деионизированной водой в течение 24 часов. Наконец, был получен раствор CSO-SA (FITC-CSO-SA), меченный FITC, с концентрацией 1,0 мг / мл.

Клетки MGC803 и BGC823 использовали в качестве клеток-мишеней для исследования поглощения клетками CSO-SA. Основываясь на скорости пролиферации клеток, клетки высевали в 24-луночные планшеты и культивировали в течение ночи, пока они не стали полностью прикрепленными. Затем в установленный момент времени добавляли восемьдесят мкл раствора FITC-CSO-SA. Клетки инкубировали с 10 мкл Hoechst 33342 (1 мг / мл) в течение 15 мин для окрашивания ядра клетки. Поглощение CSO-SA с помощью FITC-CSO-SA было обнаружено с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии.

Распространение CSO-SA in vivo

Распределение CSO-SA in vivo определяли окрашиванием флуоресцентным красителем DiR. Раствор CSO-SA / DiR был приготовлен диализом.

В качестве экспериментальной модели использовали самцов голых мышей шестинедельного возраста. Бестимусным мышам подкожно вводили 1 × 10 ⁸ / мл клеток MGC803. CSO-SA / DiR вводили через хвостовую вену при объеме опухолевых клеток примерно 200 мм ³ . . Затем мышей анестезировали в установленные моменты времени. Временное распределение CSO-SA / DiR in vivo регистрировали с помощью тепловизора живых тел мелких животных (диапазон длин волн 580-700 нм, время экспозиции 1000 мс).

Обнаружение концентрации EMO с помощью ВЭЖХ

Концентрацию EMO определяли с помощью ВЭЖХ. EMO наносили на насадочную колонку Eclipse XDB-C18 (4,6 × 250 мм, 5 мкм) с защитной колонкой (4,6 × 10 мм, 5 мкм). Температуру колонки устанавливали на 30 ° C, скорость потока составляла 1,0 мл / мин, длина волны детектирования составляла 254 нм, а объем инъекции составлял 20 мкл. Подвижная фаза - метанол / 0,1% фосфорная кислота (85:15, об. / Об.). Концентрация EMO была отложена по оси абсцисс, а площадь пика - по оси ординат. Стандартные кривые EMO были построены для определения оптимального линейного диапазона. Все образцы, введенные методом ВЭЖХ, фильтровали через органический фильтр с размером пор 0,45 мкм для защиты колонки.

Подготовка CSO-SA / EMO

В этом исследовании ЭМО инкапсулировали с помощью ультразвукового зонда. Первоначальное соотношение состава 10% (EMO:CSO-SA, мас. / Мас.) Использовали в качестве отправной точки. Раствор EMO медленно по каплям добавляли к мицеллярному раствору на ледяной бане. Затем ультразвуковой датчик применялся на 20 циклов (400 Вт, работа 2 с, остановка 3 с).

Загруженные лекарством мицеллы переносили в диализный мешок (MWCO, 3,5 кДа) и диализовали против деионизированной воды в течение 24 часов для удаления этанола из растворителя. Чистый CSO-SA / EMO получали центрифугированием диализата для удаления свободного EMO.

Свойства CSO-SA / EMO (потенциал диаметра частиц, TEM, EE%)

Размер частиц и поверхностный потенциал CSO-SA / EMO были измерены с помощью анализатора размера частиц и поверхностного потенциала.

Раствор CSO-SA / EMO 0,1 мг / мл добавляли по каплям на покрытую углеродной пленкой медную проволоку, окрашивали 2% фосфорновольфрамовой кислотой и сушили. Морфологию и размер частиц CSO-SA / EMO наблюдали с помощью просвечивающей электронной микроскопии.

Эффективность захвата (EE%) и загрузка лекарственного средства (DL%) CSO-SA / EMO определяли экстракцией органическим растворителем и ВЭЖХ. К 200 мкл образца мицеллярного раствора CSO-SA / EMO добавляли 1,8 мл метанола для диспергирования мицелл и экстракции лекарственного средства. Концентрация EMO была измерена как C _EMO . Еще 400 мкл мицеллярного раствора CSO-SA / EMO помещали в пробирку для ультрафильтрации и центрифугировали (12000 об / мин, 5 мин) для получения супернатанта. EE% и DL% рассчитывались по следующим формулам:

где C _EMO - концентрация EMO в мицеллах, C - концентрация EMO в мицеллах, нагруженных лекарством, после ультрафильтрационного центрифугирования, V - объем мицеллы, нагруженной лекарством, подвергнутой диализу, M _EMO - количество ЭМО, введенного во время нагрузки лекарством, M _CSO-SA масса CSO-SA.

