Зеленый синтез серебряных наночастиц с дрожжевым экстрактом: контролируемая морфология и усиленная антибактериальная активность

Аннотация

Биосинтез для получения антимикробных серебряных наночастиц (Ag NP) — зеленый метод без использования цитотоксичных восстановителей и ПАВ. Здесь формо-контролируемые и хорошо диспергированные Ag NP получены биосинтезом с дрожжевым экстрактом как восстановителем и каппинг-агентом. Синтезированные Ag NP демонстрируют равномерную сферическую форму и тонкий размер со средним диаметром 13,8 нм. Биомолекулы восстановительных аминокислот, альфа-линоленовой кислоты и углеводов в дрожжевом экстракте играют значительную роль в формировании Ag NP, что доказано ФТИР-анализом. Кроме того, аминокислоты на поверхности Ag NP несут чистый отрицательный заряд, максимизируя электростатические отталкивающие взаимодействия в щелочном растворе, обеспечивая благоприятную стабильность более года без выпадения осадка. Ag NP в комбинации с ампициллином обращают резистентность в ампициллин-резистентных клетках E. coli. Эти монодисперсные Ag NP могут быть перспективной альтернативой для дезинфекции многолекарственно-резистентных бактериальных штаммов, они демонстрируют пренебрежимую цитотоксичность и хорошую биосовместимость к клеткам Cos-7.

Введение

Лекарственно-резистентные инфекции — главная причина смертности и серьезный риск для общественного здоровья. Растущая резистентность к антимикробным препаратам — срочная проблема медицины. Ряд штаммов Staphylococcus aureus резистентны к метициллину и являются главной причиной нозоκοмиальных инфекций. Другие антибиотикорезистентные бактерии: пенициллин-резистентные Neisseria gonorrhoeae и многолекарственно-резистентные Escherichia coli (E. coli). Основные механизмы резистентности: увеличенный эффлюкс и сниженное поглощение антибиотиков. Еще один механизм — экспрессия ферментов, модифицирующих молекулярную структуру антибиотиков. Хотя много усилий направлено на разработку следующего поколения антимикробных агентов, растет потребность в превосходных методах дезинфекции.

Серебряные наночастицы (Ag NP) применяются во многих областях: белковые носители, радиосенсибилизаторы, повышение эффективности солнечных топливных элементов, антибактериальные агенты. Среди наночастиц, включая металлосодержащие, Ag NP наиболее широко используются как антимикробные агенты. В реальности Ag NP показывают значительную антимикробную активность против бактериальных штаммов, но пренебрежимую цитотоксичность к животным клеткам. Более того, Ag NP проявляют активность против грибков, определенных вирусов и антибиотикорезистентных бактерий. Что касается механизма действия: подавление репликации ДНК, блокировка электрохимического потенциала, необходимого в цитоплазматических мембранах, и подавление дыхательной цепи — основные механизмы действия Ag NP. Таким образом, размер, поверхностная структура и контролируемые формы Ag NP играют решающую роль в их антимикробной активности и других применениях. Общий метод приготовления Ag NP включает восстановление ионов серебра в присутствии подходящего ПАВ для контроля роста. Большинство восстановителей и ПАВ проявляют цитотоксичность к тканям человека и потенциально загрязняют окружающую среду. Поэтому разработка зеленых методов получения формо-контролируемых Ag NP необходима.

В этой работе представлен новый маршрут биосинтеза Ag NP с использованием дрожжевого экстракта. В процессе дрожжевой экстракт поставляет восстановители и каппинг-агенты, включая аминокислоты, витамины и углеводы, тогда как ионы серебра служат электрон-акцепторами. В результате благоприятная стабильность, обеспечиваемая органическими каппинг-агентами на поверхности, позволяет сохранять монодисперсные Ag NP более года без выпадения осадка. Обнаружено, что Ag NP демонстрируют превосходную антибактериальную активность по сравнению с ампициллином против ампициллин-резистентных клеток E. coli. По сравнению с конвенционными синтетическими методами, представленный биосинтез биосовместим, экономичен и экологически безвреден. Кроме того, формо-контролируемые и хорошо диспергированные Ag NP показывают хороший антибактериальный эффект против E. coli.

