Экosomalный miR-133a из стволовых клеток костного мозга смягчает фиброз и ЭПП при вирусном миокардите через подавление MAML1

Аннотация

Миокардит — это заболевание, характеризующееся локализованным или диффузным воспалением миокарда без эффективного лечения. В данном исследовании изучался регуляторный механизм микроРНК-133 (miR-133), секретируемого из экзосом стволовых клеток костного мозга (BMSC-Exo), на миокардиальный фиброз и эпителиально-мезенхимальный переход (ЭПП) при вирусном миокардите (VMC) у крыс через регуляцию mastermind-like 1 (MAML1). Стволовые клетки костного мозга (BMSC) у крыс изолировали и культивировали для идентификации их иммунного фенотипа и остеогенного и адпогенного потенциала, а BMSC-Exo извлекали и идентифицировали. Экзосомы получали ультрацентрифугацией, которые идентифицировали трансляционной электронной микроскопией и вестерн-блот анализом. Крысам внутрибрюшинно вводили вирус Коксаки B3 для подготовки модели VMC, а кардиомиоциты изолировали, культивировали и группировали так же, как в животных экспериментах (NC^Exo, Ad-miR-133a^Exo, Adas-miR-133a^Exo). In vivo и in vitro эксперименты проводили для выяснения ролей экзосомального miR-133a и MAML1 во воспалении, апоптозе, ЭПП, фиброзе и жизнеспособности клеток. Целевые отношения между miR-133a и MAML1 проверяли двойным люциферазным репортерным генным анализом. BMSC-Exo повышали экспрессию miR-133a у крыс с VMC и эффективно улучшали сердечную функцию и миокардиальный фиброз, увеличивали жизнеспособность кардиомиоцитов и ингибировали процесс ЭПП. Повышенный miR-133a в экзосомах усиливал улучшения. Подавленный miR-133a эффективно обращал эффекты BMSC-Exo на крыс с VMC. miR-133a целью был MAML1. Ингибирование MAML1 улучшало сердечную функцию и миокардиальный фиброз у крыс с VMC и могло обратить эффект экзосом с подавленным miR-133a на крыс с VMC. Наше исследование показывает, что повышенный экзосомальный miR-133a подавляет миокардиальный фиброз и ЭПП у крыс с VMC через регуляцию вниз MAML1, тем самым ингибируя прогрессирование миокардита.

Введение

Миокардит рассматривается как воспалительное заболевание клеток сердечной мышцы. Миокардит очевидно более распространен у мужчин в сравнении с женщинами. Вирусный миокардит (VMC) является главным фактором, приводящим к дилатационной кардиомиопатии (DCM) и внезапной смерти у молодых людей. Клиническая картина миокардита разнообразна, от бессимптомных состояний с неясными признаками и симптомами до серьезного разрушения миокарда вирусом и иммунными клетками, страдающими от кардиогенного шока и аритмий. Миокардит может быть вызван различными инфекционными элементами, состоящими из вирусов, бактерий, хламидий, риккетсий, грибов и простейших, вместе с неинфекционными индукторами. Среди них вирусная инфекция была наиболее распространенной причиной, особенно у детей. Вирус Коксаки B3 (CVB3), как самый важный вирус, приводящий к миокардиту, может приводить к оксидативному стрессу и апоптозу в патогенезе VMC, но специальное лечение VMC пока не сообщалось. Более того, патогенез VMC не хорошо задокументирован, и точного клинического лечения также не существует. Следовательно, новые мишени срочно нужны для улучшения прогноза заболевания.

МикроРНК (miRNA) — это эндогенные некодирующие РНК, которые могут регулировать экспрессию белкокодирующих генов. MiR-133a, как одна из кардио-специфических miRNA, вовлечена в развитие сердца и некоторые сердечно-сосудистые заболевания, содержащие инфаркт миокарда (ИМ). Кроме того, miR-133a — та, которая аберрантно экспрессируется в хроническом хагасовом кардиомиопатии. Более того, уровень miR-133a в миокарде связан с воспалением, функцией левого желудочка и клиническим исходом в воспалительной кардиомиопатии. miRNA находили в экзосомах, полученных из мышиных и человечных тучных клеток. Экзосомы, наноразмерные везикулы, выделяемые большинством типов клеток, находятся в различных биологических жидкостях. Экзосомы могут передавать свой груз реципиентным клеткам, что показано меняет биохимический состав и сигнальные пути реципиентных клеток. Доказательства показывают, что измененные экзосомальные miRNA связаны с патогенезом CVB3-индуцированного миокардита. Было адресовано, что экзосомальный miR-125b-5p от гипоксией-обусловленных стволовых клеток костного мозга снижает апоптоз кардиомиоцитов и улучшает ишемическое восстановление сердца. Более того, экзосомальный miR-25-3p от MSC облегчает ИМ через снижение апоптоза кардиомиоцитов и воспалительного ответа. Интересно, экзосомальный кардиально-экспрессированный miR-133a связан с кардиальным троponinкардиальным троponin-I. Mastermind-like 1 (MAML1) был перекрестно отобранным нисходящим геном miR-133a в нашем исследовании, который сообщался о вовлеченности в миокардиальную ишемию/реперфузию (I/R) повреждение. Также недавнее исследование упомянуло, что нокаут MAML1 обладает антифибrotic функцией в фиброзе печени.