Оценка высвобождения лекарства in vitro

Высвобождение лекарства из CSO-SA / EMO исследовали с использованием PBS (pH 7,2) в качестве среды для высвобождения. Один миллилитр нагруженного лекарственным средством раствора мицелл помещали в диализный мешок 3,5 кДа, запечатанный с обоих концов, затем помещали в соответствующую пробирку, содержащую среду для высвобождения. Мешок для диализа помещали в горизонтальный шейкер с термостатом при 37 ° C. Образцы отбирали в установленные моменты времени и заменяли тем же объемом свежей среды высвобождения. Содержание EMO в образцах определяли с помощью ВЭЖХ и рассчитывали совокупное количество выпущенного EMO.

Цитотоксичность CSO-SA / EMO

Показатели выживаемости клеток рака желудка, обработанных CSO-SA / EMO, CSO-SA и EMO, определяли с помощью анализа MTT. Клетки высевали в 96-луночные планшеты в концентрации примерно 10 ⁵ . / мл. CSO-SA / EMO, CSO-SA и EMO добавляли в разных концентрациях. После инкубации в течение разных периодов времени добавляли 20 мкл рабочего раствора МТТ. После 4 ч инкубации добавляли 200 мкл ДМСО и измеряли оптическую плотность (ОП) раствора при 570 нм с помощью устройства для считывания микропланшетов.

Влияние CSO-SA / EMO на цикл ячейки

Клетки из двух клеточных линий высевали в 6-луночный планшет с плотностью 10 ⁵ . / мл. После 12 часов культивирования добавляли CSO-SA, CSO-SA / EMO и EMO и инкубировали в течение 24 часов. Затем клетки переваривали, собирали и промывали. Затем к каждому образцу клеток добавляли 500 мкл окрашивающего раствора PI, осадок клеток медленно ресуспендировали и клетки инкубировали в темноте при 37 ° C в течение 30 минут. Красную флуоресценцию регистрировали проточным цитометром при длине волны возбуждения 488 нм. Содержание ДНК анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo.

Противоопухолевые эффекты CSO-SA / EMO, оцененные с помощью in vivo и гистологических анализов

Эксперименты на животных проводили в соответствии с Руководством по уходу за животными и комитетом по их использованию, Чжэцзянский университет. Ячейки MGC803 (1 × 10 ⁶ ) вводили подкожно в правый передний бок самцов голых мышей в возрасте от 5 до 6 недель. Опухолям давали возможность вырасти до диаметра примерно 5 мм. В этот момент мышей случайным образом делили на контрольную группу, группу инъекций EMO и группу инъекций CSO-SA / EMO, по 3 животных в каждой группе. Всем мышам вводили внутривенно соответствующие реагенты через хвостовую вену один раз в день в течение 2 недель. Электронный штангенциркуль был использован для измерения длинного (а) и короткого (б) диаметров опухоли (б). Объем опухоли рассчитывали по формуле V =a × b ² / 2. Регистрировали массу тела каждой мыши, после чего опухоли собирали для гистологического анализа. Степень ингибирования опухоли определяли в опухолевых тканях после окрашивания гематоксилином и эозином (HE). Мечение ник-конца терминальной дезоксинуклеотидтрансферазы dUTP (TUNEL) было выполнено для обнаружения клеточного апоптоза в ткани терминальной подвздошной кишки с использованием набора для определения гибели клеток in situ в соответствии с инструкциями производителя.