Методы

Материалы

Нитрат серебра (AgNO₃), сахароза (C₁₂H₂₂O₁₁), хлорид натрия (NaCl), гидроксид натрия (NaOH) — Sinopharm Co., Ltd. Сухие пекарские дрожжи — AB/MAURI Co., Ltd. E. coli — TransGen Biotech Co., Ltd. Набор CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) — Promega Biotech Co., Ltd. Плазмида pcDNA3.4, 1×NuPAGE® LDS образцовый буфер, DMEM и фетовый бычий сивороточный белок (FBS) — Thermo Fisher Scientific Inc. Ампициллин и среда LB — Sangon Biotech Co., Ltd. Все химикаты аналитического чистоты, без дополнительной очистки. Деионизированная ультрачистая вода (18,2 МОм·см) использовалась во всех экспериментах.

Синтез Ag NP

Заготовленные дрожжевые клетки инокулировали в среду LB и инкубировали при ~150 об/мин за ночь при 25 °C для активации. Активированные дрожжевые клетки промывали 0,9% физиологическим раствором и диспергировали в 2% сахарозном растворе с перемешиванием ~150 об/мин 6 ч при 25 °C. Бесклеточный дрожжевой экстракт собирали центрифугированием 2000 об/мин 5 мин для биосинтеза Ag NP. В биосинтетическом процессе pH дрожжевого экстракта настраивали до 10 раствором NaOH, затем раствор AgNO₃ постепенно добавляли к вышеуказанному раствору при интенсивном магнитном перемешивании. Полученные Ag NP диализировали через мембраны 1 кДа 5 дней и сублимировали для дальнейшей характеристики.

Характеризация

ТЭМ-изображения Ag NP на JEM-2100 (200 кВ, JEOL, Япония). СЭМ на Carl Zeiss ULTRA plus с EDS при 20 кВ. UV-Vis поглощение на Lambda 950 (Perkin-Elmer, США). XRD на D8 Advance (Bruker, Германия). ФТИР 4000–500 см⁻¹ в таблетках KBr на Vertex 70 (Bruker, Германия). дзета-потенциал на Malvern Zeta Nano ZS-90 (Malvern, UK) при 25 °C. Поверхностные элементы XPS на Kratos AXIS Ultra DLD с монохроматическим Al Kα (1486,6 эВ) (Shimadzu, Япония). Аминокислотный состав на L-8900 высокоскоростном аминокислотном анализаторе (Hitachi, Япония).

Цитотоксичность (MTS)

Для исследования биосовместимости Ag NP использовали MTS-тест для оценки цитотоксичности. Клетки Cos-7 культивировали в DMEM с 10% FBS в увлажненном инкубаторе (5% CO₂, 37 °C). Клетки рассеивали в 96-колодчатых пластинках (10 000 клеток/колодез) 24 ч. Затем среду заменяли на свежий DMEM с разными концентрациями Ag NP. После еще 24 ч инкубации жизнеспособность определяли MTS. Абсорбция измеряли при 490 нм на SpectraMax® M5 (Molecular Devices, США). Необработанные клетки в DMEM — контроль.

SDS-PAGE

Стандартный SDS-PAGE с 10% (м/об) разделяющим гелем и 4% концентрирующим. Образцы кипятили 5 мин с 1×NuPAGE® LDS буфером и центрифугировали 12 000 об/мин 5 мин перед нанесением на гель. Стандартный белковый маркер — референс. Гели окрашивали 0,5% Кумасси блю. Изображения фиксировали GelDoc XR+ (Bio-Rad, США).

Исследование антимикробной активности

Для определения антимикробной активности синтезированные Ag NP тестировали на бактерицидную активность против E. coli. Одиночная колония E. coli выращивали за ночь при 37 °C в LB на орбитальном шейкере 150 об/мин. Колонии настраивали до OD 0,01–0,02 при 600 нм свежим LB. Затем 100 мкл серийных разбавлений Ag NP наносили в 96-колодчатые пластинки. Пластинки инокулировали 100 мкл разбавленного E. coli и инкубировали 16 ч при 37 °C. Жизнеспособность E. coli определяли измерением абсорбции 600 нм на SpectraMax® M5. Временной анализ проводили для оценки антибактериальной чувствительности во времени. Наконец, 100 мкл E. coli добавляли в стерильные пробирки с 10 и 20 мкг/мл Ag NP. Абсорбция 600 нм измеряли после 1, 2, 4, 6 ч.