Вдохновленные предыдущими исследованиями, мы задались вопросом, может ли экзосомальный miR-133a от BMSC медиатировать миокардит. Поэтому это исследование началось с гипотезы, что miR-133, доставляемый экзосомой, полученной от BMSC (BMSC-Exo), облегчает миокардиальный фиброз и эпителиально-мезенхимальный переход (ЭПП) у крыс с VMC через регуляцию MAML1.

Материалы и методы

Этическое одобрение

Исследование было разрешено Комитетом по уходу и использованию животных Четвертой приаффилированной больницы Медицинской школы Чжэцзянского университета. Животные обращались гуманно.

Изоляция BMSC

Экспериментальные животные были зрелыми специфически патоген-свободными (SPF) классом самцами крыс Sprague–Dawley (SD) (Экспериментальный центр животных Чжэцзянского университета, Чжэцзян, Китай). Крыс эвтаназировали внутрибрюшным введением натрия пентобарбитала и стерилизовали 75% спиртом. Берли фемур и тибию на ультрачистом столе, удаляли мышцы и соединительные ткани, и костный мозговой полост промывали многократно с низкоглюкозным средой Дюльбекко (DMEM). Жидкость центрифугировали для сбора осадка, который ресуспендировали и инкубировали 24 ч (среду меняли каждые 2–3 д). При достижении логарифмической фазы роста, BMSC отщепляли 0.25% трипсином (Gibco, Carlsbad, California, USA), центрифугировали и ресуспендировали в среде для культивирования MSC (Cyagen Biosciences Inc., Гуанчжоу, Китай). Суспензию пассажировали в соотношении 1:2. Вышеописанная операция повторялась, и 4-й пассаж BMSC использовался для последующих экспериментов.

Идентификация BMSC

Поверхностные антигены 4-го пассажа BMSC в логарифмической фазе роста идентифицировали цитометрией потока. BMSC отщепляли 0.25% трипсином (1 мл), содержащим этилендиаминтетрауксусную кислоту, центрифугировали, ресуспендировали с подходящим фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) и центрифугировали на 151 г. BMSC затем ресуспендировали с PBS, содержащим 2% свежую фетальную бычью сыворотку (FBS) (Gibco) для получения одноклеточной суспензии. FITC-CD34, PE-CD29 и PE-CD44 моно-клональные антитела (по 5 мкл, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) инкубировали с клеточной суспензией (100 мкл), центрифугировали на 151 г, ресуспендировали с 500 мкл PBS, содержащим 1% параформальдегид и фиксировали 30 мин. Фоновые маркеры идентифицировали через использование моно-клональных антител из гомотипного контроля.

Цитометрия потока: одноклеточная суспензия фиксировали и центрифугировали на 151 г. Затем BMSC ресуспендировали с PBS, содержащим 1% параформальдегид, тестировали на потоковом цитометре MACS Quart и анализировали соответствующим программным обеспечением.

Индукция остеогенеза и адпогенеза BMSC

BMSC 4-го пассажа посеяли в 6-колодчатые пластинки с 200 клеток/мл. Остеобластичный индукционный раствор и адпогенный индукционный раствор (Cyagen Biosciences Inc.) добавляли к BMSC 60–70% конфлюэнтности. BMSC в других двух колодках не добавляли индукционных жидкостей как контролы. BMSC индуцировали 14 дней и фиксировали 4% параформальдегидом. Затем дифференцированные остеобласты и адпоциты реализовывали краской Ализарновой красной и маслом красной O (Wuhan Pulande Biological Technology Co., Ltd., Ухань, Китай) и наблюдали под микроскопом.

Изоляция и идентификация экзосом

BMSC 4-го пассажа культивировали 48 ч для сбора супернатанта, который затем центрифугировали (800 г и 2000 г), фильтровали через 0.22 мкм и 100,000 МВ фильтрующие мембраны, и центрифугировали (100,000 г) для сбора осадка. Затем осадок ресуспендировали с PBS, центрифугировали на 100,00 г снова для получения экзосомального осадка. Суспензия BMSC-Exo в PBS подвергали определению концентрации бинхониновой кислотой (BCA) и определению экзосомальных маркерных белков (CD63, CD81 и CD9) вестерн-блот анализом (Proteintech, Чикаго, IL, США).

Рекомбинантная аденовирусная инфекция медиатирует модификацию гена miR-133a BMSC

BMSC пассажировали на ночь. Нормальный контроль (равное количество PBS), негативный контроль miR-133a (NC), переэкспрессия miR-133a (Ad-miR-133a) и низкая экспрессия miR-133a (Adas-miR-133a) (Hanbio Biotechnology Co., Ltd., Шанхай, Китай) трансфектировали в BMSC в соответствии с 100 кратностью инфекции (MOI). BMSC культивировали, и соответствующие экзосомы (NC^Exo, NC^Exo, Ad-miR-133a^Exo и Adas-miR-133a^Exo) получали ультрацентрифугацией.

