Получение с помощью серной кислоты точек карбонизированного полимера с красным светом и применение био-визуализации

Фон

Углеродные точки (CD) привлекли большое внимание благодаря своим преимуществам, включая превосходную растворимость в воде, оптическую стабильность, уникальные флуоресцентные свойства, низкую токсичность, низкую стоимость и т. Д. [1]. Большинство компакт-дисков были изучены как потенциальные кандидаты для различных применений, таких как электрохимические иммунные сенсоры [2], датчики биовизуализации [3,4,5,6], сенсоры [7,8,9,10,11,12], фото- катализ [13,14,15], светоизлучающие устройства [16] и оптоэлектроника [17,18,19]. Синтез компакт-дисков играет важную роль в исследованиях оптических свойств и приложений. Описанные подходы к изготовлению компакт-дисков можно в основном охарактеризовать как «нисходящий» из различных углеродных материалов и «восходящий» из органических молекул, полимеров или природных продуктов [20]. Методы «снизу вверх» являются эффективными путями для синтеза флуоресцентных CD в больших масштабах [21]. Группы в используемых молекулах, включая –OH, –COOH, –C =O и –NH ₂ можно обезвоживать и карбонизировать при повышенной температуре гидротермальными методами, микроволновыми печами, сжиганием, пиролизом и т. д.

Точки с красным светом вызвали значительный интерес, например, из-за большей глубины проникновения в поле биовизуализации. В частности, чистые цветные точки имеют решающее значение для определенного случая, потому что люминесцентные материалы, не зависящие от длины волны возбуждения, могут обеспечивать одиночный и стабильный свет фотолюминесценции (ФЛ). Большинство излучений компакт-дисков зависят от длины волны возбуждения, и компакт-диски обычно излучают синий, зеленый или желтый свет, некоторые компакт-диски излучают ярко-красный свет [22].

В последнее время изомеры фенилендиамина (PD), такие как o -, м - и p -PD, были изучены как источники углерода для изготовления компакт-дисков [8, 9, 23, 24]. Компакт-диски с синим, зеленым и красным светом могут быть изготовлены из m -, о - и p -PD этанольный раствор соответственно [23]. Полноцветные светоизлучающие компакт-диски можно изготовить из p -ПД и водный раствор мочевины [24]. В нашей предыдущей работе [25] мы предложили, что новые красные углеродные точки (квантовые выходы =15,8%, в воде) могут быть легко синтезированы из « p -PD + HNO ₃ ”Водная система и применяется при обнаружении ионов металлов в воде. Недавно аналогичный « o -PD + H ₃ ЗП ₄ »[26] и« o -PD + HNO ₃ Сообщалось о системах [27], а Liu et al. [27] переименовали свои CD (QYs =10,8%, в воде) в «карбонизированные полимерные точки (CPD)». В отличие от традиционных углеродных точек, длины волн излучения CPD не зависят от длины волны возбуждения, и поэтому «CD» на основе PD следует более точно называть CPD.

Здесь мы сообщаем о простом и высокоэффективном методе гидротермального пути с сильной кислотой для приготовления CPD, излучающих красный цвет, и о применении био-визуализации со свойствами двухфотонной фотолюминесценции. Предложен механизм формирования CPD с использованием программного пакета Gaussian 09.

Методы

Синтез красных CPD на основе кислоты p -PD Systems

Основываясь на нашей предыдущей работе [25], мы выбрали серную кислоту (H ₂ SO ₄ ), соляная кислота (HCl) и хлорная кислота (HClO ₄ ) в качестве помощников для подготовки красных CPD, соответствующие CPD были помечены как SA-CPD, HC-CPD и PA-CPD соответственно. Чтобы оптимизировать экспериментальные условия H ₂ SO ₄ -система, мы выбрали несколько параметров, например c (кислота) в c ( p -PD) коэффициент, c ( p -PD), температура ( T ) и время реакции ( t ). Продукты CPD промывали гексаном для удаления непрореагировавшего p -PD и этиловым спиртом для удаления кислот, центрифугировали при 14000 об / мин в течение 30 минут для удаления осадка полимера и фильтровали через фильтрующую мембрану 0,22 мкм. Если желателен порошок, очищенный раствор CPD можно дополнительно упарить на роторном испарителе почти до сухого состояния при 80 ° C и в условиях низкого вакуума (оставшаяся часть будет в виде порошка).