Результаты и обсуждение

CMC и ¹ Спектры ЯМР 1Н CSO-SA

Амфифильные полимеры самоорганизуются в мицеллы в гидрофильной среде. Более низкий CMC приводит к большему образованию мицелл. Это было полезно для сохранения структуры мицелл после внутривенного введения. Когда CSO-SA образовывал мицеллы, пирен-флуоресцентный зонд мог легко проникать в гидрофобное ядро ​​мицелл, увеличивая интенсивность флуоресценции заряженного пирена, что увеличивало интенсивность спектра излучения. На этом этапе Я ₃ увеличивается значительно быстрее, чем I ₁ , таким образом, I ₁ / Я ₃ Соотношение интенсивностей флуоресценции резко снизилось. Значительную точку останова можно было наблюдать в I ₁ / Я ₃ график и значения Log C (рис. 1). Расчеты точки перегиба показали, что ККМ составила 179,02 мкг / мл. Чем меньше КМЦ, тем сильнее способность образовывать мицеллы и сильнее сопротивление разбавлению, которое улучшает защиту структуры мицелл после внутривенного введения.

Изменение соотношения интенсивностей флуоресценции ( I ₁ / Я ₃ ) от логарифмической концентрации CSO-SA

EDC использовали в качестве сшивающего связывающего агента для реакции с карбоксильной группой SA и образования активного промежуточного производного -OO-ацилизомочевины. Он может реагировать с первичной аминогруппой CSO с образованием амидной связи. Структура CSO-SA была определена и подтверждена на основе спектра протонов ядерного магнитного резонанса. ¹ H ЯМР (400 МГц, D ₂ O) δ 1,06 (м, CH2), 1,02 (м, CH3) соответствуют метиленовому протону и метильному протону SA соответственно.

Замещающие степени аминогруппы

SD% CSO-SA представляет собой процент замещенных стеариновой кислотой аминогрупп в хитозане. TNBS взаимодействует со свободными аминогруппами хитозана и образует производные тринитробензола с УФ-поглощением при 344 нм. Стандартная кривая тринитробензольного производного хитозана была определена по УФ-поглощению при 344 нм. Было рассчитано, что SD% CSO-SA составляет 9,3 ± 8%. Это подтвердило, что CSO и SA были успешно связаны на основе их соотношения прививки.

Размер и потенциал частиц CSO-SA, CSO-SA / EMO

Таблица 1 показывает, что Z-среднее CSO-SA составляло 139,3 ± 2,2 нм. PDI составил 0,179 ± 0,03, что указывает на относительно однородную дисперсию. По сравнению с CSO-SA, Z-среднее и PDI CSO-SA / EMO увеличились. После загрузки EMO поверхностный положительный заряд CSO-SA / EMO был выше, чем у CSO-SA.

Поглощение ячеек

FITC не повлиял на физико-химические свойства CSO-SA. Мы получили FITC-CSO-SA путем трансплантации флуоресцеина FITC в CSO-SA. После окрашивания клеток Hoechst 33342 поглощение клетками FITC-CSO-SA наблюдали с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Мы обнаружили, что поглощение MGC803 постепенно увеличивалось с увеличением времени, а флуоресценция FITC постепенно увеличивалась. Поглощение BGC823 мицеллами было аналогично MGC803 в зависимости от времени. FITC-CSO-SA обладал хорошей способностью проникать в клетки и равномерно распределялся в цитоплазме клеток рака желудка (рис. 2).

Зависящее от времени поглощение мицелл CSO-SA клетками in vitro в MGC803 ( a ) и BGC823 ( b ) ячейки на 1, 4, 8, 12 ч соответственно (синий, Hoechst 33342; зеленый, FITC; шкала =50 мкм)

Распространение CSO-SA In Vivo

Технология визуализации в ближнем инфракрасном диапазоне (NIR) выгодна для проникновения в биоматериалы и ткани. После того, как CSO-SA / DiR вводили в хвостовую вену голых мышей, наблюдали и регистрировали распределение CSO-SA / DiR в разное время с использованием тепловизора для живых организмов небольших животных. Как показано на фиг. 3, распределение CSO-SA / DiR было аналогично другим мицеллам через 4 часа после инъекции в хвостовую вену и в основном распределялось в тканях печени, селезенки и опухоли. Распределение наномицел в опухоли постепенно увеличивалось по интенсивности с увеличением времени. Это указывает на то, что трансплантат CSO-SA обладает хорошей способностью к пассивному нацеливанию, в основном из-за эффекта ЭПР наномицелл (рис. 3).

