Наночастицы альгината методом обратных мицелл: инкапсуляция доксорубицина и цитотоксичность в муриновых клетках рака молочной железы

Аннотация

Перекрестно-связанные наночастицы альгината представляют привлекательную платформу для инкапсуляции и доставки лекарственных препаратов. В данной работе мы сообщаем о простом протоколе обратных мицелл, позволяющем загружать водорастворимый доксорубицин (DOX) в кальциево-связанную матрицу альгината, образуя частицы NALG-DOX с гидродинамическим диаметром ~83 нм и дзета-потенциалом +7,2 мВ. Полученные наночастицы альгината (NALG) имели сферическую форму и монодисперсность, что подтвердилось ТЭМ. Освобождение DOX было контролируемым: ~70% препарата сохранялось через 4 часа и ~90% освобождалось за 24 часа при физиологическом pH. Флуоресцентная визуализация подтвердила клеточный захват DOX из NALG-DOK в клетках 4T1 муринового рака молочной железы. Тесты на цитотоксичность (LIVE/DEAD и Alamar Blue) показали IC₅₀ 0,45 мкг/мл для NALG-DOX против 0,093 мкг/мл для свободного DOX, в то время как пустой носитель NALG не проявлял токсичности. Эти результаты демонстрируют потенциал метода обратных мицелл для производства биосовместимых наночастиц альгината, загруженных лекарством.

Введение

Инкапсуляция химиотерапевтических препаратов предлагает преимущества перед системным введением свободного препарата, включая удлиненное циркулирование, защиту от плазменных белков и снижение системной токсичности. Наноносители могут использовать эффект усиленной проницаемости и удержания (EPR) твердых опухолей, обеспечивая пассивную таргетировку при соответствующем размере. Хотя липосомы, полимерные частицы и липидные наночастицы вошли в клиническую практику, многие новые формулировки сталкиваются с проблемами масштабируемого производства и воспроизводимости. Альгинат — природный, биодеградируемый и неиммуногенный полисахарид — может перекрестно-связываться двухвалентными катионами (обычно Ca²⁺) для образования гидрогелевых наночастиц. В этом исследовании представлен быстрый метод синтеза обратных мицелл при комнатной температуре, дающий однородные наночастицы альгината, способные инкапсулировать гидрофильные препараты, такие как DOX.

Материалы и методы

Реактивы

Натрий альгинат, хлорид кальция дигидрат, циклогексан, додециламин и гидрохлорид доксорубицина приобретены у Sigma-Aldrich и MedChem Express. Все растворы готовили в воде 18 МОм.

Подготовка наноальгината (NALG)

Альгинат (15 мг/мл) размешивали 30 минут для полного растворения. Для загрузки DOX препарат растворяли в той же водной фазе. В флаконе размещали 8 мл циклогексана, добавляли 80 мкл додециламина (растворенного в теплой воде) для образования масляной фазы. Водный раствор альгината/DOX (20 мкл) вводили при интенсивном перемешивании (1200 об/мин) в течение 20 минут, затем добавляли 30 мкл 50 мМ CaCl₂ для перекрестного связывания альгината внутри обратных мицелл. Через 25 минут добавляли 2 мл воды для разделения водной фазы, из которой наночастицы извлекали пипеткой.

Очистка

Водный экстракт последовательно фильтровали через центрифужные модули 100 кДа и 10 кДа (Pall, Millipore) для удаления агрегатов и свободного препарата, получая 1 мл очищенного NALG или NALG-DOX.

Характеризация

Динамическое рассеяние света (Malvern Zetasizer) измеряло размер (лазер 633 нм, 25 °C, 173° заднее рассеяние). Дзета-потенциал регистрировали сразу после. Передаточная электронная микроскопия (ТЭМ) на Tecnai F-20 (4 кВ) подтвердила морфологию. Содержание DOX определяли по его собственному флуоресценции (возбуждение 470 нм, эмиссия 550 нм) и сравнивали с калибровочной кривой.

Изучение освобождения

Диализ (Slide-A-Lyzer MINI, 2 кДа MWCO) в ФСБ (pH 7,4) и цитратном буфере (pH 5,5) оценивал высвобождение DOX через 1, 2, 4, 24, 48 и 72 часа. Концентрацию высвобожденного DOX вычисляли по показаниям флуоресценции.

