Эффективность in situ хитосан-сребро наночастиц растворов против метициллиноустойчивого Staphylococcus aureus (MRSA)

Аннотация

Фон: Разработка новых терапевтик против метициллиноустойчивого Staphylococcus aureus (MRSA) — насущная медицинская задача. Антисептики, в отличие от антибиотиков, могут целиться в устойчивые штаммы, сохраняя нормальную микрофлору.

Материалы и методы: Мы оценили антибактериальную силу хитосан-сребро наночастиц (Ag NP) растворов, приготовленных in situ, варьируя соотношение хитосан к Ag. Ag NP синтезировали зеленым химическим путем, используя имбирный корневой экстракт и аскорбиновую кислоту; поверхностная модификация цетримонием бромидом (CTAB) также исследовали для улучшения диспергируемости. Полученные наночастицы и хитосан-Ag NP смеси характеризовали рентгеновской дифракцией (XRD), передаточной электронной микроскопией (TEM), Фурье-трансформ инфракрасной спектроскопией (FTIR) и UV-Vis спектроскопией.

Результаты и выводы: XRD, FTIR, UV-Vis и TEM подтвердили высокую чистоту и ожидаемый состав хитосана и Ag NP. Хитосан-Ag NP растворы продемонстрировали превосходную антимикробную эффективность по сравнению с их индивидуальными компонентами. В противовес, in situ приготовление хитосан-Ag NP/CTAB растворов привело к выпадению осадка и не могло быть оценено. Эти находки предполагают, что хитосан-Ag NP смеси — перспективная стратегия борьбы с лекарственно-устойчивыми бактериями.

Введение

Инфекции остаются ведущей причиной глобальной заболеваемости и смертности, движимой частично широким использованием антибиотиков, селекционирующим устойчивые организмы, такие как MRSA. MRSA инфекции охватывают спектр от поверхностных кожных поражений до жизнеугрожающих состояний как пневмония, эндокардит и сепсис, накладывая существенную экономическую нагрузку (≈$3–4 млрд ежегодно). Новые антибактериальные стратегии срочно нужны. Антисептики предлагают устойчивую активность против устойчивых штаммов без нарушения хозяина микробиоты. Комбинирование различных антибактериальных механизмов — например, металлов и натуральных полимеров — через гибридные наноматериалы представляет новый подход к победе над устойчивыми бактериями.

Серебро давно признано за свои антимикробные свойства, и серебряные наночастицы (Ag NP) демонстрируют мощные антибактериальные и антигрибковые эффекты. Они могут действовать синергетически с обычными антибиотиками, но также могут страдать от агрегации, неконтролируемого ионного выпуска и цитотоксичности. Включение Ag NP в биополимеры, такие как хитосан, может улучшить стабильность и антимикробную активность. Хитосан, полученный из хитина, биосовместим, бактериостатичен и подходит для медицинских применений. Поверхностная модификация Ag NP с CTAB может улучшить дисперсионную стабильность, хотя ее влияние на антибактериальную эффективность не полностью понято.

Цель этого исследования — определить оптимальное соотношение хитосан-Ag NP, дающее максимальную активность против клинических MRSA изолятов.

Методы

Материалы

Нитрат серебра, L-аскорбиновая кислота и CTAB (C16H33N(CH3)3Br) приобретены в Sigma-Aldrich. Имбирный корень закупали локально. Хитосан (200 кДа, 82 % деацетилирования) получен из Bioprogress. Ультрачистая вода (сопротивление > 17 МОм см⁻¹) и стандартные микробиологические среды использовались повсеместно.

In situ приготовление хитосан/Ag NP растворов

Ag NP сначала синтезировали восстановлением нитрата серебра имбирным экстрактом и аскорбиновой кислотой под рефлюксом при 60 °C в течение 1,5 ч. Полученные частицы промывали центрифугированием до нейтрального pH. Для CTAB-модифицированных Ag NP (Ag/CTAB NP), 3 мл 76,4 мг/мл Ag NP дисперсии смешивали с 20 мл 6,7 мг/мл CTAB раствора и ультразвуково обрабатывали 3 ч. CTAB загрузка количественно определялась UV-Vis при 190 нм.

Хитосан растворы (1 % м/об) готовили растворением 1 г хитосана в 100 мл 2 % уксусного к-та в течение 24 ч при комнатной температуре. Хитосан/Ag NP растворы затем формировали добавлением варьируемых объемов хитосана к Ag NP дисперсиям, генерируя диапазон хитосан и Ag NP концентраций (Таблица 1).

