Целевая ультразвуковая визуализация и терапия опухолей яичника с использованием pH-чувствительных перфторпентановых белковых наночастиц

Аннотация

В данном исследовании мы разработали многофункциональный ультразвуковой (US) терапевтический агент, инкапсулирующий перфторпентан (PFP) в ферритин (FRT) и конъюгирующий мишеневую молекулу фолиевой кислоты (FA) (FA-FRT-PFP). Приготовленные FA-FRT-PFP имели средний диаметр частиц 42,8 ± 2,5 нм, дзета-потенциал −41,1 ± 1,7 мВ и демонстрировали хорошую стабильность в физиологическом растворе и температурах. FRT — pH-чувствительный клеточный белок, который при pH 5,0 диссоциацируется с образованием пор, загружающих PFP. Корректировка до нейтрального pH закрывает поры и инкапсулирует PFP внутри FRT для формирования наночастиц. При pH 5,0 3 мин низкоинтенсивного фокусированного ультразвука (LIFU, 2 Вт/см²) значительно усиливали US-сигнал FA-FRT-PFP через эффект акустической капельной парообразования (ADV). При идентичных условиях 4 мин LIFU облучения вызывали разрушение пузырьков, генерируемых FA-FRT-PFP. FA-FRT-PFP эффективно таргетировались в клетки рака яичника и значительно усиливали US-контраст FA-FRT-PFP после 3 мин LIFU облучения. После 4 мин LIFU облучения жизнеспособность клеток значительно снижалась из-за некроза, вероятно, из-за FA-FRT-PFP посреднического освобождения PFP в кислой среде лизосом после входа в опухолевые клетки. PFP затем трансформируется в пузырьки, которые лопаются под LIFU облучением, формируя физические ударные волны, ведущие к разрушению клеточной структуры и некрозу, достигая лечения опухоли. В совокупности это демонстрирует, что FA-FRT-PFP является новым и перспективным US тераностическим агентом для будущей клинической аппликации.

Введение

Рак яичника — один из самых смертоносных женских раков во всем мире. Лечение рака яичника клинически по-прежнему зависит от лучевой терапии, химиотерапии, хирургии и других вспомогательных терапий. Однако недостатки этих стратегий продолжают препятствовать улучшению выживаемости пациентов. Для преодоления этих недостатков требуются более эффективные и безопасные диагностические методы. В последние годы интеграция визуализации и терапии в единую платформу лечения стала горячей темой.

Ультразвуковая (US) технология благодаря своей неинвазивности, нерадиоактивности, низкой стоимости и специфическим характеристикам широко используется в клинической диагностике и лечении опухолей. В последние десятилетия разработали платформу акустического ответа (ARP) с возможностями US визуализации и терапии для эффективной диагностики и лечения опухолей. ARP в основном включает микропузырьки или нанопузырьки (MB или NB) и наночастицы (NP) на основе платформ. Среди этих ARP, MB или NB показывают хорошие акустические способности, но из-за большого размера в vivo проникновение в ткани слабое и стабильность образца плохая. NP демонстрирует более сильную тканевую проницаемость и более длинный фармакокинетический цикл из-за малого размера. Однако акустические способности NP ограничены. Поэтому срочно нужно проектировать ARP малого размера, с высокой стабильностью и сильной чувствительностью.

Жидкие фторуглероды проходят жидкость-газ фазовый переход в ответ на внешнее стимулирование. Наталья и коллеги разработали наноэмульсию, содержащую жидкий фторуглерод, который производил эффекты акустической капельной парообразования (ADV) под низкоинтенсивным фокусированным ультразвуком (LIFU). Эмульсии формировали пузырьки и одновременно запускали высвобождение лекарства, тем самым позволяя лечение опухолей. Однако слой герметизирующего материала, обернутый вокруг жидкого фторуглерода, привел к увеличению интенсивности и времени ультразвука, необходимого для лечения опухоли, что приводило к повреждению окружающих здоровых тканей. Дальнейшая оптимизация носителя жидкого фторуглерода поэтому требуется.

