Наночастицы черного фосфора усиливают остеогенное дифференцирование эктодермальных мезенхимальных стволовых клеток через урегуляцию TG2

Аннотация

Наночастицы черного фосфора (BP) при биобезопасных концентрациях активируют трансглутаминазу 2 (TG2) и урегулируют компоненты внеклеточной матрицы (ВКМ), тем самым ускоряя остеогенное дифференцирование эктодермальных мезенхимальных стволовых клеток (EMSC). BP демонстрируют отличную биосовместимость и биодеградабельность, делая их перспективными добавками для скаффолдов тканевой инженерии кости. In vitro BP (2–4 мкг мл⁻¹) значительно усилили остеогенные маркеры (RUNX2, ALP, COL-I, OCN, OPN, BMP-2) без влияния на пролиферацию. Ингибирование TG2 отменило эти эффекты, подтверждая TG2-зависимый механизм. Эти находки поддерживают клинический потенциал BP в стратегиях регенерации кости.

Введение

Эффективный ремонт кости требует материалов, которые являются остеокондуктивными, остеоиндуктивными и остеоинтегративными. Традиционные автотранспланты и аллотранспланты имеют ограниченную доступность и несут риски инфекции. Недавние достижения в биоматериалах — особенно ионно-высвобождающие керамики и биоактивные полимеры — улучшили результаты, однако материал, который естественно поставляет фосфат и способствует минерализации, остается неуловимым.

Черный фосфор (BP), слоистый двухмерный аллотроп, привлек внимание благодаря своей настраиваемой запрещенной зоне, высокой подвижности носителей и быстрой биодеградации к безвредным ионам фосфата. Предыдущая работа показывала, что нанолисты BP усиливают минерализацию, предоставляя доноров фосфата, но клеточные механизмы остаются слабо понятыми. Эктодермальные мезенхимальные стволовые клетки (EMSC), полученные из взрослой носальной слизистой, предлагают легко доступный, неинвазивный источник мультипотентных клеток, способных к остеогенному дифференцированию.

Мы исследовали, могут ли BP выступать остеоиндуктивными сигналами для EMSC и определили базовые пути, фокусируясь на TG2 — ключевом ферменте, который перекрестно связывает белки ВКМ и регулирует остеобласто-дифференцирование.

Материалы и методы

Приготовление наночастиц черного фосфора

Объемный BP (20 мг) диспергировали в насыщенном NaOH/NMP, механически измельчали и ультразвуково обрабатывали (6 ч) в ледяной бане. После фильтрации (100 мкм) и высокоскоростной центрифугировки (13 000 об/мин, 10 мин, 4 °C) получили стабильную BP суспензию. Размер частиц (132 нм) и дзета-потенциал (−23,7 мВ) подтверждались DLS; SEM подтвердил 100–150 нм листовидную морфологию. Раман и XRD спектры верифицировали фазовую чистоту BP.

Изоляция и культура EMSC

Взрослые крысы Sprague-Dawley анестезировали, и носальная перегородочная слизиста собиралась. Ткань дигерировали (0,25% трипсин, 37 °C, 25 мин) и проходили через 100 мкм сито. Клетки экспандировали в DMEM/F12 + 10% FBS, 100 Ед мл⁻¹ пенициллина, 100 мкг мл⁻¹ стрептомицина. Проход 3 клетки использовались для всех анализов; иммунофлуоресценция подтвердила >95% экспрессию нестин и виментин.

Остеогенное дифференцирование

EMSC посевали при 3000 клеток см⁻² и индуцировали остеогенным средством (10% FBS, 0,1 мМ дексаметазон, 0,2 мМ аскорбиновая кислота) в течение 14 дней (без β-глицерофосфата для избежания конфузов). Окрашивание щелочной фосфатазы (ALP) и Alizarin Red S (ARS) оценивали раннее и позднее дифференцирование соответственно. RT-qPCR измерял RUNX2, ALP, COL-I, OCN, OPN, BMP-2 на 7 и 14 днях.