Характеристика и измерение

Изображения ПЭМ высокого разрешения (ВР-ПЭМ) регистрировали на просвечивающем микроскопе JEM-2100, работающем при 200 кВ. Инфракрасные спектры растворов CPD собирали с использованием спектрометра Prestige-21 FT-IR с использованием оконных срезов KRS-5 (смесь TlBr и TlI), как правило, жидкие фазы капали на один срез и сушили. Срез накрыли другим срезом и закрепили на испытательном стенде. Затем были записаны инфракрасные спектры.

Спектры флуоресценции CPD измеряли на флуоресцентном спектрофотометре F-2500. Спектры поглощения в УФ-видимой области регистрировали на спектрометре Lambda 950 UV / VIS / NIR. Спектры двухфотонного излучения CPD регистрировались волоконным спектрографом (QE65000, Ocean Optics) в системе микроскопа. Водный раствор SA-CPD и повторно растворенный раствор порошков центрифугировали на предметных стеклах, после чего измеряли свойства двухфотонной фотолюминесценции.

Квантовые выходы фотолюминесценции (QY) CPD измеряли с использованием родамина B (QYs =56% в этаноле) в качестве эталонного красителя в диапазоне излучения 580-610 нм при возбуждении УФ-светом 365 нм [25, 28], процедура Измерения QYs показаны в дополнительном файле 1.

Методы расчета

Пакет Gaussian 09 использовался для расчетов по теории функции плотности (DFT) [29]. Оптимизация равновесных структур проводилась методом B3LYP совместно с уровнем базисного набора 6–311 ++ G (d) [30]. Чтобы исследовать роль эффектов растворителя, вода была использована в модели поляризованного континуума (PCM). Частотный анализ проводился с одинаковым уровнем для подтверждения того, что каждая оптимизированная структура соответствует стационарной точке.

Культура клеток и лечение

1,35 мл клеток HeLa в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM; Gibco) при начальной плотности 4 × 10 ⁴ клеток на миллилитр высевали в каждую чашку и культивировали при 37 ° C в течение 24 часов в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO ₂ . Порошки SA-CPD повторно растворяли в воде для приготовления резервного раствора (400 мкг мл ^{- 1} ). 1350 мкл клеток культивировали с 150 мкл резервного раствора SA-CPD (конечная концентрация составляет 40 мкг мл ^{- 1} ) в течение 12 ч, а затем трижды промыли PBS для удаления свободных SA-CPD. Наконец, результаты визуализации клеток были получены с помощью конфокального микроскопа при возбуждении фемтосекундным лазером 850 нм (30 мВт).

Результаты и обсуждение

Оптимизация подготовки к красным CPD

В основных экспериментах были исследованы различные кислотно-вспомогательные системы с различными соотношениями концентраций, температурой реакции и временем (см. Дополнительный файл 1:Рисунок S1). Мы обнаружили, что красные CPD могут образовываться при температуре выше 180 ° C (реакция в течение 2 часов) для различных кислотных систем, и на реакции не влияют анионы в растворах. Длительное время (4–12 ч, 240 ° C для H ₃ ЗП ₄ и системы HF, см. Дополнительный файл 1:Рисунок S1f), реакция приведет к увеличению размера частиц, и красная флуоресценция в конечном итоге исчезнет, ​​в то время как изменение флуоресценции неочевидно для системы HCl (2–6 часов, 200 ° C, см. Дополнительные файл 1:Рисунок S2). Принимая во внимание энергосбережение и верхний предел температуры тефлоновой футеровки, оптимальная температура и время реакции выбраны как 200 ° C и 2 часа соответственно. На основе стратегии оптимизации p -PD + HCl (см. Дополнительный файл 1:Рисунок S2), мы оптимизировали p -PD + H ₂ SO ₄ и p -PD + HClO ₄ систем и получили результаты оптимизации, представленные в таблице 1.

