Ультрачувствительный амперометрический биосенсор для детектирования матриксного металлопротеиназы-7 с помощью Pd-функционализированных углеродных нанокомпозитов

Аннотация

Матриксный металлопротеиназа-7 (ММП-7) способствует опухолевой инвазии, расщепляя внеклеточную матрицу и пептидные связи между аланином и леуцином. Здесь мы представляем Pd-функционализированный углеродный нанокомпозит (Pd-УНК), действующий как высокоимпедансный усилитель в амперометрическом биосенсоре ММП-7. Нанопастателлады палладия катализируют окисление 4-хлоро-1-нафтол (4-ХН) H₂O₂, производя нерастворимый высокоомный осадок на электроде. Врожденно слабопроводящие углеродные наносферы дополнительно повышают резистивность, усиливая токовый дифференциал между состояниями без аналита и с аналитом. Сенсор достигает диапазона детектирования 100 фг/мл до 100 нг/мл и предела детектирования (ПД) 17,38 фг/мл.

Введение

ММП-7, цинк-зависимый эндопептидаза, центральна для опухолевой прогрессии и метастазирования из-за способности деградировать компоненты внеклеточной матрицы. Повышенные сывороточные уровни ММП-7 коррелируют с метастазами лимфоузлов в раке слюнных желез, колоректальном аденокарциноме и высокодифференцированном почечечном раке. Точная, ультрачувствительная детекция ММП-7 — приоритет для ранней диагностики рака. Конвенциональные колориметрические, электрохимилюминесцентные и FRET анализы обычно достигают только пикограммового диапазона, тогда как электрохимические биосенсоры могут достигать фемтограммовых ПД. Однако многие электрохимические протоколы полагаются на ферментативные катализаторы, страдающие от экологической нестабильности и низкой долговечности. Благородные металлы, такие как Pd, демонстрируют превосходную каталитическую активность и химическую робастность, и в комбинации с углеродными носителями обеспечивают стабильную, высокоповерхностную платформу для биоаналитических приложений.

В этой работе мы проектируем Pd-функционализированный углеродный нанокомпозит, служащий импедансным усилителем, используя два синергетических эффекта: (1) низкую электрическую проводимость углеродных наносфер и (2) Pd-катализированное формирование резистивного осадка из окисления 4-ХН/H₂O₂. Этот дизайн драматически снижает ПД биосенсора до 17,38 фг/мл, демонстрируя его потенциал для клинического мониторинга ММП-7.

Методы

Материалы

Все реактивы аналитического класса. HAuCl₄·3H₂O, H₂PtCl₄, 4-ХН, глюкоза, H₂O₂ (30%), бычий тромбин, оксид графена (ОГ), БСА, пептид (NH₂-KKKRPLALWRSCCC-SH), НСЭ, ПСА, ММП-2, ММП-7 и клинические сывороточные образцы от коммерческих поставщиков. Ультрачистая вода (18 МОм·см) и 0,1 М ФСБ (pH 7,4) использовались повсеместно.

Аппаратура

Микроволновой синтез использовал реактор CEM Discover® SP. Морфология и элементный анализ проводили через HITACHI S-4800 СЭМ, H7650 ТЭМ и SU8010 СЭМ/EDS. Электрохимические измерения использовали рабочую станцию CHI600 с трехэлектродной ячейкой (4 мм ССЭ, Pt контрэлектрод, Ag/AgCl референс). Высокоразрешающее ТЭМ выполняли на Tecnai G²F30 (300 кВ).

Синтез Pd-функционализированных углеродных нанокомпозитов

Глюкоза (4 г) растворяли в 40 мл ультрачистой воды, затем гидротермально обрабатывали при 170 °C на 5 ч для получения углеродных наносфер. Суспензия центрифугировали, смывали и редиспергировали в 8 мл воды. Для функционализации Pd, 1 мл наносферной суспензии смешивали с 25 мкл 1 мМ H₂PdCl₄ и микроволновой обрабатывали при 100 °C, 250 Вт на 15 мин. Полученные Pd-углеродные наносферы очищали центрифугированием и редиспергировали в 1 мл воде. БСА (1 мас.%) затем инкубировали с Pd-наносферами на 1 ч для блокировки неспецифического связывания, затем смевали и хранили при 4 °C.

Электроосаждение Au-rGO на ССЭ

ССЭ полировали 0,05 мкм аллюминиевой оксидом, ультразвуковы и промывали. ОГ (8 мг) диспергировали в 20 мл воде 2 ч ультразвуком, затем добавляли 200 мкл 4 мас.% HAuCl₄. Au-редуцированный ОГ (Au-rGO) электроосаждали циклической вольтамметрией от +1,5 до –1,5 В (50 мВ/с). Модифицированный электрод смывали и сушили.