В этом исследовании мы разработали ферритиновую (FRT) наночастицу, загруженную жидким фторуглеродом перфторпентаном (PFP), которая была дополнительно объединена с мишеневой молекулой фолиевой кислоты (FA) для формирования FA-FRT-PFP. Ферритин — высокобиосовместимый эндоогенный наноклеточный белок, демонстрирующий pH-чувствительность. Белок может диссоциироваться в кислой среде и реассоциироваться в щелочной среде. Это позволяет контролируемой загрузке и высвобождению ферритина в ответ на изменения pH. PFP — часто используемый материал фазового перехода с температурой кипения 29 °C. Низкая температура кипения облегчает легкий фазовый переход LIFU, что безопаснее HIFU. PFP загружали в ферритин, и полученный FA-FRT-PFP имел диаметр ~ 47,3 ± 2,8 нм с высокой стабильностью в физиологических растворах и температурах. Согласно результатам, FA-FRT-PFP имел следующие преимущества: (1) PFP мог легко загружаться в FRT изменением pH от кислого к нейтральному; (2) под LIFU (2 Вт/см², 3 мин) и pH = 5,0 FA-FRT-PFP высвобождает PFP и проходит фазовые изменения для усиления US сигналов через ADV; (3) под длительным LIFU облучением (4 мин) и pH = 5,0 высвобожденный из FA-FRT-PFP PFP взрывается и производит физическую ударную волну, которая может эффективно разрушать опухолевые клетки через некроз. На наше знание, это первый пример загрузки PFP в FRT как US тераностического агента для опухолей. Эти результаты указывают на то, что FA-FRT-PFP + LIFU — новая стратегия для интегрированной диагностики и лечения опухолей.

Материалы и методы

Материалы

Агарозный гель, ферритин (FRT), фолиевая кислота (FA) и перфторпентан (C₃F₈, PFP) приобретены в Sigma (St. Louis, MO, USA). NH₂-PEG₂₀₀₀-FA и NH₂-PEG₂₀₀₀-COOH поставлены Xi'an Ruixi Biotechnology Co., Ltd. (Китай). 1-этил-3-(3-диметиламинпропил) карбодиимид (EDC) и N-гидроксисукцинимид (NHS) куплены в Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Набор для подсчета клеток-8 (CCK-8) получен от Dojindo Laboratories (Kumamoto, Япония). Модифицированное среднее Дюльбекко (DMEM), фосфатно-буферный раствор (PBS), пенициллин-стрептомицин, трипсин-EDTA и фетальная телячья сыворотка (FBS) приобретены в Gibco (Grand Island, NY, USA).

Клеточная культура

Линия человеческих клеток рака яичника SK-OV-3 предоставлена Шанхайским институтом клеточной биологии Китайской академии наук. Нормальные эпителиальные клетки яичника HUM-CELL-0088 получены от PriCells, Ухань, Китай. Клетки культивировали в среде DMEM с 10% фетальной телячьей сыворотки и 1% пенициллин-стрептомицина. Клетки поддерживали в инкубаторе с увлажненной атмосферой, содержащей 5% CO₂ при 37 °C.

Приготовление FA-FRT-PFP

Во-первых, мишеневая молекула FA конъюгировали с FRT через этерификационную реакцию. Кратко, NH₂-PEG₂₀₀₀-FA (10 мг) и раствор FRT смешивали при наличии EDC (5 мг/мл) и NHS (20 мг/мл). После 3-часовой реакции при комнатной температуре с легким перемешиванием смесь очищали диализом против дистиллированной воды (MW cut-off = 1,2 кДа) в течение 24 ч. Полученный раствор был FA-FRT наночастицами. Во-вторых, загрузка PFP в полость FRT готовили процессом денатурации и ренатурации белка. Кратко, FA-FRT разбавляли в 5 мл PBS до 2 мг/мл и регулировали pH = 5,0 с 30-минутным легким перемешиванием при комнатной температуре для обеспечения полной диссоциации FRT. После этого 500 мкл PFP добавляли в раствор в ледяной бане и подвергали импульсной соникации 5 с вкл / 5 с пауза в сумме 5 мин при 80 Вт в ледяной бане. После соникации pH смеси регулировали до нейтрального (pH = 7,4). Поскольку PFP был в масляном состоянии и нерастворим в воде, избыточный PFP легко удаляли жидкостным разделением для получения FA-FRT-PFP. FRT-PFP готовили похожим методом за исключением замены NH₂-PEG₂₀₀₀-FA на NH₂-PEG₂₀₀₀-COOH.

