Наноальгинаты посредством синтеза обратных мицелл:инкапсуляция доксорубицина и цитотоксичность рака груди

Фон

Инкапсуляция терапевтических нагрузок дает много преимуществ по сравнению с системным введением бесплатных лекарств в кровоток. Увеличенное время циркуляции [1,2,3], защита от белков плазмы [4] и более низкая системная токсичность [5, 6], достигаемая за счет доставки наноносителей, могут значительно улучшить терапевтическую эффективность. Кроме того, повышенная проницаемость и удерживание солидных опухолей может быть использована для пассивного нацеливания, если терапевтические средства инкапсулированы в носители соответствующего размера или типа [7,8,9]. В наноносители были включены многочисленные терапевтические средства, включая доксорубицин (DOX) [6, 10, 11, 12], цисплатин [13, 14] и паклитаксел [15, 16, 17]. Кроме того, начали применяться многие технологии носителей, такие как липосомы [18,19,20,21], носители на основе полимеров [15, 22,23,24,25] и липидные наночастицы [26,27,28,29]. оказывает влияние на клинические исходы. Однако перевод новых составов часто затруднен из-за проблем, связанных с получением и обработкой этих соединений. Здесь мы представляем простой, надежный и надежный метод производства биосовместимых альгинатных наноносителей, способных инкапсулировать гидрофильные химиотерапевтические агенты.

Биополимеры использовались для инкапсуляции терапевтических средств отчасти из-за их простоты использования и их биосовместимости [30]. Используемые полимеры включают, среди прочего, альгинат [31, 32], гепарин [33, 34], хитозан [35, 36] и каррагинан [37, 38]. Альгинат, полимер природного происхождения, состоит из различных количеств остатков β-d-маннуроната и α-1-гулуроната, связанных 1,4-гликозидными связями [39] (блоки M и G соответственно). Альгинат можно сшить путем добавления многовалентных катионов, из которых обычно используется кальций [40,41,42]. Присутствие кальция может приводить к образованию более крупных упакованных структур между сцепленными G-блоками, называемых структурами «яичного бокса» [43]. Сшивание альгинатных нитей в растворе создает гидрогель. Другие полимеры, такие как хитозан [43,44,45], влияют на структурные свойства частицы. Группы гидроксильной и карбоновой кислоты на альгинатных цепях придают отрицательный общий заряд собранным структурам полимера [14, 46]. Связывая карбоновые кислоты и формируя трехмерную матрицу, можно улавливать терапевтические средства.

Доксорубицин - широко используемый химиотерапевтический препарат для лечения различных видов рака [47]. Основной механизм действия доксорубицина включает ассоциацию с ферментами, связанными с репликацией, что позволяет интеркалировать его в цепи ДНК. Он также может напрямую вставляться в цепь ДНК. В результате нарушается процесс репликации, что предотвращает пролиферацию клеток и приводит к апоптозу [48]. Помимо этого механизма, доксорубицин связан с генерацией активных форм кислорода в клетке [48, 49]. Доксорубицин очень эффективен [6, 50], но имеет серьезные токсические эффекты, затрагивающие несколько органов, включая сердце [51, 52], мозг [53], печень [47] и почки [54]. Инкапсуляция может привести к снижению системной токсичности, при этом липосомальный доксил стал широко известным успехом [7].

Альгинат - дешевое, биосовместимое, биоразлагаемое и легко доступное вещество, которое обычно считается неиммуногенным [55, 56]. Наночастицы гидрогеля, образованные сшитым альгинатом, использовались для инкапсуляции различных терапевтических средств [56]. Эти процессы варьируются от образования обратных мицелл, вызванного поверхностно-активным веществом [39], до механических стимулов или образования частиц, индуцированного температурой [41]. Мы представляем простой и надежный способ получения относительно монодисперсных альгинатных наноносителей. Этот процесс синтеза проводится при комнатной температуре (в отличие от представленного Machado et al.) И может быть выполнен всего за несколько часов. Обратный мицеллярный процесс включает водорастворимые терапевтические средства в альгинатную матрицу без необходимости химической модификации. Измерения динамического рассеяния света (DLS) альгинатных наночастиц показали однородное распределение частиц ~ 80–90 нм. Электронная микроскопия подтвердила размеры и грубую сферическую морфологию частиц. Доксорубицин, инкапсулированный в альгинатной матрице наночастиц, демонстрирует отличную эффективность in vitro по сравнению со свободным доксорубицином, что указывает на то, что в будущих исследованиях можно будет изучить эффективность терапевтических средств in vivo.