Клеточная культура и обработка

Клетки 4T1-luc2-GFP муринового рака молочной железы (PerkinElmer) культивировали в RPMI 1640 + 10% ФСС + 1% пенициллин/стрептомицин. Посеяли 4000 клеток/колодку (96-колодчатая пластина) и обрабатывали через 24 часа NALG, свободным DOX или NALG-DOX в различных концентрациях.

Флуоресцентная визуализация

Через 48 часов клетки фиксировали формалином, окрашивали NucBlue и визуализировали на EVOS FL Auto (ThermoFisher) в каналах DAPI, GFP и DOX. Обработку изображений выполняли в ImageJ.

Тест LIVE/DEAD

В 72 часа инкубировали клетки с NucBlue Live и NucGreen Dead реагентами (ThermoFisher), фиксировали и визуализировали как выше. Зеленая флуоресценция указывала на мертвые клетки.

Тест жизнеспособности Alamar Blue

Alamar Blue (10 мкл на колодку в 100 мкл среды) добавляли в 72 часа, инкубировали 1 час при 37 °C и измеряли на Tecan Infinite M200 Pro (560/590 нм). Жизнеспособность выражали в процентах относительно необработанных контрольных.

Результаты и обсуждение

Синтез методом обратных мицелл

Подход обратных мицелл дал прозрачные водные коллоиды NALG и NALG-DOX. Циклогексан служил масляной фазой, а додециламин функционировал как ПАВ, стабилизирующий цепи альгината в мицеллах. Перекрестное связывание хлоридом кальция формировало гидрогелевую сеть, а последующее водное извлечение давало монодисперсные частицы.

Характеристики частиц

ДРС показало NALG 92,2 ± 4,2 нм (PDI 0,320 ± 0,063, ζ –15,0 ± 0,8 мВ) и NALG-DOX 82,8 ± 3,6 нм (PDI 0,204 ± 0,044, ζ +7,2 ± 4,6 мВ). ТЭМ подтвердило сферическую морфологию с диаметрами, соответствующими ДРС. Загрузка DOX составила ~7% (≈4 мкг/мл), указывая на умеренную эффективность инкапсуляции, типичную для полимерных носителей.

Кинетика высвобождения

В ФСБ (pH 7,4) ~70% DOX оставалось через 4 часа, с ~90% высвобожденным к 24 часам. При pH 5,5 высвобождение ускорялось, отражая кислую микросреду опухоли и внутриклеточные компарменты, обеспечивая pH-зависимый профиль высвобождения препарата.

Клеточный захват

Флуоресцентная микроскопия через 48 часов показала локализацию DOX возле ядра как при свободном, так и при NALG-DOX лечении. Инкапсулированный DOX демонстрировал характерное перинуклеарное распределение, согласующееся с эндоцитозом и последующим высвобождением в кислых эндосомах.

Цитотоксичность

Тест LIVE/DEAD показал минимальную гибель клеток при NALG в одиночестве, тогда как DOX и NALG-DOX индуцировали дозозависимую цитотоксичность. Анализ Alamar Blue дал IC₅₀ 0,093 мкг/мл для свободного DOX и 0,45 мкг/мл для NALG-DOX. Более высокий IC₅₀ для NALG-DOX отражает контролируемое высвобождение и сниженную немедленную доступность препарата, однако инкапсулированный препарат сохраняет эффективность.

Заключение

Мы установили быстрый, масштабируемый метод обратных мицелл для получения ~90 нм наночастиц альгината, эффективно инкапсулирующих DOX. Полученные NALG-DOX демонстрируют контролируемое высвобождение, сниженную системную токсичность и сопоставимую антиопухолевую активность с свободным DOX in vitro. Дальнейшая работа сосредоточится на оптимизации эффективности инкапсуляции и in vivo характеристиках.

Аббревиатуры

4T1-luc2-GFP

4T1 люцифераза/зеленый флуоресцентный белок

CaCl₂

Хлорид кальция

DAPI

4′,6-Диамидино-2-фенилиндол

DLS

Динамическое рассеяние света

DMSO

Диметилсульфоксид

DOX

Доксорубицин

NALG

Наночастицы альгината

NALG-DOX

Наночастицы альгината с доксорубицином

PBS

Фосфатно-буферный раствор

PDI

Индекс полидисперсности

TEM

Передаточная электронная микроскопия