Физико-химическая характеристика

XRD выполняли на дифрактометре Empyrean (Cu Kα, 1,54 Å). TEM визуализация использовала JEM-ARM-200F при 200 кВ. FTIR спектры регистрировали на спектрометре Tensor 27 с KBr таблетками (1 мг образец / 200 мг KBr). UV-Vis поглощение измеряли на спектрометре Lambda 950 (200–800 нм). Все измерения реплицировали минимум три раза.

Микробиологические тесты

Семьдесят пациентских смаков (носовые и горло) посевали на крови агар. Пятьдесят штаммов Staphylococcus aureus изолировали и подтверждали стандартными биохимическими тестами. Антибиотикочувствительность оценивали Kirby-Bauer дисковой диффузионным методом на Мюллер-Хинтон агаре для азитромицина, левофлоксацина, кларитромицина, ципрофлоксацина и метициллина. MRSA штаммы определяли по CLSI руководствам.

Минимальные ингибирующие концентрации (MIC) хитосана, Ag NP и хитосан-Ag NP растворов определяли бульонным макродилучением. Семь двукратных серийных разбавлений каждого наночастичного препарата готовили в питательном бульоне, и 1, 2 или 3 мл 1 % хитосана добавляли в каждую пробирку. После засева 100 мкл стандартизированной бактериальной суспензии (≈1,5 × 10⁸ CFU мл⁻¹) и 24-часовой инкубации при 37 °C, наименьшая концентрация, предотвращающая видимый рост, записывали как MIC.

Результаты

Характеристика Ag NP и хитосана

CTAB адсорбция на Ag NP дала адсорбтивность 70,0 мг г⁻¹, соответствующую CTAB содержанию ~6,5 %. XRD паттерны показали характерные серебряные пики при 38,15°; 44,33°; 64,48°; 77,47° и 81,54° 2Θ, подтверждая кристаллическое Ag. Широкий пик (12,00–21,06°) указывал на остаточное органическое материалы. Хитосан показывал полукристаллические пики около 9° и 20° 2Θ. FTIR спектры раскрывали ожидаемые функциональные группы для хитосана (широкое O-H/N-H растяжение 3450–3200 см⁻¹, амид I при 1652 см⁻¹) и Ag NP (CO/CH изгиб, C=C/C=O растяжение). UV-Vis спектры Ag NP показывали поверхностный плазмонный резонанс пик при ~387 нм, сдвигающийся к ~417 нм после CTAB модификации, указывая на улучшенную дисперсионную стабильность. TEM изображения раскрывали преимущественно сферические Ag NP размером 10–12 нм.

Антибактериальная активность

Чистые Ag NP и Ag/CTAB NP показывали MIC 9,6 мкг мл⁻¹ против всех 10 штаммов MRSA. Хитосан в одиночку показывал MIC 6 мкг мл⁻¹, с 60 % штаммов ингибированных при 3,3–5 мкг мл⁻¹. Хитосан-Ag NP смесь достигла MIC до 1,2 мкг мл⁻¹ для Ag NP и 3,3 мкг мл⁻¹ для хитосана, представляя 2- до 4-кратные снижения по сравнению с индивидуальными компонентами. Попытки приготовить хитосан-Ag/CTAB смесь привели к выпадению осадка и не могли быть оценены.

Обсуждение

Наши находки подтверждают, что in situ смешивание хитосана с Ag NP синергетически улучшает антибактериальную активность против MRSA. Сниженные MIC подразумевают улучшенное взаимодействие с бактериальными клетками, потенциально через комбинированные механизмы: выпуск серебряных ионов и поликатионная поверхность хитосана, разрушающая мембраны. CTAB, в то время как стабилизирующий наночастицы, снижал антибактериальную эффективность и индуцировал осаждение, указывая на то, что поверхностная химия критически влияет на терапевтический потенциал. Будущие исследования должны оценить цитотоксичность хитосан-Ag NP формулировки для определения безопасных клинических дозировок.

Заключение

In situ приготовленные хитосан-Ag NP растворы демонстрируют выраженно превосходную активность против MRSA, снижая требуемые концентрации до четырех раз относительно их индивидуальных компонентов. Эта стратегия предлагает перспективный, потенциально персонализированный подход к противодействию антибиотикоустойчивым инфекциям. Дальнейшая оценка токсичности прояснит клиническую применимость.

Аббревиатуры

Ag NP

Серебряные наночастицы

CTAB

Цетримоний бромид

FTIR

Фурье-трансформ инфракрасная спектроскопия

MRSA

Метициллиноустойчивый Staphylococcus aureus

TEM

Передаточная электронная микроскопия

UV-Vis

Ультрафиолетово-видимая спектроскопия

XRD

Рентгеновская дифракция