Методы

Материалы

Альгинат натрия, дигидрат хлорида кальция, циклогексан (99,9%) и додециламин (98%) были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури). Гидрохлорид доксорубицина был приобретен в MedChem Express (Monmouth Junction, NJ). Эти реагенты использовали как есть, с растворением альгината натрия и терапевтических средств в воде, как указано. Вся вода представляла собой фильтрованную воду с сопротивлением 18 МОм, полученную из источника Milli-Q.

Приготовление наноальгинатов

Альгинат натрия растворяли в стеклянной пробирке с концентрацией 15 мг / мл в воде и оставляли перемешиваться с помощью мешалки в течение не менее 30 минут перед использованием. DOX растворялся в этой водной фазе, если он должен был быть включен в наноноситель. Раствор альгината проверяли на полное растворение порошка альгината перед использованием в синтезе. Без введения поливалентного катиона водная альгинатная фаза остается гомогенной в течение нескольких недель. Во флакон пипеткой вносили восемь миллилитров циклогексана. Додециламин, твердое вещество при комнатной температуре, нагревали в теплой воде в течение нескольких минут до тех пор, пока часть твердого вещества не превратилась в жидкую форму. Затем в циклогексан пипеткой добавляли 80 мкл додециламина. В стеклянный сосуд добавляли стержень для перемешивания, и затем смесь перемешивали со скоростью 125 об / мин. После 5 мин перемешивания органическую фазу считали хорошо перемешанной и готовой для добавления водной фазы. К органической фазе циклогексан / додециламин добавляли двадцать микролитров водной альгинатной фазы. Скорость перемешивания увеличивали до 1200 об / мин. Перемешивание происходило при постоянном перемешивании в течение 20 мин. Затем к смеси добавляли тридцать микролитров 50 мМ раствора хлорида кальция. После 25 мин перемешивания / гелеобразования частиц к смеси добавляли 2 мл воды, создавая водный слой под органическим слоем. Наночастицы разделились на водную фазу, и для удаления водного слоя использовали пипетку объемом 1 мл.

Очистка NALG

Водный слой центрифугировали на фильтре 100 кДа (Pall) в течение 10 мин при 3200 × g в центрифуге для удаления крупных агрегатов, и пермеат переносили в блок 10 кДа (Millipore). Затем раствор вращали в течение 5 минут с той же скоростью, чтобы отфильтровать мелкие примеси. Добавляли воду и вращали в течение 5 минут для промывки ретентата. Был собран окончательный объем 1 мл, и была проведена характеристика этого продукта.

Характеристика NALG

Отфильтрованный раствор наночастиц переносили в кювету (Malvern Instruments, DTS 1070 zeta cell) для измерения динамического светорассеяния. Распределение по размерам определяли с использованием Malvern Zetasizer ZSP (Malvern Instruments, UK). Измерения размеров проводили с использованием лазера с длиной волны 633 нм при 25 ° C с методом обнаружения с углом обратного рассеяния 173 °. Измерения дзета-потенциала альгинатных наночастиц проводили в той же кювете сразу после измерения размера. Измерения размера и дзета-потенциала были выполнены в трех экземплярах, и представленные результаты показывают среднее значение ± стандартное отклонение трех испытаний. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) использовалась для подтверждения размера наночастиц и исследования их морфологии. Изображения ПЭМ получали с помощью просвечивающего электронного микроскопа Technai F-20, работающего при 4200 эВ. Приготовление сеток ПЭМ включало нанесение по каплям 10 мкл раствора наночастиц после фильтрации на медную поверхность сетки ПЭМ с формаваром / углеродом (Ted Pella). Влажные сетки ПЭМ были помещены накрытыми в эксикатор на ночь перед визуализацией, чтобы обеспечить надлежащую сушку.

