Атомно-силовая микроскопия раскрывает динамику интеграна β1 при хондрогенезе человеческих адипозных стволовых клеток

Аннотация

Интегрин β1 оркестрирует ключевые процессы, такие как дифференциация, миграция и тканевой ремонт. Используя атомно-силовую микроскопию (АСМ), мы квантово оценили взаимодействие между лигандами интегрина β1 и CD29 рецепторами на человеческих адипозных стволовых клетках (hADSC) в течение раннего хондрогенного дифференцирования. АСМ-изображения показали переход от вытянутых, веретенообразных клеток к полигональным с уменьшением отношения длина/ширина и увеличением шероховатости поверхности. Более 1200 силовых кривых, собранных на 0, 6 и 12 днях, выявили рост сил разрыва (61,8 ± 22,2 пН → 67,2 ± 22,0 пН) и вероятностей связывания (19,6% → 33,4%). Эти данные демонстрируют, что АСМ может отслеживать вовлечение интегрина β1-CD29, клеточную ультраструктуру и морфологию как надежные маркеры хондрогенного прогресса.

Преамбула

Остеоартрит (ОА) разрушает суставной хрящ, ткань, лишенную сосудов и имеющую ограниченную способность к саморегенерации. Стволоклеточная тканевая инженерия обещает восстановление функции хряща, но точные сигнальные события, управляющие хондрогенезом, остаются неясными. Интегрины, особенно интегрин β1 (CD29), медиатируют клеточно-матричные взаимодействия и активируют пути, такие как Wnt/β-катенин, PI3K и mTOR, определяющие судьбу стволовых клеток. Мы фокусировались на интегрине β1 из-за его ключевой роли в биологии хряща и взаимодействии с разнообразными α-подединицами.

АСМ, связанная с одно-молекулярной силовой спектроскопией (SMFS), предлагает нанометровое разрешение изображения живых клеток и прямое измерение лиганд-рецепторных сил. Функционализируя АСМ-зонды антителами к интегрину β1, мы зондировали события связывания на hADSC в ходе хондрогенной индукции, предоставляя кинетические и структурные инсайты, недоступные конвенциональными анализами.

Методы

Клеточная культура и реактивы

hADSC изолировали из подкожного жира трех доноров (средний возраст 20 л) под протоколами, одобренными IRB. Клетки размножали в низкоглюкозном DMEM с 10% термоинактивированным FBS, антибиотиками, пируватом натрия и L-глутамином, поддерживали при 37 °C, 5% CO₂.

In vitro дифференциация

Для хондрогенеза клетки 4-8-го прохода посевали при 2×10⁵ клеток на 10 мл и культивировали в хондрогенной среде, содержащей 1% FBS, ITS, 10 нг/мл TGF-β1, 100 нг/мл IGF-1, 10⁻⁷ М дексаметазона и 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты. Среду меняли каждые 2 дня. Депозиция хрящевой матрицы подтверждалась окраской синим альцианом и толуидиновым синим.

Остеогенное и адипогенное дифференцирование проводили по стандартным протоколам с дексаметазоном, аскорбиновой кислотой, β-глицерофосфатом, IBMX, гидрокортизоном и индоометацином, оценивали окраской алаizarin red и Oil Red O соответственно.

Потоковая цитометрия

Клетки маркировали антителами против CD34, CD44, CD45, CD73, CD90, CD106, HLA-DR и CD105 и анализировали для подтверждения мезенхимального фенотипа.

Иммуноблоттинг и иммунофлуоресценция

Белковые экстракты зондировали на β-катенин, интегрин β1, коллаген II, GSK-3β, SOX и β-актин. Иммунофлуоресценция визуализировала распределение интегрина β1 и F-актина с использованием Alexa Fluor 488 и фаллоидина-Alexa Fluor 573 соответственно.

Функционализация АСМ-зонда

Кремниевые нитридные зонды очищасили,силилизировали 1% 3-АПТЭС, перекрестно-связывали глутаральдегидом и инкубировали на ночь с 1 мг/мл анти-интегрин β1 антителом для получения лиганд-функционализированных зондов.