Характеристика FA-FRT-PFP

Размеры и дзета-потенциалы наночастиц тестировали на Zeta Sizer (Malvern, NanoZS, UK). Морфологию FA-FRT-PFP наблюдали трансляционной электронной микроскопией (TEM, Hitachi, Япония) и инвертированной флуоресцентной микроскопией (Olympus, Япония). Химическую структуру наночастиц определяли Фурье-трансформационной инфракрасной спектроскопией (Bruker Tensor 27, Bruker Optik, Ettlingen, Германия). Клеточное поглощение FA-FRT-PFP детектировали конфокальной лазерной сканирующей микроскопией (LEXT OLS4100, Olympus, Япония). FITC/PI двойно окрашенные клетки анализировали потоковой цитометрией (BD, Franklin Lakes, NJ, USA).

Характеристика pH и ультразвуково-ответной газогенерации

FA-FRT-PFP в условиях pH = 5,0 и 7,5 облучали разными акустическими интенсивностями LIFU (1,5 и 2,0 Вт/см²) и разным общим временем (1, 2, 3 и 4 мин) в агарозной гелевой модели, затем US изображения наблюдали US оборудованием (Esaote Mylab 90, Италия) с частотой 5–12 МГц и механическим индексом (MI) 0,06. После этого внешний вид FA-FRT-PFP наблюдали световой микроскопией во времени. US интенсивность области интереса на US изображении анализировали программным обеспечением ImageJ.

Клеточное поглощение

Кратко, 1 мг FITC растворяли в 1 мл DMSO и затем смешивали с FRT-PFP и FA-FRT-PFP на 30 мин с легкой агитацией. Затем смешанный раствор диализировалиovernight в деионизированной воде для удаления свободного FITC и DMSO для получения FITC-маркированных наночастиц. Далее SK-OV-3 и нормальные яичниковые клетки (HUM-CELL-0088) культивировали в среде 24 ч, а затем свободный FITC, FITC-маркированные FRT-PFP и FA-FRT-PFP ко-инкубировали с SK-OV-3 клетками 5 ч. Кроме того, FITC-маркированные FA-FRT-PFP инкубировали с FA-предобработанными SK-OV-3 клетками 5 ч. Клетки промывали 3 раза PBS и фиксировали 4% параформальдегидом и окрашивали 0,2 мг/мл DAPI раствором 10 мин. Клетки образовывали конфокальной лазерной сканирующей микроскопией для захвата флуоресцентных изображений. Флуоресцентный сигнал kvantифицировали потоковым цитометром.

Ультразвуковая визуализация In Vitro

SK-OV-3 клетки культивировали 24 ч в среде без FA, затем PBS, FRT-PFP и FA-FRT-PFP, и FA-FRT-PFP + FA инкубировали с SK-OV-3 клетками 6 ч. Клетки собирали и смешивали с агарозным гелем, затем клетки облучали с или без LIFU 3 мин (1 с вкл и 1 с пауза в сумме 3 мин; 1 МГц; 2,0 Вт/см²). В конце US изображения захватывали.

In Vitro противоопухолевая эффективность

SK-OV-3 клетки посевали в 96-колодчатую пластинку при плотности 1 × 10⁴ клеток/колодезь и позволяли прикрепляться 24 ч. Для цитотоксичности FA-FRT различные концентрации (0, 20, 40, 100, 200, 500 мкг/мл) FA-FRT культивировали с SK-OV-3 клетками. После 24-часового лечения клетки обрабатывали средой DMEM, содержащей 10% CCK-8, 20 мин в инкубаторе. Абсорбция клеток при длине волны 450 нм детектировали мультимодальным читателем пластин (Thermo Scientific) для характеристики жизнеспособности клеток. Кроме того, SK-OV-3 клетки и нормальные яичниковые клетки (HUM-CELL-0088) обрабатывали PBS, FRT-PFP, FA-FRT-PFP и FA-FRT-PFP + FA 3 ч, а затем облучали LIFU (1 с с 1 с паузой в сумме 4 мин; 1 МГц; 2,0 Вт/см²). Обработанные клетки инкубировали еще 21 ч. В качестве контроля, без LIFU, клетки обрабатывали PBS, FRT-PFP, FA-FRT-PFP и FA-FRT-PFP + FA 24 ч. После этого жизнеспособность обработанных клеток детектировали CCK-8 анализом.