Установка модели VMC у крыс и группировка экспериментальных животных

Зрелые самцы SPF-класса SD крыс делили на 10 групп, по 8 крыс в каждой. Вирус Коксаки B3 (CVB3) предоставляла Институт медицинской биотехнологии, Китайская академия медицинских наук (Пекин, Китай).

CVB3 (10 мг/кг) внутрибрюшинно вводили крысам, в то время как PBS или BMSC-Exo (100 мкг) вводили через хвостовую вену. Нормальные крысы для контроля вводили с культурным раствором CVB3 и PBS. Крысы, введенные 10 мг/кг CVB3, дополнительно вводили PBS, MSC^Exo, NC^Exo, Adas-miR-133a^Exo, Ad-miR-133a^Exo, si-NC или si-MAML1 (RIBOBIO, Гуанчжоу, Китай).

Крыс непрерывно вводили 7 дней и получали глазную кровь. Кровь центрифугировали и собирали сыворотку, субпакетировали и хранили при −20 °C. После эвтаназии крыс забирали образцы сердца, фиксировали 10% формальдегидом, обезвоживали градиентным спиртом, просветляли ксилолом и встраивали в парафин, делали срезы для гистологического наблюдения. Часть срезов помещали при −80 °C как материалы для молекулярно-биологических экспериментов.

Эхокардиография

На 7-й день после инъекции вируса крысам внутрибрюшинно вводили натрий пентобарбитала 25 мг/кг. После полной анестезии, конечный отвод ЭКГ машины, соединенный с иглой электрода, вставляли подкожно на концах конечностей крыс, и записывали конечный отвод ЭКГ. Затем крыс фиксировали в положении на спине слегка слева, грудь депилировали, и II отвод ЭКГ соединяли для получения доплеровского спектра пульса крови аорты в парастернальной четырехкамерной секции сердца. Показатели включали толщину задней стенки левого желудочка (LVPW), диаметр левого желудочка в конце систолы (LVIDs), фракцию сокращения левого желудочка (FS) и фракцию выброса левого желудочка (LVEF).

Гемоксилин-эозиновое (HE) окрашивание

Ткани фиксировали 4% параформальдегидом, обезвоживали, просветляли и встраивали в парафин. Затем 4-мкм срезы депарафинизировали, окрашивали гемоксилином (Servicebio, Ухань, Китай), дифференцировали 1% соляной кислотой в спирте, возвращали к синему, окрашивали эозином, обезвоживали, просветляли ксилолом, закрепляли нейтральным гумараком и наблюдали под оптическим микроскопом (Olympus, Токио, Япония).

Коллагеновое окрашивание Массона

Парафиновые срезы депарафинизировали, окрашивали гемоксилином менее 2 мин, окрашивали раствором маддера Личуна, и быстро промывали 0.5% раствором уксусной кислоты. Затем срезы окрашивали 1% водным раствором фосфата алюминия, окрашивали от темно-красного к ярко-красному к розовому, и наблюдали под микроскопом. Затем срезы окрашивали анилиновым синим (Pulande), обычным образом обезвоживали ксилолом и закрепляли. Программное обеспечение медицинского анализа изображений Image-Proplus 6.0 использовалось для измерения площади положительного окрашивания коллагеновых волокон, и объемная доля коллагена (CVF) = площадь коллагена/общая площадь поля. Местоположение и цвет окрашивания коллагеновых волокон различали (кардиомиоциты были красными, а коллагеновые волокна — синими полосами или однородными структурами в межклеточном пространстве).

TUNEL окрашивание

Парафиновые срезы депарафинизировали, помещали в цитратный буфер и нагревали на 350 Вт 10 мин. Срезам добавляли 50 мкл раствора TUNEL, соединяли с 50 мкл агента конверсии-пероксидазы, развивали DAB, и наблюдали под микроскопом. Срезы помещали в гемоксилин, макали в 95% этанол I–II, соединяли с безводным этанолом I–II, ксилол I–II, и закрепляли. Результаты анализировали под оптическим микроскопом.

Иммуноферментный анализ (ELISA)

Опухолевой некроз фактор α (TNF-α), интерлейкин (IL)-1β и IL-6 определяли наборами ELISA (BOSTER Biological Technology Co. Ltd., Ухань, Китай). Глазная кровь центрифугировали на 604 г для сбора верхней сыворотки. Супернатант, полученный центрифугированием из среды клеточной культуры, определяли в клеточном эксперименте. В разбавленном стандарте образцов было семь градиентов концентрации. Пустой колодец соединяли с разбавителем образца, и другой колодец добавляли тетраметилбензидин (TMB), два дублирующих колодца устанавливали для каждой концентрации. Колодцы образцов соединяли с 50 мкл разбавителя образца и образцами по очереди. Каждый колодец реагировал с 100 мкл первичного антитела (кроме колодца TMB) 1 ч, а также с 300 мкл 0.01 М трис-буферного физиологического раствора (TBS) и 100 мкл рабочего раствора комплекса Авидин-Биотин-Пероксидаза (кроме колодца TMB). Затем каждый колодец добавляли 300 мкл 0.01 М TBS и инкубировали с 100 мкл TMB. Оптическая плотность (OD) значение и концентрация каждого колодца немедленно измеряли и строили стандартную кривую.