SA-CPD, HC-CPD и PA-CPD были приготовлены из p -PD решение с помощью H ₂ SO ₄ , HCl и HClO ₄ , соответственно. Оптимизированный c (кислота) в c ( p -PD) отношения H ₂ SO ₄ -, HCl- и HClO ₄ -сопровождаемые системы - это 1, 3 и 3, соответственно (см. Дополнительный файл 1:Рисунок S3a). Подходящий c ( p -PD) диапазон приготовления красных CPD широк (от 0,02 до 0,20 моль л ^{- 1} ). Оптимизированная температура ( T ) и время реакции ( t ) составляют 200 ° C и 2 ч. SA-CPD - это самые яркие красные CPD с высоким QY 21,4% (дополнительный файл 1:рисунок S3b). Есть две причины, по которым H ₂ SO ₄ углеродные точки с добавлением углерода имеют лучшее качество по сравнению с HCl-, HClO ₄ - и HNO ₃ -сопровождаемые (опубликованы в нашей предыдущей работе [25]). Во-первых, H ₂ SO ₄ представляет собой нелетучую сильную кислоту, которая сохраняет свою кислотность в реакционном растворе при высокой температуре и высоком давлении. Во-вторых, H ₂ SO ₄ Система с помощью является единственной, которая может образовывать осаждение соли аммония в предшественнике, и осадки медленно высвобождают свободные реагенты, избегая образования осаждения полимера с крупными частицами и дополнительно способствуя образованию углеродных точек высокого качества. HA-CPD и PA-CPD представляют собой темно-красно-коричневые густые растворы и излучают темно-красную ФЛ при облучении УФ-светом 365 нм, в то время как свежеприготовленные SA-CPD представляют собой ярко-красный прозрачный тонкий раствор и излучают ярко-красный свет (дополнительный файл 1:Рисунок S3c). После очистки промыванием, концентрированием, фильтрацией и выпариванием были получены темно-красно-коричневые порошки SA-CPD (дополнительный файл 1:рисунок S3d) с выходом продукта 16,5%. Порошки можно повторно растворить в воде, и раствор будет излучать яркую и красную флуоресценцию (дополнительный файл 1:Рисунок S3e).

Определение характеристик ПЭМ и анализ FT-IR

ПЭМ-изображения образца OpPD (без H ₂ SO ₄ ) и SA-CPD (с H ₂ SO ₄ ) были показаны на рис. 1. Образец OpPD состоит из фрагментов (олигомеры, рис. 1а) и полимеров (вставка на рис. 1а). SA-CPD представляют собой монодисперсные CPD со средним размером ~ 5 нм (рис. 1в). Он демонстрирует хорошо разрешенные пальцы решетки с пространством ~ 0,21 нм (вставка на рис. 1b), что соответствует шагу решетки графена в плоскости (100) [31, 32].

ПЭМ-изображения образца OpPD (без H ₂ SO ₄ ) ( а ) и SA-CPD ( b ). c Распределение размеров SA-CPD. г Спектры FT-IR образца OpPD и красных CPD. Образцы OpPD и SA-CPD были приготовлены из p -PD водный раствор без и с H ₂ SO ₄ -помощь

Поверхностные состояния CPD могут влиять на оптические свойства. Поверхностные химические группы образцов OpPD и SA-CPD были охарактеризованы спектрами FT-IR (рис. 1d). Два образца имеют несколько похожих групп, например Ar-H (2700–3200 см ^{- 1} [33], относится к ароматическим валентным колебаниям C-H), C-C (~ 1433 см ^{- 1} , относится к ароматическим растягивающим колебаниям C-кости, обнаруживает присутствие ароматических растягивающих колебаний, характерных для бензоидных единиц) [34], и C =O (1628 см ^{- 1} , принадлежит группам –COOH). По сравнению с образцом OpPD, новые группы, такие как O-H (3300–3700 см ^{- 1} и 1175 см ^{- 1} принадлежат к -COOH группам), C-O-C (1055 см ^{- 1} , существуют в сложных эфирах) и C-H (2400–3000 см ^{- 1} принадлежит к алкильным радикалам, образующимся в реакции раскрытия цикла), присутствуют в CPD, в то время как –NH ₂ или –NH– родственные группы, такие как N-H (3100–3300 см ^{- 1} и 1512 см ^{- 1} и C-N (1126, 1261 и 1305 см ^{- 1} принадлежат к свободному –NH ₂ или –NH– группы из p -Предшественник PD, ослаблены или исчезли. Наличие групп –OH или –COOH указывает на то, что степень окисления поверхности SA-CPD (с H ₂ SO ₄ добавление) выше, чем у образца OpPD (без добавления кислоты).