Анализ клеточной смерти

Для оценки типа клеточной смерти SK-OV-3 клетки посевали в 6-колодчатые пластинки при плотности 5 × 10⁴ клеток/мл. После 24 ч клетки обрабатывали PBS, FRT-PFP, FA-FRT-PFP и FA-FRT-PFP + FA 3 ч, затем облучали LIFU (1 с, пауза 1 с в сумме 4 мин; 1 МГц; 2,0 Вт/см²). Обработанные клетки инкубировали дополнительные 23 ч. В качестве контроля клетки обрабатывали PBS, FRT-PFP, FA-FRT-PFP и FA-FRT-PFP + FA 24 ч в отсутствии LIFU. Клетки трипсинизировали, центрифугировали при 1500×g 3 мин, промывали 3 раза ледяным PBS, и ресуспендировали в 200 мл связующего буфера. Затем 5 мкл аннексина V-FITC и 10 мкл PI добавляли и инкубировали с клетками 15 мин в темноте. Окрашенные клетки анализировали потоковым цитометром.

Вестерн-блоттинг

Вестерн-блоттинг проводили согласно предыдущей литературе. Клетки обрабатывали 40 мкг/мл PBS (контроль), FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA и FA-FRT-PFP в комбинации с или без LIFU облучения (2,0 Вт/см², 4 мин) и дальнейшие 21 ч инкубации. Затем обработанные клетки лизировали в RIPA буфере (Sigma). Пятьдесят микрограммов каждого белка с буфером образца Лаэммли варили 5 мин и подвергали SDS-PAGE. Белки переносили на PVDF мембрану (Bio-Rad Laboratories) используя полусухой транс-блот (Bio-Rad Laboratories). Блоты сначала инкубировали в TBS блокирующем буфере, содержащем 2% молока или 2% BSA (для фосфо-специфических антител) 1 ч при комнатной температуре, затем с соответствующими первичными антителами, разбавленными в TBST (содержащем 0,1% Tween20 и 2% BSA) overnight при 4 °C. После этого блоты промывали и инкубировали с соответствующими вторичными антителами (Santa Cruz) в TBST и детектировали SuperSignal West Pico Хемилюминесцентным субстратом (Thermo).

Статистический анализ

Все данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Статистические анализы выполняли t-критерием Стьюдента. *P < 0,05, **P < 0,01 считались статистически значимыми.