Доксорубицин обладает собственной флуоресценцией, которую можно использовать для сравнения флуоресценции наночастиц альгината доксорубицина (NALG-DOX) со стандартной кривой DOX для оценки его концентрации. Мы использовали длины волн возбуждения / излучения 470/550 нм. Высвобождение доксорубицина из растворов NALG-DOX определяли путем диализа конечного отфильтрованного раствора наночастиц в фосфатно-солевой буфер (PBS) при pH 7,4 или цитратный буфер при pH 5,5. Два набора из пяти партий NALG-DOX были приготовлены, как описано ранее, с начальной концентрацией DOX 1,25 мг / мл в водной альгинатной фазе. Восемнадцать устройств для диализа Slide-A-Lyzer MINI (ThermoFisher) с внутренним объемом 100 мкл и отсечкой по молекулярной массе 2 кДа были приготовлены путем добавления 100 мкл NALG-DOX в каждое устройство. Каждое устройство помещали в сцинтилляционный флакон, содержащий 20 мл буфера. В каждый флакон, содержащий буфер, добавляли стержень для перемешивания, и все флаконы помещали на перемешивающую пластину для осторожного перемешивания на время эксперимента. Флаконы закрывали, чтобы уменьшить потерю буфера на испарение и защитить от света. В каждый момент времени (1, 2, 4, 24, 48, 72 ч) три устройства были удалены, 100 мкл образца было извлечено из каждого устройства и помещено в отдельную лунку, а измерение флуоресценции было выполнено на Tecan. Считыватель микропланшетов Infinite M200 Pro (Tecan Trading AG) на 470/550 нм. Измерения флуоресценции сравнивали с измерениями по стандартной кривой и начальным аликвотам, взятым перед экспериментом, для определения концентрации и количества потерь DOX в буфере.

Культура клеток и дозирование

Клетки рака молочной железы мыши, люцифераза 4T1 / зеленый флуоресцентный белок Bioware Ultra Green Cell Line (4T1-luc2-GFP, аденокарцинома мыши) и не репортерные клетки 4T1 были получены от PerkinElmer (Waltham, MA). Эти клетки поддерживали средой RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина в 5% CO ₂ инкубатор, работающий при 37 ° C. Клетки 4T1 высевали из расчета 4000 клеток / лунку в 96-луночный планшет с черными стенками и прозрачным дном. Через 24 часа после посева в лунки исходную среду отсасывали и вводили лекарственный препарат / состав среды.

Флуоресцентная визуализация

Через 48 ч среду отсасывали, клетки трижды промывали PBS и в лунки добавляли формалин. После 30 мин инкубации при комнатной температуре клетки снова трижды промывали PBS и в лунки добавляли две капли реагента ReadyProbes для фиксированных клеток NucBlue (ThermoFisher) на миллилитр среды. После 1 ч инкубации при комнатной температуре клетки снова трижды промывали PBS. Затем к фиксированным клеткам добавляли 100 мкл PBS и планшеты переносили в систему автоматической визуализации клеток EVOS FL (ThermoFisher). Объектив A × 20 использовался для изображения частей определенных лунок в каждом планшете. Изображение каждого канала флуоресценции записывалось отдельно; синее изображение для 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI), красное изображение для DOX (с использованием канала RFP для захвата собственной флуоресценции) и зеленое изображение для GFP. Клетки 4T1-luc2-GFP экспрессируют зеленый флуоресцентный белок, поэтому дополнительное окрашивание не требуется, чтобы клетки были видны в зеленом канале. Обработка DOX «окрашивает» клетки, и для визуализации этого в красном канале не требуется дополнительных реагентов. Яркость / контраст изображений были отрегулированы в ImageJ.