Анализ количества колоний (CFU) для исследования Ag NP против антибиотикорезистентных бактерий. E. coli стабильно экспрессирует плазмиду pcDNA3.4 с геном β-лактамизы, дающей резистентность к ампициллину, как модель. Когда ампициллин-резистентные E. coli (E. coli-Amp⁺) достигали лог-факзы, их выращивали на LB-агаре при обработке только ампициллином или в комбинации с Ag NP, инкубировали 18 ч при 37 °C. Количество колоний E. coli-Amp⁺ на LB-агаре считали. Все тесты проводили минимум три раза.

Результаты и обсуждение

Синтез Ag NP

Как схематично показано на схеме 1, приготовление Ag NP начиналось с самоассемблирования биомолекул в дрожжевом экстракте для формирования дрожжевых мицелл. Затем Ag⁺ восстанавливался in situ восстановителями в дрожжевом экстракте: аминокислотами, витаминами, углеводами. Образующиеся Ag наночастицы стабилизировались биомолекулами. Поверхностное покрытие на Ag NP повышало аффинность к бактериальной мембране, увеличивая проницаемость стены клетки. Взаимодействие Ag NP с пептидогликаном меняло конфигурацию пептидогликана, в конечном счете приводя к апоптозу и повреждению бактерий.

Структурная характеристика Ag NP

Рис. 1a: типичное СЭМ-изображение показывает сферическую форму и тонкий размер синтезированных Ag NP. ЭДКС (рис. 1b) подтверждает формирование Ag NP. Сильный оптический пик поглощения ~3 кэВ — типичный для поверхностного плазмонного резонанса серебряных нанокристаллитов. Незначительные количества кислорода и углерода атрибутируются тонкому слою органического каппинга на синтезированных Ag NP. Реакция AgNO₃ с NaOH приводит к образованию небольшого количества Ag₂O, поэтому небольшое количество O также может быть от Ag₂O. Морфология и размер дополнительно охарактеризованы HRTEM. Ag NP диаметром 10,3–18,9 нм (рис. 1c), средний размер 13,8 нм (рис. 1d). Меньший размер и большая площадь поверхности позволяют Ag NP лучше взаимодействовать с бактериальной мембраной для усиленной антимикробной активности. Четкие решетчатые фриджи на HRTEM (рис. 2a) с интервалом 0,15 нм соответствуют плоскостям (220) серебра. Рис. 2b: кристаллическая природа Ag NP демонстрируется типичными SAED-картинами, где яркие кольца соответствуют плоскостям (311), (220), (200), (111).

UV-Vis спектр Ag NP (рис. 3a) показывает сильный пик при 418 нм из-за поверхностного плазмонного резонанса. Желтый раствор синтезированных Ag NP (рис. 3b) указывает на формирование Ag NP. XRD (рис. 3c) показывает четыре интенсивных пика при 77,36°, 64,30°, 43,52°, 38,16°, соответствующие плоскостям (311), (220), (200), (111) серебра (JCPDS № 04-0783). XRD подтверждает кристаллическую природу, согласуясь с предыдущими отчетами. ФТИР (рис. 3d) для характеристики потенциальных биомолекул на Ag NP. Широкий полос 3405 см⁻¹ — −OH растяжение. Слабый пик 2915 см⁻¹ — −CH₂ растяжение. Полоса 1655 см⁻¹ в дрожжевом экстракте — C=O растяжение карбоксильных групп, смещается до 1573 см⁻¹ в Ag NP из-за взаимодействия карбоксилов с Ag NP. Острый пик 1375 см⁻¹ — C–N растяжение. Полоса 1048 и 1083 см⁻¹ — C–O–C и C–OH растяжения. Эти результаты демонстрируют, что биомолекулы дрожжевого экстракта отвечают за биосинтез Ag NP. Поверхностное покрытие влияет на аффинность к бактериальной мембране. Состояния Ag NP дополнительно охарактеризованы XPS. Рис. 4a: полный скан XPS с четкими пиками C 1s, Ag 3d, Ag 3p, Ag 3s, O 1s. Ag 3d (5/2) и Ag 3d (3/2) при ~368,5 и 374,5 эВ (рис. 4b). Расщепление энергии 6,0 эВ подтверждает формирование Ag NP.