Результаты и обсуждение

Приготовление и характеристика FA-FRT-PFP

FA-FRT-PFP синтезировали и использовали для терапии опухолей (рис. 1). Фазово-переходные капли загружали в FRT через pH-индуцированную обратимую диссоциацию и реассоциацию FRT. PFP с LIFU-индуцированным ADV доставляли в клетки и действовали как ультразвуковой образзующий агент. Рис. 2a–c показывает TEM-изображения FRT, FRT-PFP и FA-FRT-PFP, которые имели сферическую морфологию. Средние размеры частиц FRT, FRT-PFP и FA-FRT-PFP составляли 6,9 ± 0,3 нм, 43,8 ± 1,6 нм и 47,3 ± 2,8 нм соответственно (рис. 2d), демонстрируя, что загрузка PFP и конъюгация FA увеличивали размер FRT. Средние дзета-потенциалы FRT и FA-FRT-PFP составляли −43,2 ± 3,1 мВ, −46,9 ± 2,2 мВ и −41,5 ± 2,7 мВ соответственно (рис. 2e). Более того, конъюгация FA с FRT характеризовали FT-IR как показано в Доп. файл 1: Рисунок S1. FT-IR спектр показывал полосы поглощения ~ 1110 см⁻¹, соответствующие вибрационной C–O–C эфирной связи PEG; пики поглощения ~ 1601 см⁻¹ и ~ 1710 см⁻¹ принадлежат вибрационным C=O связям от PEG и FRT, а также от –COOH и –CONH₂ FA и FRT; полосы ~ 2820 см⁻¹, ~ 2920 см⁻¹ и ~ 2950 см⁻¹ соответствуют асимметричным и симметричным растяжениям C–H вибраций –CH₂ FA и PEG; пики поглощения ~ 1440 см⁻¹ ассоциированы с фенильным кольцом FA. Результат подтверждает успешную конъюгацию FA с FRT. В течение 28-дневного периода хранения размер и PDI FA-FRT-PFP в воде, PBS, физиологическом растворе и FBS не имели значительных изменений (рис. 3a, b), указывая на то, что FA-FRT-PFP показывает отличную стабильность. Рис. 3c показывает изменение размера FA-FRT-PFP при различных температурах от 25 °C до 45 °C. Размер FA-FRT-PFP почти не менялся при снижении температуры до 25–40 °C, указывая на высокую стабильность ниже 40 °C. Когда температура достигала 45 °C, размер FA-FRT-PFP менялся от 42,1 нм до 6 нм, вероятно, из-за PFP в FA-FRT-PFP проходящего интенсивную газификацию, приводящую к разрыву наночастиц. Температура газификации FA-FRT-PFP увеличилась с 29 °C (температура газификации PFP под нормальным давлением) до 45 °C, вероятно, из-за покрытия оболочкой FRT.

Схематческое представление синтеза FA-FRT-PFP и его применения в тераностике опухолей

a–c TEM изображения FRT, FRT-PFP и FA-FRT-PFP. d, e Распределение размера и дзета-потенциала FRT, FRT-PFP и FA-FRT-PFP

a, b Изменение размера и PDI FA-FRT-PFP в воде, PBS, физрастворе и FBS за 28 дней. c Изменение размера FA-FRT-PFP при различных температурах от 25 °C до 45 °C

pH и LIFU ответная US усиление

US фантомные эксперименты FA-FRT-PFP проводили при разных значениях pH и интенсивности LIFU. Как показано на рис. 4a, в отсутствии LIFU облучения (pre) US сигнал был слабым во всех группах. При pH 7,5 после 3 мин LIFU облучения FA-FRT-PFP показывал низкий US сигнал как при 1,5, так и при 2,0 Вт/см², тогда как при pH = 5,0 при том же времени LIFU облучения FA-FRT-PFP имел более сильную интенсивность US сигнала. Это продемонстрировало, что FA-FRT-PFP показывает время- и акустическую интенсивность-зависимые ADV эффекты. Это было потому, что при pH = 5,0 FA-FRT-PFP диссоциацировался и высвобождал PFP, делая его легче для прохождения фазового перехода. Интересно, когда время LIFU облучения удлиняли до 4 мин, FA-FRT-PFP при pH = 5,0 и 2,0 Вт/см² LIFU имел более слабую интенсивность US сигнала по сравнению с более низким временем облучения, вероятно, из-за LIFU при этом условии слишком сильный, индуцирующий разрыв пузырьков. Эти результаты продемонстрировали, что FA-FRT-PFP мог высвобождать PFP, генерируя фазовые переходы и взрыв при 2,0 Вт/см² LIFU облучении при pH = 5,0. Результаты US интенсивности показаны на рис. 4b, c. Рис. 4d–g показывает морфологию растворов FA-FRT-PFP после 3 мин LIFU облучения (2,0 Вт/см²) и при pH = 7,5 и 5,0. FA-FRT-PFP при pH = 5,0 и 2,0 Вт/см² LIFU генерировал крупные пузырьки, дополнительно подтверждая наши находки.

a US изображения FA-FRT-PFP смешанного с агарозным гелем при разных pH и облученного разной LIFU интенсивностью. b, c Соответствующие статистические данные US сигнала в a. d–g Оптические микроскопии изображения FA-FRT-PFP смешанного с агарозным гелем при разных pH и облученного 2,0 Вт/см² на 3 мин