Анализ жизнеспособности живых / мертвых клеток

Качественную оценку жизнеспособности клеток 4T1 после совпадения с NALG, DOX и NALG-DOX оценивали с помощью анализа жизнеспособности клеток LIVE / DEAD (ThermoFisher). Через 72 часа после введения среды, содержащей лекарственное средство, среду аспирировали и клетки трижды промывали PBS. Анализ LIVE / DEAD выполняли путем добавления двух капель из каждой пипетки NucBlue Live Reagent и NucGreen Dead Reagent (ThermoFisher) на миллилитр среды. После 30 мин инкубации были выполнены еще три промывания PBS, и в лунки добавили формалин для фиксации клеток. После формалина еще три промывки PBS, и в каждую лунку добавляли окончательное количество PBS в размере 100 мкл. Было выполнено аналогичное изображение, как указано, но теперь зеленый канал указывал на присутствие мертвых клеток, поскольку поврежденные клеточные мембраны позволили зеленому реагенту проникнуть в клетку.

Анализ жизнеспособности живых / мертвых клеток

Количественную оценку жизнеспособности клеток 4T1 после совпадения с NALG, DOX и NALG-DOX оценивали с помощью анализа жизнеспособности клеток Alamar Blue (ThermoFisher). Через 72 часа после введения среды, содержащей лекарственное средство, среду аспирировали. Анализ Alamar Blue выполняли путем добавления 10 мкл реагента Alamar Blue в каждую лунку со 100 мкл новой среды и инкубирования в течение 1 ч при 37 ° C. Через 1 час жизнеспособность клеток определяли для каждой лунки с использованием считывающего устройства для микропланшетов Tecan Infinite M200 Pro (Tecan Trading AG). Длины волн возбуждения / испускания были установлены на 560/590, оптимальные настройки усиления были определены для планшета с помощью программного обеспечения, и протокол считывания снизу был использован для считывания интенсивности флуоресценции для каждой лунки в планшете. % Жизнеспособности клеток можно определить по показаниям интенсивности флуоресценции с помощью уравнения:

Результаты и обсуждения

Обратный процесс эмульсии мицелл

В этой работе наноальгинатный носитель лекарственного средства, NALG, был приготовлен с помощью процесса эмульсии обратной мицеллы, как показано на рис. 1. Водный альгинат был добавлен к масляной фазе циклогексан / додециламин, которая образует обратные мицеллы. Затем альгинат был сшит с добавлением хлорида кальция (CaCl ₂ ) решение. По прошествии времени, позволяющего сшить альгинат внутри обратных мицелл, NALG экстрагировали добавлением воды. Наконец, центробежные фильтры удаляют скрытые загрязнения и помогают сузить распределение наночастиц по размерам. Конечный продукт представлял собой прозрачный водный коллоидный раствор.

Процесс приготовления для образования NALG и NALG-DOX. а Схематическое изображение процесса обратного синтеза мицелл. Водные альгинатные цепи сшиваются в органической ванне (вверху), экстрагируются до водной фазы (внизу слева), затем фильтруются для очистки (внизу справа). б Молекулярное взаимодействие Ca ²⁺ сшивание, приводящее к образованию NALG. c Фотография синтеза в разных точках, слева направо, эмульсия перед CaCl ₂ добавление, эмульсия после CaCl ₂ добавление и разделение при добавлении воды

Компоненты системы эмульсии обращенных мицелл были определены на основании экспериментальных данных и прошлой литературы. Для сужения степеней свободы в системе в качестве органической фазы был выбран циклогексан. При оптимизации этого процесса мы протестировали ряд поверхностно-активных веществ на их способность образовывать наноразмерные альгинатные частицы, на что указывает увеличение мутности органической смеси при введении небольшого количества водной фазы при перемешивании. Додециламин был подходящим кандидатом и был выбран в качестве поверхностно-активного вещества для дальнейшего использования. В представленных здесь экспериментах в качестве водной фазы была выбрана вода.