Изображение всего тела CSO-SA / DiR в разное время после в / в. инъекция

Подготовка CSO-SA / EMO

Влияние различных сред pH на нагрузку от лекарств

Мы приготовили раствор CSO-SA и скорректировали pH CSO-SA, чтобы исследовать влияние pH на загрузку лекарственного средства. Как показано на фиг. 4, CSO-SA обладал хорошей способностью загружать лекарство и демонстрировал параболическую тенденцию в диапазоне pH 6,4-6,8. Наивысший уровень нагрузки лекарством наблюдался при pH 6,6, что делает это значение оптимальным pH для нагрузки лекарством (рис. 4).

Влияние различных значений pH трансплантатов CSO-SA на загрузку лекарственного средства. Данные представлены в виде средних значений ± стандартное отклонение ( n =3)

Эффективность инкапсуляции, ТЕА и загрузка лекарств

CSO-SA самособирается в мицеллы нанокомпозита с оболочкой-ядром. Гидрофобные части спонтанно образуют гидрофобные структуры ядра, отталкиваясь от гидрофильной среды. Эта структура обеспечивает ключевой носитель для загрузки лекарственного средства, поскольку EMO может быть легко инкапсулирован в гидрофобное ядро ​​благодаря его гидрофобной структуре. Мы исследовали влияние CSO-SA на нагрузочную способность EMO, варьируя дозировку EMO. Как показано на фиг. 5, с увеличением дозировки EMO количество лекарственного средства увеличивается. Скорость загрузки CSO-SA достигла 21,16% при соотношении 30% (рис. 5).

Влияние различных соотношений EMO и CSO-SA (5-30%) на нагрузки лекарственными средствами. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение ( n =3)

CSO-SA / EMO был увеличен в 30 000 раз с помощью просвечивающего электронного микроскопа. Наблюдались и регистрировались форма и размер наномицелл.

Выпуск EMO от CSO-SA / EMO

Загруженный лекарственным средством раствор мицелл добавляли в диализный мешок 3,5 кДа с использованием PBS (pH 7,2) в качестве среды для высвобождения. Каждый раз, когда отбирали образец, его заменяли тем же объемом свежей высвобождающей среды.

Концентрацию EMO в различные моменты времени определяли с помощью ВЭЖХ, после чего рассчитывали совокупный процент высвобождения. Как показано на фиг. 6, CSO-SA / EMO проявлял значительный эффект замедленного высвобождения по сравнению со свободным EMO. Эти результаты показывают, что процент высвобождения свободных EMO составлял 38,4% через 0,5 часа, в то время как процент высвобождения EMO из CSO-SA / EMO составлял приблизительно 6,6%. Через 4 часа процент высвобождения свободных EMO составлял 83,7%, а процент высвобождения CSO-SA / EMO составлял приблизительно 32,5%. В течение 72 часов выпуск свободных EMO достиг 97,2%, в то время как выпуск EMO из CSO-SA / EMO составил 78,4%. EMO высвобождается из мицелл CSO-SA / EMO, нагруженных лекарственным средством, двумя основными способами:посредством диссоциации EMO из мицеллярного ядра и путем проникновения из ядра мицеллы в среду высвобождения.

Профиль релиза EMO от CSO-SA / EMO за 72 часа. Планки погрешностей на графике представляют собой стандартные отклонения ( n =3)

Токсичность CSO-SA / EMO для клеток рака желудка

Анализ МТТ - это стандартный метод определения жизнеспособности клеток. Цитотоксичность свободных EMO, CSO-SA и CSO-SA / EMO по отношению к клеткам рака желудка MGC803 и BGC823 измеряли с помощью анализа МТТ. Он показал, что EMO и CSO-SA / EMO могут ингибировать клетки MGC803 и BGC823 в зависимости от дозы и времени. Однако при той же концентрации CSO-SA / EMO оказывал более сильное ингибирующее действие на клетки MGC803 и BGC823 по сравнению со свободным раствором EMO. IC ₅₀ были рассчитаны значения (таблица 2) EMO и CSO-SA / EMO для клеток рака желудка. IC ₅₀ CSO-SA / EMO был значительно ниже, чем у EMO в каждый момент времени (24 ч, 48 ч, 72 ч). IC ₅₀ Значения CSO-SA показали, что CSO-SA был безопасным биологическим носителем с небольшой биологической токсичностью, что подтвердило, что цитотоксичность CSO-SA / EMO была вызвана ЭМО (рис. 7).