Клеточное поглощение

Рис. 5 показывает клеточное поглощение FA-FRT-PFP. Клетки, обработанные свободным FITC, показали пренебрежимую флуоресценцию, но после маркировки на FA-FRT-PFP сильный флуоресцентный сигнал был очевиден, указывая на то, что FA-FRT-PFP имеет сильную способность к клеточному поглощению. Клетки, обработанные FRT-PFP и FA-FRT-PFP с предварительной инкубацией FA, показывали более слабую FITC флуоресценцию. Это дополнительно продемонстрировало, что FA усиливает активное таргетирование наночастиц. Кроме того, FA-FRT-PFP показывал сравнимое поведение поглощения с FCM (рис. 5c, d). Поглощение FA-FRT-PFP составляло 46,5 ± 2,8%, что значительно выше, чем у свободного FITC (контроль), FRT-PFP и FA-FRT-PFP + FA. Кроме того, Доп. файл 1: Рисунок S2 показывает клеточное поглощение наночастиц в нормальных яичниковых клетках. Нет значительных различий между FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA и FA-FRT-PFP группами в клеточном поглощении. Это, вероятно, из-за того, что нормальные яичниковые клетки (HUM-CELL-0088) имеют низкую экспрессию FA рецептора по сравнению с SK-OV-3 клетками.

Клеточное поглощение. a, b Конфокальные флуоресцентные изображения клеток, обработанных свободным FITC и FITC-маркированными FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA и FA-FRT-PFP. Зеленый и синий цвета представляли FITC и DAPI флуоресценцию соответственно. Масштаб = 25 мкм. c, d FITC флуоресцентный сигнал и соответствующие статистические данные внутри клеток, обработанных свободным FITC и FITC-маркированными FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA и FA-FRT-PFP

In Vitro ультразвуковая визуализация

Для подтверждения того, что FA-FRT-PFP усиливает ультразвуковую визуализацию ADV in vitro, наночастицы инкубировали с клетками 5 ч и облучали с или без LIFU (2,0 Вт/см²). Как показано на рис. 6a в отсутствии LIFU облучения клетки во всех тестированных группах не показывали усиленных US сигналов, в то время как после LIFU облучения клетки, обработанные FA-FRT-PFP, показывали высокие US интенсивности по сравнению с контролем FRT-PFP и FA-FRT-PFP + FA группами соответственно. Для ультразвуковой визуализации количественный анализ значений серого рассчитывали программным обеспечением ImageJ. Результаты были согласованы с US визуализационными данными (рис. 6b) показывая, что US интенсивность клеток, обработанных FA-FRT-PFP, усиливалась после облучения LIFU при 2,0 Вт/см² на 3 мин. FA-FRT-PFP входит в клетки и в кислой среде лизосом (pH ~ 5,0) диссоциацируется и высвобождает PFP в цитоплазму. После LIFU облучения PFP легко генерировал фазовые переходы от капель к газу, что усиливало US интенсивность.

Ультразвуковая визуализация in vitro. a Ультразвуковые изображения и соответствующие статистические данные (b) PBS (контроль), FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA и FA-FRT-PFP обработанных клеток с или без LIFU облучения (2,0 Вт/см², 3 мин)

In Vitro противоопухолевая эффективность и анализ клеточной смерти

Рис. 7a показывает цитотоксичность FA-FRT-PFP при концентрациях до 0,5 мг/мл. В отсутствии LIFU облучения FA-FRT-PFP не показывал явного подавления жизнеспособности SK-OV-3 клеток. CCK-8 анализы использовали для анализа противоопухолевой эффективности FA-FRT-PFP в комбинации с LIFU. Как показано на рис. 7b, в отсутствии LIFU облучения FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA и FA-FRT-PFP не демонстрировали заметной цитотоксичности по сравнению с контрольными группами. При комбинации с 4 мин LIFU облучения FA-FRT-PFP показывал значительную цитотоксичность, которая была выше, чем у FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA, с пиковыми уровнями ингибирования клеток, приближающимися к 90% при 40 мкг/мл. Это может быть связано с тем, что FA-FRT-PFP более легко поглощается в цитоплазму, а затем в лизосомы по сравнению с FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA. В кислой среде лизосом FA-FRT-PFP высвобождал PFP в цитоплазму. Под 4 мин LIFU облучением высвобожденный PFP газифицировался, вызывая кавитацию и разрыв, генерируя серию физических ударных сил, значительно усиливающих эффекты убийства опухолей. Более того, Доп. файл 1: Рисунок S3 показывает цитотоксичность наночастиц в нормальных яичниковых клетках. Нет значительных различий между FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA и FA-FRT-PFP группами в цитотоксичности при комбинации с LIFU. Результат может быть связан с тем, что HUM-CELL-0088 клетки имеют низкую экспрессию FA рецептора, не показывая FA таргетирующий эффект.