Обратная транскрипция количественная ПЦР (RT-qPCR)

Экспрессию miR-133a, коллагена I, коллагена III, α-SMA, TGF-β1, CTGF, E-кадгерина и FSP-1 в миокардиальных тканях и кардиомиоцитах определяли через RT-qPCR. Общая РНК извлекали из кардиомиоцитов или миокардиальных тканей и обраттранскрибировали в цДНК через набор для извлечения РНК (Takara, Далянь, Китай), праймеры RT-ПЦР синтезировали через Invitrogen (Гуанчжоу, Китай), последовательности показаны в Таблице 1. Относительная количественная генная экспрессия анализировалась с использованием глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (GAPDH) или U6 как контрольных генов загрузки по методу 2^−ΔΔCt.

Вестерн-блот анализ

Крыс эвтаназировали с анестезией. Миокардиальные ткани заморожали и измельчали в жидком азоте. Затем ингибиторы протеаз фенилметансульфонилфторид стоковый раствор смешивали с буфером лизиса клеток в соотношении 1:100 (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Шанхай, Китай). Образцы лизировали смешанным раствором, и белки клеток извлекали. Общая концентрация белка определяли набором BCA. Образцы смешивали с 5× загрузочным буфером в соотношении 4:1, реализовывали кипятильным водяным бане 10 мин, ледяной баней, и центрифугировали. Электрофоретический раздел проводили, и белки переносили на поливинилиденфторидную (Servicebio) мембрану с электрическим переносным раствором. Затем мембрану блокировали 5% обезжиренным сухим молоком, и соединяли с первичными антителами CD63, CD81 и CD9 (кроличьи поликлональные антитела к крысам от Proteintech, 1:100), MAML1 (ab65090, Abcam, MA, США, 1:1000) и GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, CA, США, 1:1000). Затем мембрану капали вторичным антителом, пероксидазой-маркированным IgG (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, США, 1:1000), и погружали в раствор усиленной хемилюминесценции (Pierce, Рокфорд, IL, США). С GAPDH как контролем загрузки, изображения протеинового отпечатка анализировали программным обеспечением ImageJ2x.

Культивирование и пассаж кардиомиоцитов

SD крысы возрастом 3–5 дней (Экспериментальный центр животных Чжэцзянского университета, Чжэцзян, Китай) брали. Желудочковая часть промывали предохлажденным сбалансированным солевым раствором Ханкса, разрезали на маленькие кусочки, и отщепляли 0.25% трипсином. Кусочки добавляли подходящее количество 10% полной среды для прекращения отщепления и центрифугировали на 151 г. DMEM, содержащий 20% FBS, применяли для ресуспензии клеток. Кардиомиоциты очищали дифференциальным адгезивным методом, и коэффициент выживаемости наблюдали через окрашивание трипановым синим, выжившие кардиомиоциты культивировали. Через 24 ч кардиомиоциты адгезировали к стенке и начали пульсировать. Через 72 ч псевдоподии расширялись.

Построение модели VMC кардиомиоцитов

Кардиомиоциты 4-го пассажа в логарифмической фазе роста выбирали и инфицировали MSC^Exo, NC^Exo, Adas-miR-133a^Exo и Ad-miR-133a^Exo. 100 Tcid50 раствор вируса CVB3 (100 мкл) добавляли в клетки для индукции клеточной модели VMC. В то же время, равное количество поддерживающей среды добавляли к клеткам для контроля, и соответствующие экзосомы присоединяли к кардиомиоцитам после 1-ч инфекции для 47-ч культивирования.

Тест CCK-8

Набор для определения клеток CCK-8 (Beyotime) применяли для определения коэффициента выживаемости кардиомиоцитов. При достижении логарифмической фазы роста клетки отщепляли 0.25% трипсином и посеяли в 96-колодчатую клеточную пластинку по 2.5 × 10⁴ клеток/колодец. Соединяли с раствором CCK-8 (10 мкл/колодец), клетки продолжали культивировать 1–4 ч, и значение OD_{450 nm} измеряли микропластинчатым ридером.

Цитометрия потока

Метод двойного окрашивания AnnexinV-APC/пропидиевым йодидом (PI) применяли для определения апоптоза клеток. Клетки центрифугировали, ресуспендировали с 250 мкл Буфера связывания (4 мл Буфера связывания + 12 мл деионизированной воды), и регулировали до 1 × 10⁶ клеток/мл. 100 мкл клеточной суспензии добавляли 5 мкл Annexin V-APC (BD Biosciences) и 5 мкл раствора PI (BD Biosciences), загружали на цитометр потока, и анализировали автоматически компьютером.

