Сернокислотный синтез ярко-красных карбонизированных полимерных точек для двухфотонного биообразования

Аннотация

Краснолюминесцентные карбонизированные полимерные точки (КПТ) были получены из водного раствора p-фенилендиамина (p-ПД) под каталитическим влиянием серной кислоты (H₂SO₄). Полученные SA-КПТ (средний диаметр ≈5 нм) демонстрировали наиболее яркую фотолюминесценцию среди протестированных кислот, с квантовым выходом (КВ) 21,4% в воде и 16,5% общим выходом. Воспламенение при 300–580 нм последовательно давало 600 нм эмиссию, независимую от длины волны возбуждения. Расчеты теории функционала плотности показывают, что поперечный рост протонированных предшественников энергетически выгоден, управляя формированием наноразмерных КПТ. Двухфотонная фотолюминесценция, эмитирующая при 602 нм под 850 нм фемтосекундным лазером, была продемонстрирована для изображения клеток HeLa, подчеркивая потенциал SA-КПТ в биомедицинских приложениях.

Введение

Углеродные точки (УТ) привлекли широкий интерес благодаря их отличной водорастворимости, оптической стабильности, низкой токсичности и дешевого синтеза. Их исследуют в электрохимических сенсорах, биообразовании, катализе, световозвращающих устройствах и оптоэлектронике. Нижние-вверх маршруты из органических мономеров, полимеров или натуральных продуктов предпочтительны для крупномасштабного производства. Функциональные группы —OH, –COOH, –C=O и –NH₂ проходят дегидратацию и карбонизацию при повышенных температурах, давая флуоресцентные наночастицы.

Краснолюминесцентные УТ особенно ценны для биообразования из-за их более глубокого проникновения в ткани и минимального фонового интерференса. Однако большинство УТ показывают возбуждение-зависимую эмиссию, делая единственный, стабильный красный фотонный источник редким. Изомеры фенилендиамина (o-, m-, p-) использовались для генерации синих, зеленых и красных УТ соответственно. Недавняя работа идентифицировала p-ПД-базированные точки как карбонизированные полимерные точки (КПТ) из-за их возбуждения-независимой эмиссии.

Здесь мы представляем простой, высоковыходной, сернокислотно-помощенный гидротермальный синтез краснолюминесцентных КПТ и демонстрируем их двухфотонную образованную способность в клетках HeLa.

Методы

Синтез красных КПТ из кислотно-помощенных p-ПД систем

Мы исследовали H₂SO₄, HCl и HClO₄ как протоновые доноры, маркируя полученные КПТ как SA-КПТ, HC-КПТ и PA-КПТ. Реакционные переменные — кислота-к-p-ПД соотношение, концентрация предшественника, температура и время — систематически оптимизировали. После гидротермальной обработки (200 °C, 2 ч) продукт очищали гексаном (удаление нереагировавшего p-ПД) и этанолом (удаление кислоты), с последующей центрифугировкой на 14000 об/мин, фильтрацией через 0,22 мкм мембрану и опциональной ротационной эвапорацией для получения сухих порошков.

Характеризация и измерения

Высокоразрешающее ТЭМ (JEM-2100, 200 кВ) оценивало морфологию и решетчатые френели. ФТ-ИР спектры записывали на спектрометре Prestige-21 с KRS-5 окнами. Флуоресцентные и UV-Vis спектры получали на спектрофотометрах F-2500 и Lambda 950 соответственно. Двухфотонная эмиссия измерялась на волоконном спектрографе (QE65000, Ocean Optics), связанном с фемтосекундным лазером. Квантовые выходы рассчитывали с использованием Родамина B (КВ = 56% в этаноле) как референса, следуя процедуре в Дополнительном файле 1.

Вычислительные методы

Расчеты теории функционала плотности (DFT) выполняли с Gaussian 09 (B3LYP/6-311++G(d)) в модели PCM воды для оценки энергетики продольных и поперечных ростовых путей.

Клеточная культура и обработка

Клетки HeLa (4 × 10⁴ клеток/мл) посевали в DMEM (Gibco) и инкубировали при 37 °C с 5% CO₂ на 24 ч. SA-КПТ (40 мкг/мл) добавляли на 12 ч, затем промывали ФСБ. Образование выполняли на конфокальном микроскопе с 850-нм фемтосекундным лазером (30 мВт).

Результаты и обсуждение

Оптимизация подготовки красных КПТ

Все кислотные системы давали красные КПТ при температурах выше 180 °C (2 ч). Более высокие температуры (240 °C, 4–12 ч) увеличивали размер частиц и уменьшали флуоресценцию. Оптимальные условия: 200 °C, 2 ч, с кислота-к-p-ПД соотношением 1 для H₂SO₄ и 3 для HCl и HClO₄. Диапазон концентрации p-ПД (0,02–0,20 моль/л) был толерантен. Под этими параметрами SA-КПТ достигли КВ 21,4% и 16,5% выхода, превосходя HC-КПТ и PA-КПТ.

ТЭМ-характеризация и ФТ-ИР анализ

HR-ТЭМ показал монодисперсные сферические КПТ (средний диаметр ≈5 нм) с решетчатым интервалом 0,21 нм, соответствующим графеновым (100) плоскостям. ФТ-ИР спектры указывали на более высокую поверхностную оксидацию в SA-КПТ, с выраженными –OH и –COOH признаками и сниженными –NH₂ сигналами, предполагая более оксидированную, гидрофильную поверхность.

Предлагаемый механизм формирования УТ

DFT расчеты показывают, что поперечный рост (−1406 кДж/моль) значительно более выгоден, чем продольный (−616 кДж/моль), приводя к планарным интермедиатам, которые само-собираются в сферические КПТ.

Оптические свойства

SA-КПТ демонстрируют сильное UV поглощение при 290 нм (π→π*), с дополнительными полосами при 430 и 510 нм (феназин-аминовые переходы). Воспламенительные спектры пикуют около 580 нм, совпадая с 600 нм эмиссией, и флуоресценция остается возбуждением-независимой по 220–580 нм, подтверждая природу КПТ.

Клеточное образование

Двухфотонное возбуждение при 850 нм давало 602 нм эмиссию до порошкования и 529 нм после, с повышенной интенсивностью. Конфокальные изображения клеток HeLa, инкубированных с SA-КПТ, показывали цитоплазматическую локализацию, с более сильной зеленой каналом флуоресценции из-за синего сдвига эмиссии.

Заключение

Мы продемонстрировали простой, масштабируемый, сернокислотно-помощенный гидротермальный метод для производства ярких красных КПТ (≈5 нм, КВ = 21,4%, выход = 16,5%). КПТ эмитируют при 600 нм под 300–580 нм возбуждением и при 602 нм под 850 нм двухфотонным возбуждением. Их возбуждение-независимая, высокой яркости флуоресценция и эффективное клеточное поглощение делают их перспективными кандидатами для глубокого тканевого образования и других био-приложений.

Аббревиатуры

CDs:

Углеродные точки

CPDs:

Карбонизированные полимерные точки

HC-CPDs:

КПТ синтезированные из p-ПД с HCl помощью

PA-CPDs:

КПТ синтезированные из p-ПД с HClO₄ помощью

SA-CPDs:

КПТ синтезированные из p-ПД с H₂SO₄ помощью

QYs:

Квантовые выходы

p-PD:

p-фенилендиамин