In vitro противоопухолевая эффективность. a Жизнеспособность SK-OV-3 клеток после 24 ч инкубации с разными концентрациями FA-FRT-PFP. b Жизнеспособность SK-OV-3 клеток, обработанных 40 мкг/мл PBS (контроль), FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA и FA-FRT-PFP в комбинации с или без LIFU облучения (2,0 Вт/см², 4 мин) и дальнейшие 21 ч инкубации

Как показано на рис. 8a, b, в отсутствии LIFU облучения клетки показывали минимальную клеточную смерть во всех группах. После 4 мин LIFU облучения клетки, обработанные FA-FRT-PFP, показывали значительный некроз (~91,6%) по сравнению с другими группами из-за физических ударных волн, генерируемых LIFU-индуцированной кавитацией PFP или взрывом пузырьков. Более того, Доп. файл 1: Рисунок S4 показывает уровень TNF белка клеток. Без LIFU клетки почти не экспрессировали TNF белок. В то время как с LIFU клетки в группе FA-FRT-PFP имели высокий уровень TNF экспрессии по сравнению с FRT-PFP и FA-FRT-PFP + FA группами, указывая на то, что TNF белок был жизненно важным FA-FRT-PFP + LIFU-индуцированным смертоносным белком. Основываясь на отличном in vitro эффекте терапии рака, FA-FRT-PFP перспективен для будущей in vivo терапии рака.

a Анализ потоковой цитометрии и соответствующие статистические данные SK-OV-3 клеток, обработанных 40 мкг/мл PBS (контроль), FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA и FA-FRT-PFP в комбинации с или без LIFU облучения (2,0 Вт/см², 4 мин) и дальнейшие 23 ч инкубации

Заключение

В резюме, мы успешно разработали FRT-базированные и PFP-загруженные фазово-переходные наночастицы, модифицированные мишеневой молекулой FA (FA-FRT-PFP). Как новый таргетированный US тераностик, FA-FRT-PFP имел множественные преимущества: (1) FA-FRT-PFP имел наномасштабный размер частиц; (2) FRT использовался как носитель, который мог диссоциироваться и реассоциироваться для загрузки и высвобождения PFP капель при кислых и нейтральных условиях соответственно; (3) под 3 мин LIFU помощи и кислых условиях FA-FRT-PFP высвобождал PFP и генерировал фазовые переходы через ADV, что могло значительно увеличить его US контраст; (4) под 4 мин облучением LIFU и кислой средой высвобожденный PFP мог легко индуцировать внутриклеточный «эффект взрыва», приводящий к физическим противоопухолевым характеристикам. Эти результаты демонстрируют, что FA-FRT-PFP с LIFU помощью предоставляет новую стратегию для ультразвуковой молекулярной визуализации и терапии опухолей.

Доступность данных и материалов

Выводы, сделанные в этой рукописи, основаны на данных, которые все представлены и показаны в этой статье.

Аббревиатуры

ADV:

Акустическая капельная парообразование

ARP:

Платформа акустического ответа.

CCK-8:

Набор для подсчета клеток-8

EDC:

1-Этил-3-(3-диметиламинпропил) карбодиимид

FA:

Фолиевая кислота

FBS:

Фетальная телячья сыворотка

FITC:

Флуоресцеин изотиоцианат

FRT:

Ферритин

LIFU:

Низкоинтенсивный фокусированный ультразвук

NHS:

N-гидроксисукцинимид

PFP:

Перфторпентан

US:

Ультразвук