Двойной люциферазный репортерный генный анализ

Дикий-тип (wt) или мутантный-тип (mut) последовательность 3-непереведенной области (UTR) MAML1 клонировали в вектор pGL3-M (Promega, WI, США), затем генерировали MAML1-3-UTR-wt или MAML1-3-UTR-mut. Векторы, вместе с мимиком miR-133a или NC, ко-трансфектировали в кардиомиоциты через Lipofectamine 2000. Люциферазная активность тестировали 48 ч позже системой двойного люциферазного репортерного гена (Promega).

RIP анализ

Набор RIP (Millipore, США) использовали для обнаружения связи MAML1 и miR-133a. Клетки лизировали радиоиммунопреципитационным анализом буфера (P0013B, Beyotime, Шанхай, Китай), центрифугировали на 1400 г и инкубировали с антителами для ко-преципитации. Магнитные бусины (50 мкл) ресуспендировали в 100 мкл RIP Wash Buffer и инкубировали с 5 г анти-MAML1 антителом (1 г/мл, ab155786) или IgG (1:100, ab172730). Магнитный бусинка-антителовый комплекс ресуспендировали в 900 мкл RIP Wash Buffer, взаимодействовали с 100 мкл клеточного экстракта, дигерировали протеиназой K, и определяли RT-qPCR.

Статистический анализ

Статистическое программное обеспечение SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, США) применяли для анализа данных. Данные измерений выражались как среднее ± стандартное отклонение. t-тест применяли к сравнениям между двумя группами. Однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) использовали для сравнения между группами, и пост-хок тест Тьюки для попарных сравнений. Предикторы сохраняли, если они были значимы при P значении 0.05 или меньше.

Результаты

Идентификация BMSC и BMSC-Exo

Микроскопически BMSC были веретенообразными и округлыми, и адгезировали к стенке в вихревом или радиальном паттерне (Рисунок 1A). После окрашивания маслом красной O адпогенеза, липидные капли 4-х BMSC были красными, и были круглые липидные капли разных размеров (Рисунок 1B). После индукции остеогенеза, клетки, экспрессирующие окальцинированные нодулы, показывали красное после окрашивания Ализарновой красной, и неравномерное распределение окальцинированных нодулов и накладывающиеся клетки (Рисунок 1C). Цитометрия потока проявила, что маркеры MSC CD29 и CD44 (> 95%) экспрессировались, но гематопоэтический стволовый клеточный поверхностный антиген CD34 (< 95%) не экспрессировался (Рисунок 1D). Эти результаты проявили, что BMSC были высокой чистоты и соответствовали стандартам MSC Международного общества клеточной терапии.

Трансляционная электронная микроскопия наблюдала, что BMSC-Exo были овальными везикулами с четкой периферической мембранной структурой, разными размерами и диаметром 40–100 нм (Рисунок 1E). Вестерн-блот анализ продемонстрировал, что извлеченные продукты экспрессировали экзосомальные характерные белки CD9, CD63 и CD81 (Рисунок 1F).

Повышенный экзосомальный miR-133a улучшает симптомы миокардита

Трансфекция BMSC с рекомбинантным аденовирусом miR-133a наблюдалась (Рисунок 2A). Большое количество зеленой флуоресценции экспрессии NC, Ad-miR-133a и Adas-miR-133a наблюдалось под инвертированным флуоресцентным микроскопом, указывая, что рекомбинантный аденовирусный вектор эффективно мог трансфектировать BMSC. Для проверки эффективности трансфекции miR-133a, экспрессию miR-133a в BMSC и их экзосомах измеряли RT-qPCR. Обнаружили, что повышение miR-133a увеличивало экспрессию miR-133a, в то время как понижение miR-133a уменьшало экспрессию miR-133a (Рисунок 2B). После этого вводили экзосомы, содержащие miR-133a, крысам. Под инвертированным флуоресцентным микроскопом зеленая флуоресценция экспрессии наблюдалась у крыс с VMC после лечения NC^Exo, Ad-miR-133a^Exo или Adas-miR-133a^Exo, указывая, что рекомбинантный аденовирусный вектор инфицировал миокардиальные ткани крыс (Рисунок 2C). RT-qPCR эксперимент также нашел, что экспрессия miR-133a у крыс с VMC была очевидно снижена; экспрессия miR-133a была очевидно повышена у крыс с VMC, введенных Ad-miR-133a^Exo, но снижена у крыс с VMC, введенных Adas-miR-133a^Exo (Рисунок 2D). Что касается общих условий крыс, наблюдалось, что общие условия нормальных контрольных крыс были нормальны, и характеристики VMC были очевидно выражены у крыс с VMC и крыс с VMC, введенных Adas-miR-133a^Exo, такие как грубая и беспорядочная шерсть, одышка и малый рацион. У крыс с VMC, леченных MSC^Exo, NC^Exo и Ad-miR-133a^Exo, эти признаки улучшались в разных степенях. Вес крыс с VMC постоянно снижался с 1 дня после инфекции, и введение MSC^Exo, NC^Exo или Ad-miR-133a^Exo увеличивало вес крыс. Вес крыс с VMC, леченных Ad-miR-133a^Exo, был очевидно увеличен, а вес крыс с VMC, введенных Adas-miR-133a^Exo, был явно снижен (Рисунок 2E).