Жизнеспособность клеток рака желудка MGC803 и BGC823, обработанных CSO-SA, EMO и CSO-SA / EMO в течение 24, 48 и 72 часов. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение ( n =3)

Таблица 2 и фиг. 7 показывают, что цитотоксичность системы доставки лекарственного средства CSO-SA / EMO была значительно выше, чем цитотоксичность свободной EMO. Однако когда моделировали высвобождение CSO-SA / EMO и свободного EMO в среде in vivo, высвобождение свободного EMO достигало 38,4% через 0,5 часа, в то время как высвобождение CSO-SA / EMO составляло только 6,6%. В целом концентрация свободного EMO была выше, чем концентрация CSO-SA / EMO в каждый момент времени.

Это явление легко объяснимо. Хотя CSO-SA / EMO выделяет EMO относительно медленно, противоопухолевый эффект CSO-SA / EMO не замедляется и не снижается. Многие исследования показали, что системы доставки нанопрепаратов могут улучшить противоопухолевую активность химиотерапевтических препаратов [21].

Во-первых, хотя свободный EMO демонстрирует начальный всплеск активности, EMO не может эффективно поглощаться клетками, тогда как CSO-SA значительно ускоряет поглощение клетками посредством эндоцитоза или фагоцитоза.

Во-вторых, когда CSO-SA / EMO приближается к клеточным мембранам, взаимодействие между наночастицами и клеточными мембранами может влиять на структуру и свойства наномицел, а также на функцию биологических макромолекул, таких как ионные каналы. Следовательно, прикрепление CSO-SA / EMO к клеточным мембранам не приводит к простой физической адсорбции, но может изменить динамический баланс клетки и тем самым дополнительно повысить цитотоксичность CSO-SA / EMO.

Наконец, свободный EMO имеет гидрофобную антрахиноновую структуру, что приводит к плохому распределению в крови. Система доставки лекарств CSO-SA / EMO увеличивает растворимость EMO и улучшает растворение, что приводит к более высокой молекулярной концентрации в окружающих клетках.

Обнаружение остановки цикла ячейки с помощью FCM

Анализ клеточного цикла - важный аспект клинического лечения злокачественных опухолей. Было показано, что применение лекарств, специфичных для цикла, к опухолевым клеткам в периоды, чувствительные к лекарствам, имеет большую эффективность. Хотя аналоги бромистого этидия не могут проникать в нормальные клетки, они могут окрашивать ядра клеток, проникая через поврежденные клеточные мембраны. Двухцепочечная ДНК, встроенная в PI, дает красную флуоресценцию, и интенсивность флуоресценции пропорциональна уровню двухцепочечной ДНК. Содержание ДНК определяли методом проточной цитометрии (FCM) после окрашивания ДНК PI. Распределение клеточного цикла и апоптоз были проанализированы на основе распределения содержания ДНК.

Исследования показали, что ЭМО влияет на распределение клеточного цикла [11, 22]. Анализ FCM показал, что CSO-SA / EMO и EMO могут блокировать клетки MGC803 и BGC823 в фазе G2 / M клеточного цикла.

Клетки MGC803 подвергали воздействию CSO-SA, свободного EMO в той же концентрации (20 мкМ) и раствора CSO-SA / EMO в течение 24 часов. Было обнаружено, что процент клеток MGC803 в фазе G2 / M составляет 8,95%, 15,29% и 23,12% соответственно. Процент контрольной группы составил 6,47%. Процент клеток BGC823 в G2 / M, обработанных 20 мкМ CSO-SA, свободной EMO или CSO-SA / EMO в тех же условиях, составлял 14,25%, 16,79% и 35,71% соответственно, что было выше значений, чем в контрольной группе. (13,66%). Эти данные показали, что CSO-SA / EMO блокирует фазу G2 / M клеток MGC803 и BGC823 более эффективно и значительно, чем свободный EMO при той же концентрации. CSO-SA не показал отличий от контроля (рис. 8).