Предлагаемый механизм создания компакт-дисков

Энергии образования рассчитывались с помощью пакета программ Gaussian 09. После протонирования под действием кислоты биполимеры могут полимеризоваться двумя способами, которые называются продольным и поперечным ростом. Расчетная энергия образования поперечного роста (- 1406,07 кДж · моль ^{- 1} ) значительно выше, чем при продольном росте (- 616,25 кДж моль ^{- 1} ). Он показывает, что полностью протонированные би-полимеры (pH 3, после избытка H ⁺ был добавлен), как правило, полимеризуется поперечно с образованием плоской структуры (рис. 2). Затем эти плоские структуры были собраны самостоятельно, чтобы сформировать сферические CPD.

Энергии образования продольных и поперечных наростов

Оптические свойства

Несмотря на то, что они были приготовлены с помощью различных кислот, все CPD обладают схожими оптическими свойствами [25]. Для УФ-видимых спектров водного раствора SA-CPD (рис. 3a) пик поглощения, расположенный при ~ 290 нм, связан с переходами в бензольном кольце, а пики, расположенные при 430 нм и 510 нм, могут быть отнесены к π -π * переход замещенного феназина, сопряженного с неподеленными электронными парами на соседней аминогруппе, и переход электрона с бензоидного кольца на хиноидные кольца, соответственно [32]. Кривая возбуждения описывает широкий и постепенный восходящий тренд в видимой области, а максимальный пик возбуждения (~ 580 нм) близок к пику излучения (~ 600 нм). CPD излучают в зоне красного света (600–700 нм) при возбуждении от 220 до 310 нм, а излучают оранжевым светом (~ 600 нм) при возбуждении от 310 до 580 нм (рис. 3b). Стоит отметить, что флуоресценция этого типа CPD с красным излучением не зависит от длины волны возбуждения [22, 35].

а Поглощение в УФ-видимой области, возбуждение (пик при 600 нм) и b эмиссионные (возбужденные 220–580 нм) спектры SA-CPD

Сотовая визуализация

Свойства двухфотонной фотолюминесценции SA-CPD до и после процесса измельчения показаны на рис. 4а. Имеется синий сдвиг от 602 нм (до процесса порошка) до 529 нм (после процесса порошка) при той же длине волны возбуждения 850 нм фемтосекундным импульсным лазером (30 мВт). Интенсивность фотолюминесценции увеличивалась после процесса присыпки.

Спектры двухфотонной фотолюминесценции SA-CPD ( a ) и изображения конфокальной флуоресцентной микроскопии клеток HeLa, обработанных SA-CPD, возбужденных фемтосекундным импульсным лазером мощностью 850 нм, 30 мВт ( b - е )

Порошки SA-CPD повторно растворяли в PBS (1X) и применяли для визуализации клеток HeLa с использованием конфокальной флуоресцентной микроскопии и фемтосекундного импульсного лазера с длиной волны 850 нм (30 мВт) (см. Рис. 4b – e). После культивирования с клетками HeLa в течение 12 часов SA-CPD поглощались клетками HeLa, а CPD попадали в цитоплазму. Интенсивность ФЛ красного канала (645–675 нм) слабая, а зеленого канала (526–574 нм) яркая, это согласуется с синим сдвигом в процессе измельчения.

Выводы

Сообщалось о простом методе гидротермального пути с кислотой для получения углеродных точек и о применении био-визуализации. Внутри H ₂ SO ₄ -, HCl- и HClO ₄ -системы, SA-CPD, подготовленные из H ₂ SO ₄ -система - это самые яркие CPD со средним размером ~ 5 нм, QY 21,4% и выходом продукта 16,5%. Водный раствор SA-CPD излучает на длине волны 600 нм при возбуждении светом от 300 до 580 нм. Длина волны излучения не зависит от длины волны возбуждения. Кроме того, SA-CPD имеют свойства двухфотонной фотолюминесценции, излучающие на длине волны 602 нм при возбуждении фемтосекундным импульсным лазером с длиной волны 850 нм (30 мВт). Этот метод также использовался для визуализации клеток HeLa и имеет потенциал, например, в приложениях для био-визуализации.

Сокращения

компакт-диски:

Углеродные точки

CPD:

Карбонизированные полимерные точки

HC-CPD:

Углеродные точки были приготовлены из p -ПД с системой с добавкой HCl

PA-CPD:

Углеродные точки были приготовлены из p -ПД с HClO ₄ -система

p -PD:

P -фенилендиамин

QYs:

Квантовые выходы

SA-CPD:

Углеродные точки были приготовлены из p -PD с H ₂ SO ₄ -система