Наблюдение за миокардиальной функцией предполагало (Рисунок 2F), что крысы с VMC имели увеличенные LVPW и LVIDs, и сниженные FS и LVEF. После инъекции экзосом, сниженные LVPW и LVIDs, и очевидно повышенные FS и LVEF показывали у крыс с VMC. Лечение Adas-miR-133a^Exo ухудшало, в то время как Ad-miR-133a^Exo улучшало миокардиальную функцию у крыс с VMC.

Повышенный экзосомальный miR-133a ингибирует воспаление в миокардиальных тканях крыс с VMC

HE окрашивание проявило, что миокардиальные волокна в нормальных контрольных крысах были тесно упакованы и не было инфильтрации воспалительных клеток в мезенхиме. Кардиомиоциты у крыс с VMC были дезорганизованы, и мезенхима инфильтровалась большим количеством воспалительных клеток. Кардиомиоциты у крыс с VMC, введенных MSC^Exo или NC^Exo, были упорядоченно расположены, с небольшим количеством воспалительных клеток, инфильтрирующих мезенхиму. Кардиомиоциты у крыс с VMC после лечения Adas-miR-133a^Exo были дезорганизованы, и воспалительные клетки в мезенхиме инфильтровались. Кардиомиоциты у крыс с VMC, леченных Ad-miR-133a^Exo, были упорядоченно расположены без очевидной инфильтрации воспалительных клеток (Рисунок 3A).

ELISA указало, что (Рисунок 3B, C) воспалительные факторы (TNF-α, IL-1β и IL-6) были очевидно повышены у крыс с VMC. Крысы с VMC, введенные Ad-miR-133a^Exo, имели сниженные уровни воспалительных факторов. Лечение Adas-miR-133a^Exo вызывало повышение воспалительных факторов у крыс с VMC.

Повышенный экзосомальный miR-133a снижает CVF в миокардиальных тканях крыс с VMC

Окрашивание Массона раскрыло, что миокардиальные волокна у нормальных крыс были тесно упакованы, с почти отсутствием синих коллагеновых волокон. После инъекции CVB3 кардиомиоциты были гипертрофированными, с гиперплазией соединительной ткани и большим количеством синих коллагеновых волокон, и CVF был очевидно повышен. Лечение экзосомами приводило к упорядоченному расположению кардиомиоцитов, снижению гиперплазии межклеточной соединительной ткани, явному снижению синих коллагеновых волокон и CVF. Межклеточное пространство миокарда крыс с VMC, введенных Adas-miR-133a^Exo, было расширенным, клетки были очевидно увеличены, синие коллагеновые волокна и CVF были очевидно повышены; межклеточное пространство было снижено, распределение синих коллагеновых волокон и CVF были снижены у крыс с VMC с лечением Ad-miR-133a^Exo (Рисунок 4A, B).

Повышенный экзосомальный miR-133a снижает экспрессию Коллагена I, Коллагена III, TGF-β1 и CTGF в миокардиальных тканях крыс с VMC

Коллаген I и Коллаген III являются основными компонентами коллагена, которые в основном распределены в клеткастыках и клеточных мембранах, межклеточном веществе и цитоплазме. TGF-β1 и CTGF являются маркерными белками фиброза. Результаты RT-qPCR продемонстрировали, что уровни мРНК Коллагена I, Коллагена III, TGF-β1 и CTGF были повышены у крыс с VMC, но снижались после лечения экзосомами. Крысы с VMC, леченные Ad-miR-133a^Exo, имели сниженные уровни мРНК Коллагена I, Коллагена III, TGF-β1 и CTGF, в то время как крысы с VMC после лечения Adas-miR-133a^Exo показывали обратную ситуацию (Рисунок 5A–C).

Повышенный экзосомальный miR-133a подавляет апоптоз кардиомиоцитов в миокардиальных тканях крыс с VMC

TUNEL окрашивание показало, что апоптотические кардиомиоциты были коричневато-черными или коричневато-желтыми с конденсацией ядра. Количество апоптотических клеток было повышено у крыс с VMC, что было ослаблено лечением экзосомами. Крысы с VMC, введенные Ad-miR-133a^Exo, имели сниженное количество апоптотических клеток, а введенные Adas-miR-133a^Exo — повышенное количество апоптотических клеток (Рисунок 6A, B).