Поверхностный заряд Ag NP определен на Malvern Zeta Nano ZS-90 — важный параметр стабильности и дисперсности коллоидных растворов. дзета-потенциал — поверхностный электростатический потенциал на границе диффузного и компактного слоев, индикатор для биомедицинских полимеров. На рис. S1 (доп. файл): при pH 3 дзета-потенциал слегка отрицательный (−3,2 мВ). От pH 7,0 до 11,0 дзета-потенциал монотонно снижается от −12,1 до −24,4 мВ, подтверждая негативно заряженные группы на поверхности Ag NP. Gao и соавт. сообщали, что дисперсность и стабильность Ag NP главным образом атрибутируются поверхностному заряду. Наличие негативно заряженных групп улучшает стабильность и дисперсность Ag NP в водных растворах.

Цитотоксичность Ag NP и анализ биомолекул

Биосовместимость синтезированных Ag NP важна для биомедицинских применений. Для исследования цитотоксичности определяли жизнеспособность клеток Cos-7 MTS-тестом. Клетки инкубировали с Ag NP при разных концентрациях 24 ч. Рис. 5a: никакой значимой цитотоксичности не выявлено при концентрациях до 200 мкг/мл. Ag NP демонстрируют пренебрежимую цитотоксичность и хорошую биосовместимость к клеткам Cos-7.

Для изучения механизмов синтеза анализировали биомолекулы на поверхности Ag NP и в дрожжевом экстракте. Рис. 5b: SDS-PAGE анализ не показал детектируемого или маргинального белка на поверхности синтезированных Ag NP или в дрожжевом экстракте. Дальше определили биомолекулы в дрожжевом экстракте высокоскоростным аминокислотным анализатором. В доп. файле 1: таблица S1: в дрожжевом экстракте ~22 вида аминокислот, богатых глутаминовой кислотой, γ-амино-масляной кислотой, орнитином и альфа-линоленовой кислотой. Изоэлектрическая точка этих аминокислот ~6, кроме лизина и аргинина (~10–11). Также найдены компоненты с −NH₂: мочевина, аммиак, аспарагин, глутамин. Биомолекулы восстановительных аминокислот, альфа-линоленовой кислоты и углеводов в дрожжевом экстракте играют значительную роль в формировании Ag NP. Сообщалось, что NADH-зависимая редуктаза или нитрат-редуктаза фермент вовлечены в процесс восстановления при биосинтезе Ag NP через экстракт микроорганизмов.

Биомолекулы дрожжевого экстракта играют решающую роль в формировании Ag NP, защищая их от агрегации. Стабилизаторы биомолекул предотвращают избыточные реакции между Ag NP. Амфотерные молекулы аминокислот содержат основные и кислотные группы. Чистый заряд этих соединений может быть отрицательным или положительным в зависимости от pH изменений раствора дрожжевого экстракта, что влияет на связывающую способность при синтезе Ag NP. В щелочном растворе аминокислоты на поверхности Ag NP несут чистый отрицательный заряд, максимизируя электростатические отталкивающие взаимодействия. Биомолекулы из дрожжевого экстракта действуют как каппинг-агент и играют ключевую роль в контроле распределения размера, формы и морфологии при формировании Ag NP. Значение pH важный фактор, влияющий на контролируемый синтез Ag NP. При pH ниже 7 нуклеация происходит с низкой скоростью. Ag NP могут формироваться за несколько минут при более высоких pH, и размер частиц уменьшается с повышением pH. Демонстрирован оптимальный баланс между ростом и нуклеацией. Нестабильные и агломерированные Ag NP всегда присутствуют при экстремальных pH (>11).