АСМ измерения

Клетки фиксировали 4% параформальдегидом и образовывали в PBS. Морфологию и шероховатость поверхности (Ra, Rq) квантовали из >15 изображений 10 мкм² на временную точку. SMFS выполняли в режиме приближение-отход при 500 нм/с, собирая >400 силовых кривых на эксперимент (~1200 всего на временную точку). События связывания идентифицировали по силам разрыва >800 пН и порогу силы, откалиброванному до 0,058 ± 0,006 Н/м.

RT-qPCR

РНК извлекали, обратно транскрибировали и квантовали для интегрина β1 и GAPDH с использованием химии SYBR Green. Относительная экспрессия рассчитывалась методом 2^–ΔΔCT.

Статистика

Эксперименты проводили в трипликате. Данные представлены как среднее ± SD. Сравнения использовали t-тесты или однофакторный ANOVA с пост-тестом Бонферрони; p < 0,05 считалось значимым.

Результаты и обсуждение

Характеристика hADSC

Потоковая цитометрия подтвердила мезенхимальный фенотип (CD73⁺, CD90⁺, CD105⁺, CD34⁻, CD45⁻). MTT-тесты продемонстрировали надежную пролиферацию по проходам.

Морфологические и ультраструктурные сдвиги при хондрогенезе

АСМ выявила явный морфологический сдвиг от веретенообразных к полигональным клеткам, с значительным снижением отношения длина/ширина на 6 и 12 днях (p < 0,01). Параметры шероховатости Ra и Rq заметно увеличились, указывая на усиленную гетерогенность мембраны, вероятно, обусловленную ремоделированием ВКМ.

Ремоделирование цитоскелета

Конфокальная визуализация показала реорганизацию F-актина из продольного массива в радиальный, периферически-локализованный паттерн к 12 дню, отражая цитоскелетную ремоделировку, ассоциированную с хондрогенным коммитом.

Динамика связывания интегрин β1–CD29

SMFS с интегрин β1-функционализированными зондами дала растущие силы разрыва и вероятности связывания со временем (0% → 33,4% на 12 день). Блокирующие эксперименты со свободным анти-интегрин β1 антителом снизили силовые кривые на ~90%, подтверждая специфичность.

Экспрессия интегрина β1 и сигналирование

Вестерн блот и qRT-PCR продемонстрировали регуляцию вверх интегрина β1, коллагена II и компонентов пути β-катенин/SOX при хондрогенезе. Повышенные уровни β-катенина, SOX и GSK-3β указывают на то, что интегрин β1 активирует Wnt/β-катенин сигналирование для стимуляции синтеза хрящевой матрицы.

Выводы и ограничения

АСМ предоставляет неразрушающий одно-клеточный подход для мониторинга динамики интегрина, морфологии и шероховатости мембраны как индикаторов хондрогенного дифференцирования в реальном времени. Будущие исследования должны исследовать конформацию интегрина и детализировать точные молекулярные связи между интегрином β1 и β-катенин/SOX сигнализацией.

Заключение

Мы установили АСМ как мощный инструмент для отслеживания взаимодействий интегрин β1–CD29 и наноструктурных изменений при хондрогенезе hADSC. Техника предлагает кинетические и структурные инсайты, которые могут информировать стратегии стволоклеточного хрящевого ремонта.

Аббревиатуры

AFM

Атомно-силовая микроскопия

CD

Кластер дифференциации

DAPI

4′,6-диаминофлуоресцеин-2-фенилиндол

DMEM

Модифицированная среда Эйгла Дюльбекко

ECM

Внеклеточная матрица

F-актин

Филаментозный актин

FBS

Фетальная телячья сыворотка

hADSC

Человеческие адипозные стволовые клетки

IB

Иммуноблоттинг

IBMX

3-изобутил-1-метилксантин

IGF-1

Инсулиноподобный фактор роста-1

ITS

Инсулин-трансферрин-селен

mTOR

Маммалиановая мишень рапамицина

OA

Остеоартрит

PBS

Фосфатный буферный раствор

PI3K

Фосфоинозитид-3-киназа

SD

Стандартное отклонение

SMFS

Одно-молекулярная силовая спектроскопия

TGF-β1

Трансформирующий фактор роста-β1