Повышенный экзосомальный miR-133a подавляет ЭПП в миокардиальных тканях крыс с VMC

E-кадгерин, α-SMA и FSP-1 являются ключевыми индикаторами ЭПП. Результаты RT-qPCR продемонстрировали, что уровни мРНК α-SMA и FSP-1 были повышены, а уровень мРНК E-кадгерина снижен у крыс с VMC. Кроме того, уровни мРНК α-SMA и FSP-1 были снижены, а уровень мРНК E-кадгерина повышен у крыс с VMC после лечения экзосомами. Уровни мРНК α-SMA и FSP-1 были повышены, а уровень мРНК E-кадгерина снижен у крыс с VMC, леченных Adas-miR-133a^Exo, в то время как экспрессия этих индикаторов была противоположной у крыс с VMC, введенных Ad-miR-133a^Exo (Рисунок 7A, B).

Повышенный экзосомальный miR-133a подавляет воспаление кардиомиоцитов при VMC

В результате, флуоресцентная микроскопия зафиксировала зеленую флуоресцентную экспрессию у крыс с VMC, леченных NC^Exo, Ad-miR-133a^Exo или Adas-miR-133a^Exo, указывая, что рекомбинантный аденовирусный вектор инфицировал кардиомиоциты крыс (Рисунок 8A). RT-qPCR и ELISA обнаружили, что (Рисунок 8B, D) экспрессия miR-133a была снижена, а воспалительные факторы (TNF-α, IL-1β и IL-6) были повышены у крыс с VMC, что было обращено лечением экзосомами. Крысы с VMC, леченные Ad-miR-133a^Exo, имели повышенную miR-133a и сниженные воспалительные факторы у крыс с VMC, в то время как леченные Adas-miR-133a^Exo демонстрировали сниженную miR-133a и повышенные уровни воспалительных факторов у крыс с VMC.

Повышенный экзосомальный miR-133a стимулирует жизнеспособность клеток и подавляет апоптоз кардиомиоцитов при VMC

Апоптоз и жизнеспособность клеток определяли методом двойного окрашивания AnnexinV-APC/PI и тестом CCK-8. Результаты раскрыли, что был очевидный рост скорости апоптоза, снижение жизнеспособности кардиомиоцитов у крыс с VMC. Лечение экзосомами снижало скорость апоптоза и повышало жизнеспособность кардиомиоцитов. Adas-miR-133a^Exo повышало скорость апоптоза и нарушало жизнеспособность кардиомиоцитов у крыс с VMC. Лечение Ad-miR-133a^Exo действовало противоположными эффектами на кардиомиоциты крыс с VMC (Рисунок 9A–C).

miR-133a целью является MAML1

Сообщалось, что повышенная miRNA-193b снижает миокардиальное I/R повреждение, нацеливаясь на MAML1. Основываясь на этом, мы перекрестно отсеивали нисходящие гены miR-133a через биоинформатические веб-сайты PITA, miRanda, PicTar, microT и miRmap, и выбирали MAML1 как мишень miR-133a (Рисунок 10A). Мы конструировали MAML1-wt или MAML1-mut, и ко-трансфектировали кардиомиоциты с мимиком miR-133a или NC. Результаты показали, что мимик miR-133a снижал люциферазную активность MAML1-wt (Рисунок 10B). RIP эксперимент дополнительно верифицировал целевые отношения между miR-133a и MAML1 (Рисунок 10C). RT-qPCR и Вестерн-блот определение экспрессии MAML1 показали, что экспрессия MAML1 снижалась в кардиомиоцитах, трансфектированных мимиком miR-133a (Рисунок 10D, E).

Ингибирование MAML1 имеет защитный эффект на крыс с миокардитом и обращает эффект экзосом с ингибированным miR-133a на крыс с VMC

Для дальнейшего изучения эффекта miR-133a-регулируемого MAML1 на крыс с VMC, мы вводили si-MAML1 или si-NC аденовирус в крыс с VMC или крыс с VMC, которые были лечены miR-133a-подавленными экзосомами. Успех инъекции валидировали RT-qPCR и Вестерн-блот (Рисунок 11A, B). Результаты проявили, что инъекция si-MAML1 увеличивала вес крыс с VMC (Рисунок 11C), улучшала сердечную функцию (Рисунок 11D–G), ослабляла патологию миокардиальной ткани и фиброз (Рисунок 12A–C), ингибировала сывороточное воспаление (Рисунок 12D, E) и апоптоз кардиомиоцитов (Рисунок 13A–G). Также вредные эффекты miR-133a-подавленных экзосом у крыс с VMC обращались после инъекции si-MAML1.

Обсуждение

Миокардит — воспалительное сердечное заболевание, приводящее к DCM и сердечной недостаточности, и чаще всего индуцируемое вирусными инфекциями, такими как CVB3. Исследование раскрыло, что miR-133 облегчает апоптоз кардиомиоцитов и электрическую перестройку у мышей с VMC. Кроме того, измененные экзосомальные miRNA также находятся связанными с патогенезом CVB3-индуцированного миокардита. Экзосомы, полученные из кардиальных прогениторных клеток, облегчают CVB3-индуцированный апоптоз через сдерживание пролиферации CVB3 при VMC. Это исследование изучило регуляторный механизм BMSC-полученного экзосомального miR-133 на миокардиальный фиброз и ЭПП у крыс с VMC (Дополнительный файл 1: Рисунок 1).