Распределение клеточного цикла клеток MGC803 и BGC823, обработанных EMO и CSO-SA / EMO в течение 24 часов. Студенческий t был рассчитан тест, и данные представлены как среднее ± стандартное отклонение ( n =3), (* p <0,05, ^** p <0,005, ^*** p <0,001)

Противоопухолевый эффект CSO-SA / EMO In Vivo

Для дальнейшего изучения противоопухолевого эффекта CSO-SA / EMO оценивали скорость ингибирования опухоли и уровни клеточного апоптоза in vivo. Результаты показали, что как CSO-SA / EMO, так и EMO оказывают заметное ингибирующее действие на рост опухоли (фиг. 9a). Скорость подавления опухоли в группе CSO-SA / EMO была в три раза выше, чем в группе EMO (фиг. 9d). Вес мышей в каждой группе существенно не изменился (рис. 9б). Это показало, что и CSO-SA / EMO, и EMO были относительно безопасными. Морфологические изменения и апоптоз в опухолевых тканях каждой группы показали, что CSO-SA / EMO обладают значительным противоопухолевым действием (рис. 9e, f).

Противоопухолевый эффект CSO-SA / EMO in vivo. а Форма опухоли в каждой группе. б Масса тела мышей в каждой группе. c Объем опухоли в каждой группе. г Скорость подавления опухоли. е Репрезентативные изображения опухолевой ткани, окрашенной TUNEL, из каждой группы (масштабная линейка =200 мкм). е Репрезентативные изображения опухолевой ткани, окрашенной HE, из каждой группы (масштабная линейка =200 мкм)

Выводы

В этом исследовании мы обнаружили структуру, КМЦ, SD%, размер частиц и потенциал CSO-SA с помощью различных методов. Results prove amphiphilic CSO-SA performed well as a carrier. Fluorescence intensity of gastric cancer cells showed CSO-SA had been taken up rapidly within 12 h. Nude mice were used as a model to study the distribution of CSO-SA within 72 h. Over time, CSO-SA distribution in lesion became more concentrated exhibiting a good passive targeting effect.

CSO-SA/EMO was prepared with ultrasound-dialysis method. CSO-SA had strong drug-loading capacity. When environment pH was set at 6.6, the level of drug loading reached 21.6% at a 30% formulation ratio. Compared with CSO-SA, CSO-SA/EMO had bigger particle size and zeta potential. The shape of CSO-SA/EMO could be recorded directly using TEM. The release of EMO from CSO-SA/EMO was 78.4% within 72 h, it indicated a smooth and continuous process in body. Considering the antitumor effect of CSO-SA/EMO compared with free EMO, we confirmed it with various experiments.

CSO-SA toxicity to gastric cancer cells was detected by MTT assay. The results showed that CSO-SA was a safe biological carrier. Compared with that of free EMO, CSO-SA/EMO significantly enhanced the antitumor activity against gastric cancer cells. MGC803 and BGC823 cell cycle could be arrested in the G2/M phase more effectively by CSO-SA/EMO. Tumor volume, HE staining, and TUNEL assay proved more significant antitumor effect of CSO-SA/EMO than free EMO.

Based on above results, CSO-SA is both biocompatible and safe carrier. CSO-SA/EMO in this study utilizes a new and effective dosage formulation for the treatment of cancer and exhibits good passive targeting effect in vivo.

Доступность данных и материалов

Все данные, полученные или проанализированные в ходе этого исследования, включены в эту опубликованную статью.

Сокращения

CSO-SA:

Chitosan oligosaccharide-stearic acid

EMO:

Emodin

FITC:

Флуоресцеина изотиоцианат

MTT:

Thiazolyl blue tetrazolium bromide

ТЕМ:

Просвечивающий электронный микроскоп

¹ H NMR:

Proton nuclear magnetic resonance

EPR:

Enhanced permeability and retention

TCM:

Traditional Chinese medicine

CMC:

Критическая концентрация мицелл

Log C:

Logarithm of concentration