Живучесть и пролиферация клеток

CCK-8 анализы оценивали токсичность BP (0–512 мкг мл⁻¹) после 24 ч. Ki-67 иммуноокрашивание kvantифицировало пролиферацию. Концентрации ≤32 мкг мл⁻¹ были нецитотоксичными; 2 и 4 мкг мл⁻¹ выбраны для функциональных исследований.

Механистические исследования

Вестерн блоттинг количественно определил TG2, фибронектин (FN), ламинин (LN), OCN, OPN, COL-I. Нейтрализующее антителo TG2 (10 мкг мл⁻¹) применяли для подтверждения вовлечения пути. Статистический анализ использовал t-тест Стьюдента и ANOVA (p < 0,05). Все эксперименты выполнялись в триplicates.

Результаты

Характеризация BP

DLS показал узкое распределение размеров (100–200 нм, пик 132 нм). Дзета-потенциал −23,7 мВ подтвердил коллоидную стабильность. SEM изображения соответствовали DLS данным. Раман пики при 362,3, 438,5, 466,9 см⁻¹ подтвердили структуру BP; XRD указал средний кристаллитный размер 102,7 нм.

Фенотип EMSC

Иммунофлуоресценция носальной слизистой выявила нестин-позитивные клетки в собственной пластинке. Проход 3 EMSC демонстрировали фибробластоидную морфологию и >95% нестин/виментин позитивность. Под остеогенной индукцией ARS окрашивание показало минеральные отложения на 28 день; адипогенная индукция дала Oil Red O окрашивание на 21 день.

Биосовместимость

CCK-8 анализы не показали значительной потери живучести до 32 мкг мл⁻¹. Ki-67 окрашивание подтвердило неизменную пролиферацию при 2 и 4 мкг мл⁻¹.

Усиление остеогенеза BP

ARS окрашивание выявило более крупные, более регулярные кальциевые нодулы в группах 2 и 4 мкг мл⁻¹ по сравнению с контролем (p < 0,05). Активность ALP увеличилась на 7 день в BP-обработанных клетках (p > 0,05 между 2 vs 4 мкг мл⁻¹). RT-qPCR показал значительную урегуляцию RUNX2, ALP, COL-I, OCN, OPN, BMP-2 на 14 день в группах BP (p < 0,01).

TG2-зависимый механизм

Вестерн блоттинг продемонстрировал ~2-кратное увеличение внутриклеточного и внеклеточного TG2 в BP-обработанных клетках. Уровни FN и LN также были повышены. Нейтрализация TG2 отменила BP-индуцированное ARS отложение, активность ALP и экспрессию OCN, OPN, COL-I. Эти данные подтверждают, что BP способствуют остеогенезу через урегуляцию TG2 и ремоделирование ВКМ.

Обсуждение

Наше исследование демонстрирует, что BP безопасно включаются в остеогенную среду EMSC при концентрациях ниже 32 мкг мл⁻¹. Наночастицы обеспечивают быстрый источник фосфата, облегчая минерализацию, в то время как одновременно активируют TG2 — мультифункциональный фермент, который перекрестно связывает белки ВКМ и модулирует интегриновое сигнальное сообщение. Результающее обогащение ВКМ (FN, LN, COL-I) вероятно улучшает клетка-матрица взаимодействия, дальше движа остеогенную приверженность. Эти находки согласуются с предыдущими отчетами, что BP наноматериалы ускоряют костный ремонт, доставляя ионы фосфата и стимулируя остеобластовую активность.

Хотя восприимчивость BP к окислению может ограничивать стабильность, его быстрая биодеградация к безвредному фосфату снижает риски долгосрочного накопления. Тем не менее, in vivo исследования необходимы для подтверждения безопасности и эффективности в животных моделях и оптимизации дизайнов скаффолдов для клинической трансляции.

Заключение

Наночастицы черного фосфора, произведенные через масштабируемый процесс измельчения-ультразвуковой обработки, безопасно усиливают TG2-медированное остеогенное дифференцирование EMSC in vitro. Эти результаты поддерживают их включение в тканево-инженерные костные скаффолды. Будущая доклиническая работа должна адресовать фармакокинетику, биодистрибуцию и терапевтические результаты в моделях костных дефектов.

Доступность данных и материалов

Наборы данных доступны у соответствующего автора по разумному запросу.