Исследование нашло, что экспрессия miR-133a была снижена при VMC. Как демонстрировалось ранее, экспрессия miR-133a снижается при ИМ. Исследование также предложило, что относительная экспрессия miR-133 в сердцах мышей с VMC очевидно снижена в противовес контролам. Существуют некоторые связи miRNA с экзосомами. Дифференциальная экспрессия экзосом и экзосомальных miRNA в болезни рассматривалась как биомаркеры болезни с выполнением неинвазивной клинической диагностики вместе с их терапевтическими потенциалами. Лин и соавт. нашли, что miR-133 специально сортируется в гипоксия/реоксигенация (H/R)-вызванные экзосомы человеческих эндотелиальных прогениторных клеток для увеличения фибробластовой ангиогенеза и ЭПП. Другое исследование раскрыло, что MSC демонстрируют общение с паренхимальными клетками мозга и могут модулировать вырост нейритов передачей miR-133b в нейронные клетки через экзосомы.

Основное открытие этой работы проявило, что повышенный экзосомальный miR-133a стимулировал жизнеспособность клеток, ингибировал воспаление, апоптоз, ЭПП и фиброз у крыс с VMC. Они хорошо согласуются с предыдущим исследованием, что подавление miR-133a обращает ингибирование пролиферации остеосаркомы клеток MG63, индуцированное астрагалус полисахаридами, вместе с продвижением апоптоза клеток. Другое исследование раскрыло, что переэкспрессированный miR-133a подавляет ангиогенез, апоптоз, фиброз и воспаление, ускоряя терапевтическую кардиальную перестройку при ишемических сердечных заболеваниях. Похоже на наше исследование, Ли и соавт. заявляли, что miR-133 ингибирует апоптоз кардиомиоцитов регуляцией экспрессии апоптоз-связанных генов в сердцах мышей с VMC. Переэкспрессированный miR-133a сообщался о подавлении гипоксии-индуцированного апоптоза и укреплении выживаемости кардиомиоцитов. В то же время, повышенный сывороточный экзосомальный miR-30a и miR-181d могут иметь потенциал для применения как биомаркеры для диагностики VMC.

Другое открытие в нашем исследовании было тем, что повышенный экзосомальный miR-133a снижал CVF, уменьшал экспрессию Коллагена I и Коллагена III у крыс с VMC. Статья разъяснила, что выделенный фибробластный фактор роста-18 из коллагеновой мембраны вызывает остеобластическую активность, участвующую в сниженном miR-133a. In vitro избыточная экспрессия miR-133a подавляет гипертрофию кардиомиоцитов и снижает экспрессию коллагена, как подтверждено в другом исследовании. CVF равно отношению площади коллагена к сумме площади миокарда и площади коллагена, и среднее значение показывает CVF среза. Это открытие также сообщено Ван и соавт., что модель мышей с VMC успешно построена инфекцией CVB3, проявляющая очевидную более высокую экспрессию CVF в противовес контрольной группе. Более того, открытие согласуется с Феррейра и соавт., которые демонстрируют, что miR-133a может играть главную роль в модуляции генной экспрессии в патогенезе хронического хагасового кардиомиопатии, с потенциальной связью как диагностических и прогностических инструментов. Кроме того, доказательства показали, что нокаут MAML1 может снизить гипертрофию предобработанных кардиомиоцитов. В нашем исследовании мы нашли, что MAML1 был мишеневым геном miR-133a и ингибирование MAML1 обращало эффекты miR-133a-подавленных экзосом на крыс с VMC. При миокардиальной ишемии-реперфузии повреждении, miR-193b-медированная регуляция вниз MAML1 могла частично снизить инфаркт и миокардиальные ферменты, а также ослабить апоптоз кардиомиоцитов. Также есть отчет, предполагающий, что дефицит MAML1 может облегчить гепатическую фиброзегенез.

Заключение

В заключение, настоящее исследование предоставляет доказательства того, что miR-133a регулируется вниз у крыс с VMC, и повышенный экзосомальный miR-133a улучшает сердечную функцию и сдерживает миокардиальный фиброз и ЭПП у крыс с VMC, а также повышает жизнеспособность и подавляет апоптоз кардиомиоцитов при VMC через нацеливание MAML1. Наше исследование также показывает, что ингибирование MAML1 имеет защитный эффект на крыс с миокардитом и обращает эффект miR-133a-ингибированных экзосом на крыс с VMC. Идентификация экзосомального miR-133a в миокардиальном фиброзе и ЭПП миокардита может потенциально расширить наше понимание механизмов, лежащих в основе миокардита, и также нести клиническую ценность как новая молекулярная мишень. Дальнейшие исследования должны быть предприняты для прорыва в лечении этого заболевания.