Характеристика NALG

На рис. 2а, б показано распределение гидродинамических размеров наночастиц для NALG и NALG-DOX. Наночастицы, пустые или терапевтически загруженные, показали аналогичные пики с центром около 90 нм. Диаметр частиц для NALG и NALG-DOX, соответственно, составлял 92,2 ± 4,2 нм и 82,8 ± 3,6 нм. Индекс полидисперсности (PDI) для частиц составлял 0,320 ± 0,063 и 0,204 ± 0,044, а ζ-потенциалы составляли -15,0 ± 0,8 мВ и 7,2 ± 4,6 мВ.

Распределение динамического светорассеяния a NALG и b NALG-DOX демонстрирует монодисперсное распределение наночастиц альгината. Изображения c , полученные с помощью просвечивающей электронной микроскопии NALG и d NALG-DOX показывает сферическую морфологию частиц. Масштабные полосы показывают 50 нм на большом изображении и 20 нм на вставке

Размеры частиц были постоянными при включении DOX в альгинатную матрицу. Ζ-потенциал был отрицательным для пустого NALG, что соответствовало другим альгинатным наночастицам, связанным кальцием [39]. Частицы, нагруженные доксорубицином, обладали положительным ζ-потенциалом. Частично это может быть связано с избытком положительно заряженных ионов кальция на поверхности частицы, что может помочь передать положительный заряд наночастице. Кроме того, первичный амин, присутствующий в молекулах DOX, может электростатически взаимодействовать со свободными группами карбоновых кислот на альгинате, уменьшая отрицательные заряды, имеющиеся на поверхности частицы.

На рис. 2c, d показаны изображения сшитого кальцием NALG и NALG-DOX, полученные с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Оба типа наночастиц имели сферическую морфологию. Общее распределение наночастиц по размеру похоже на распределение DLS. Концентрацию конечного раствора NALG-DOX оценивали с использованием собственной флуоресценции молекулы доксорубицина. Объем отфильтрованного продукта NALG-DOX был разделен на тройные наборы диализных устройств, помещенных в сцинтилляционные флаконы, заполненные PBS, и DOX позволили разное время высвободиться из NALG-DOX. Первоначально концентрация DOX в растворе NALG-DOX составляла ~ 4 мкг / мл, что указывает на то, что эффективность инкапсуляции или отношение DOX в NALG-DOX к исходному DOX, добавленному в состав, для NALG-DOX составляет ~ 7%. Хотя эта эффективность инкапсуляции считается низкой по сравнению с аналогичными частицами [57], это, вероятно, связано с исходным DOX, присутствующим в водной фазе. Мы не повторяли рецептуру, снижая количество DOX, присутствующего в исходной водной фазе, и предполагаем, что эффективность может быть улучшена за счет снижения количества DOX в исходной рецептуре. Неинкапсулированный DOX, вероятно, проходит через промывки фильтров 3 кДа в конце синтеза. Учитывая доступность и относительно низкую стоимость доксорубицина, мы решили «насытить» состав DOX, зная, что большие количества оставшегося DOX, скорее всего, пройдут через неинкапсулированный раствор. Повышение эффективности инкапсуляции может улучшить эту платформу частиц в будущем.

Кривая высвобождения NALG-DOX при pH 5,5 и 7,4 представлена ​​на рис. 3. NALG-DOX сохраняет примерно 70% полезной нагрузки DOX в течение первых 4 часов, а 90% частиц уходит через 24 часа. , при pH 7,4. Этот характер высвобождения является обычным для полимерных материалов [57, 58] и демонстрирует контролируемое высвобождение в течение первых 24 часов при воздействии на резервуар PBS. При более низком pH 5,5, более похожем на pH, который наночастицы будут видеть во время поглощения клетками в поздних эндосомах [59], DOX высвобождается с большей скоростью. Это желательное поведение, поскольку требуется более медленное высвобождение при общей циркуляции в крови, но при кислой микросреде опухоли более быстрое высвобождение является предпочтительным.