Антибактериальная активность

E. coli широко оценивался для антимикробной активности Ag NP. Рост E. coli в присутствии или отсутствии Ag NP доказывает антимикробную способность. Рис. 6a: синтезированные Ag NP проявляют значительную антибактериальную активность в концентрационно-зависимом режиме против E. coli. Тест на ингибирование роста показал полное подавление E. coli при концентрациях Ag NP выше 20,0 мкг/мл по сравнению с негативным контролем. Половинная ингибирующая концентрация (EC₅₀) Ag NP — 13,4 мкг/мл. Доза 20,0 мкг/мл Ag NP показывала значительный антибактериальный эффект против E. coli на протяжении всего тестируемого времени, в то время как 10,0 мкг/мл показывала частичное ингибирование (рис. 6b).

Для исследования влияния Ag NP на антибиотикорезистентные бактериальные клетки оценивали антибактериальную активность против ампициллин-резистентных E. coli анализом CFU. E. coli-Amp⁺ стабильно экспрессирует высокую копийную плазмиду pcDNA3.4 с геном β-лактамизы, дающей ампициллин-резистентность. E. coli-Amp⁺ выращивали на LB-агаре при обработке только ампициллином или в комбинации с Ag NP. Ингибирующая активность приготовленных Ag NP представлена на рис. 7. Замечено, что Ag NP в комбинации с ампициллином демонстрируют превосходную антибактериальную активность по сравнению с ампициллином в одиночку. Напротив, обработка только ампициллином не имеет ингибирующей активности на E. coli-Amp⁺. Комбинационная терапия антибиотиков и Ag NP предоставляет дополнительную стратегию преодоления антибиотикорезистентных бактериальных клеток, улучшая текущие терапевтические подходы. Общие результаты вносят вклад в развитие альтернативных антибактериальных ингибиторов для лечения инфекций, вызванных многолекарственно-резистентными бактериальными штаммами.

Рис. 7: рост E. coli-Amp⁺ при обработке только ампициллином (50 мкг/мл) или в комбинации с Ag NP (25 мкг/мл). a — высокая плотность, b — низкая плотность клеток.

Существует великая необходимость в новых препаратах с разными механизмами для борьбы с бактериальной резистентностью. Благодаря мощной антимикробной активности Ag NP используются в медицинских изделиях, средствах личной гигиены и текстиле. Существует множество механизмов, которыми Ag NP борются с микробной резистентностью. Ag NP аккумулируются на поверхности бактериальной мембраны, увеличивая проницаемость стены клетки. Взаимодействие Ag NP с пептидогликаном меняет конфигурацию пептидогликана и тем самым повреждает бактериальную мембрану. Характеристики формы, поверхностной структуры, морфологии, дисперсности и биосовместимости Ag NP играют значительную роль в их антимикробной активности.

Заключение

Здесь сообщен новый биосинтетический метод приготовления Ag NP с использованием дрожжевого экстракта. Дрожжевые мицеллы формировались при смешивании Ag⁺ раствора с дрожжевым экстрактом. Биоредуцирующие биомолекулы играют главную роль в восстановлении Ag⁺. Кроме того, биомолекулы обеспечивают благоприятную стабильность, монодисперсность и контролируемое распределение размера для синтезированных Ag NP, демонстрируя хорошую стабильность более года без выпадения осадка. Высокоскоростной аминокислотный анализ показал, что дрожжевой экстракт богат биомолекулами: аминокислотами, альфа-линоленовой кислотой, амино-масляной кислотой. Ag NP проявляют значительную антибактериальную активность в концентрационно-зависимом режиме против E. coli. Тест ингибирования роста показал полное подавление E. coli при концентрациях Ag NP выше 20,0 мкг/мл. Ag NP в комбинации с ампициллином демонстрируют превосходную антибактериальную активность по сравнению с ампициллином в одиночку против ампициллин-резистентных E. coli (E. coli-Amp⁺). Поверхностные покрытия на Ag NP повышают аффинность к бактериальной мембране и увеличивают проницаемость стены клетки. Взаимодействие Ag NP с пептидогликаном меняет конфигурацию пептидогликана и в конечном счете приводит к апоптозу бактерий. Кроме того, эти Ag NP, стабилизированные биомолекулами, проявляют низкую цитотоксичность и хорошую биосовместимость к клеткам Cos-7.