Высвобождение доксорубицина из раствора наночастиц показывает контролируемое высвобождение в течение первых 24 часов в PBS, pH 7,4. Более быстрое высвобождение доксорубицина происходит при pH 5,5. Каждая точка представляет собой среднее значение ± стандартное отклонение n =3 измерения

Использование DOX в сотовых сетях

Поглощение NALG-DOX клетками рака молочной железы мышей 4T1 через 48 часов показано на рис. 4a, b. Каждая строка указывает отдельный цветовой канал, а нижняя строка показывает составное изображение всех цветовых каналов. В левом столбце используется высокая концентрация DOX или NALG-DOX, достаточная для уничтожения большинства клеток. В среднем столбце показана концентрация DOX 0,31 мкг / мл и 0,28 мкг / мл DOX в NALG-DOX, что показывает некоторый потенциал уничтожения клеток, а в правом столбце показаны необработанные клетки. Клетки на центральном изображении показывают доксорубицин (красный) вокруг и перекрытие с ядром (синий) клеток. Количество клеток в первых двух столбцах на обеих панелях а и b уменьшено из-за присутствия DOX, который ингибировал пролиферацию клеток по сравнению с необработанными лунками. Доксорубицин функционирует посредством интеркаляции в ядерную ДНК [12], и совместная локализация доксорубицина и ядра может указывать на то, что он функционирует посредством этого механизма при захвате. На рис. 4b инкапсулированный доксорубицин выделяется на периферии ядерной области. В правом столбце показаны необработанные клетки без значимого сигнала в красном канале. Свободный DOX, хотя и является сильнодействующим, вызывает токсичность, не соответствующую мишени, и сокращает время циркуляции in vivo. Инкапсуляция обеспечивает более стабильное высвобождение в течение увеличенного времени циркуляции, что делает NALG-DOX потенциально лучше in vivo и может быть исследовано в будущей работе.

Флуоресцентная микроскопия изображений фиксированных клеток рака молочной железы 4T1-luc2-GFP, обработанных доксорубицином (DOX) ( a ) и NALG-DOX ( b ) после 48-часовой выдержки. Шкала показывает 100 мкм. Голубое ядерное пятно:DAPI; зеленый (линия трансфицированных клеток):GFP; красный (собственная молекулярная флуоресценция):DOX

Цитотоксичность NALG-DOX

В качестве основного теста на потенциал уничтожения клеток необработанные клетки 4T1 и клетки, обработанные NALG-DOX, окрашивали с помощью анализа LIVE / DEAD клеток (ThermoFisher) и фиксировали через 72 часа воздействия. Пример изображения необработанной лунки, лунки, обработанной NALG, лунки, обработанной 0,078 мкг / мл DOX, и лунки, обработанной 0,20 мкг / мл NALG-DOX, показаны на рис. 5a – d соответственно. Зеленое перекрытие, показанное на фиг. 5c, d, указывает на то, что обработка DOX и NALG-DOX в этих лунках приводит к гибели многих клеток в этой лунке. Клетки не были способны пролиферировать таким же образом, как в необработанных и пустых лунках, обработанных наночастицами, показанных на фиг. 5a, b, из-за присутствия терапевтического средства. Разведение наночастиц, используемых для дозирования в NALG и NALG-DOX, было идентичным.

Анализ флуоресценции LIVE / DEAD демонстрирует незначительную гибель клеток или ее отсутствие в необработанных клетках 4T1 ( a ) и в клетках, обработанных NALG ( b ). Интенсивность сигнала зеленого канала (окраска мертвых клеток) высока в большом количестве клеток, обработанных 0,078 мкг / мл DOX ( c ) и 0,20 мкг / мл NALG-DOX ( d ), что указывает на гибель клетки. Шкала показывает 100 мкм. Концентрации указывают количество DOX в свободном виде или в виде частиц. Дозирование NALG в ( b ) при той же плотности частиц, что и в NALG-DOX

Количественная оценка жизнеспособности клеток 4T1-luc2-GFP после 72-часового воздействия NALG, свободного DOX и NALG-DOX с помощью анализа Alamar Blue (ThermoFisher) показана на рисунке 6. На рисунке 6a свободный доксорубицин -обработанные клетки показали менее жизнеспособные клетки во всем диапазоне концентраций, чем клетки, обработанные NALG-DOX (для эквивалентной концентрации DOX). Далее это отображается на IC ₅₀ значения или концентрации, необходимые для демонстрации 50% ингибирующего эффекта, которые составляли 0,093 мкг / мл и 0,45 мкг / мл для свободного DOX и NALG-DOX соответственно. Значение свободного DOX аналогично значению, полученному через 72 часа для клеток 4T1 Du et al. [60]. IC ₅₀ значения аналогичны найденным Eliaz et al. с DOX и инкапсулированным в липосомы DOX через 72 часа против клеток меланомы B16F10 [61].

Жизнеспособность клеток 4T1-luc2-GFP после 72-часового воздействия NALG-DOX и DOX ( a ) и NALG ( b ) в различных концентрациях. Точки данных и полосы ошибок указывают среднее ± стандартное отклонение от n =3 скв. Концентрации указывают количество DOX, свободного или в частицах, в ( a ). В б , Лунки NALG дозировали, начиная с тех же концентраций частиц, что и NALG-DOX, что указывает на незначительную гибель клеток или ее отсутствие от одного носителя лекарственного средства

Для того, чтобы NALG-DOX продемонстрировал эффект, аналогичный эффекту свободного лекарственного средства, требуется более высокая концентрация доксорубицина. Этого следует ожидать, поскольку инкапсулированное терапевтическое средство более затруднено в своем транспорте к месту воздействия. Инкапсулированный доксорубицин все еще проявляет ингибирующее действие на клетки, что означает, что либо лекарство остается терапевтически активным, либо сама наночастица токсична для клеток. Чтобы проверить это, жизнеспособность NALG оценивали аналогично NALG-DOX. NALG показал минимальную токсичность во всех концентрациях, как показано на рис. 6b, что указывает на эффективность препарата.

Выводы

Мы разработали платформу обратной мицеллы, способную производить сферические наночастицы альгината размером ~ 90 нм. Поглощение NALG-DOX было исследовано в клетках рака молочной железы 4T1-luc2-GFP и показало отчетливое поглощение в местах рядом с ядром при инкапсулировании в альгинатный носитель. Клеточную токсичность свободного лекарства и инкапсулированного лекарства сравнивали, исследуя терапевтическую IC ₅₀ ценности. Инкапсулированный доксорубицин показал более низкую токсичность по сравнению с его аналогом в виде свободного лекарства. Эти NALG-DOX могут представлять большой интерес для целей доставки лекарств, поскольку нецелевые эффекты доксорубицина могут быть уменьшены при системном дозировании инкапсулированной формы. Будущие составы будут оптимизированы для более медленных профилей контролируемого высвобождения и повышенной инкапсуляции. Этот простой процесс обеспечивает эффективный путь синтеза, который может быть завершен всего за несколько часов, что позволяет быстро продолжить дальнейшую характеристику, эксперименты in vitro и in vivo.

Сокращения

4T1-luc2-GFP:

Люцифераза 4T1 / зеленый флуоресцентный белок

CaCl ₂ :

Хлорид кальция

DAPI:

4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол

DLS:

Динамическое рассеяние света

DMSO:

Диметилсульфоксид

DOX:

Доксорубицин

NALG:

Наночастицы альгината

NALG-DOX:

Наночастицы альгината доксорубицина

PBS:

Физиологический раствор с фосфатным буфером

PDI:

Индекс полидисперсности

ТЕМ:

Просвечивающая электронная микроскопия