Фабрикация биосенсора

Au-rGO/ССЭ инкубировали с 40 мкл (50 мкМ) пептидом на 40 мин при 37 °C, затем перекрестно-связывали 50 мкл (0,10 мас.%) глютаральдегидом на 30 мин. Наконец, 20 мкл Pd-УНК суспензии капали на пептид-модифицированный электрод и держали 1 ч. Каждый шаг следовало тщательным промывкам ультрачистой водой.

Электрохимическое измерение

После инкубации с 1 нг/мл ММП-7 на 1 ч при 37 °C, электрод промывали и добавляли 50 мкл 1 мМ 4-ХН, содержащего 10 мМ H₂O₂, для инициации реакции осаждения на 50 мин. Квадратно-волновая вольтамметрия (КВВ) выполнялась от –0,2 до 0,6 В (5 мМ [Fe(CN)₆]³⁻/⁴⁻, 0,1 М ФСБ, pH 7,4) с амплитудой импульса 25 мВ и шагом 4 мВ/с.

Результаты и обсуждение

Принцип пептид-кливирующего биосенсора

Как иллюстрировано в Схеме 1, Au-rGO/ССЭ обеспечивает высокопроводную платформу, поддерживающую иммобилизацию пептида через Au-S связи. Pd-УНК действуют как каталитический импедансный усилитель; при добавлении 4-ХН/H₂O₂ Pd катализирует окисление 4-ХН, генерируя нерастворимый осадок, существенно увеличивающий сопротивление электрода. Когда ММП-7 расщепляет пептид (между Ала и Леу), Pd-УНК частично удаляются, снижая резистивный слой и производя измеримый токовый рост. Это двойное усиление — кливирование пептида и каталитическое осаждение — движет ультрачувствительностью сенсора.

Схематическая иллюстрация Pd-функционализированной углеродной наносферы как импедансного усилителя для амперометрического анализа ММП-7

СЭМ-изображения Pd-УНК/пептид/Au-rGO/ССЭ после шага осаждения (Рис. 1а) показывают равномерный нерастворимый слой, подтверждая успешное формирование высокоомного осадка. Сенсор поэтому достигает заметно улучшенного сигнал-шум отношения.

СЭМ изображения Pd-УНК/пептид/Au-rGO/ССЭ (а) обработанные каталитической реакцией осаждения (b)

Характеризация Pd-УНК

Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ) подтверждает равномерное осаждение Pd наночастиц на 150 нм углеродных наносферах (Рис. 2а–с). EDS спектры (Рис. 2d–f) валидируют присутствие C, O, Pd и БСА-производных S/N, указывая на успешную функционализацию. Высокоразрешающее ТЭМ (Рис. 3а–d) раскрывает лице-центрированные кубические Pd кристаллиты с наблюдаемой (1,1,1) решетчатой плоскостью.

ТЭМ микрографии углеродной наносферы (а), Pd-углеродных наносфер (b) и Pd-УНК (c) EDS углеродной наносферы (d), Pd-углеродных наносфер (e) и Pd-УНК (f)

HR-ТЭМ изображения Pd-углеродных наносфер (а), увеличенные изображения Pd наночастиц (b, c) и БПФ изображения Pd наночастиц (d)

Мониторинг построения КВВ и ЭИС

Рис. 4а показывает эволюцию КВВ при модификации электрода. Пиковый ток поднимается до ~420 мкА после Au-rGO осаждения, затем падает при креплении пептида и Pd-УНК из-за добавленного импеданса. Кливирование ММП-7 восстанавливает ток (~48,7 мкА ΔI₁). После шага осаждения ток падает до 136,1 мкА (ΔI₂ = 81,2 мкА). ЭИС (Рис. 4b) подтверждает эти изменения: диаметр полукруга увеличивается с каждой модификацией, и сопротивление падает после кливирования пептида, отражая удаление Pd-УНК.

КВВ (а) и ЭИС (b) ответы процесса модификации электрода в 5 мМ [Fe(CN)₆]³⁻/⁴⁻ фосфат буфере (0,1 М, pH 7,4)

Оптимизация условий детектирования

Оптимальная концентрация пептида найдена при 50 мкМ; время инкубации 40 мин максимизировало стабильность сигнала. Время кливирования пептида и осаждения по 50 мин каждое дали плато-ответы, обеспечивая полные реакции. Эти условия приняты для последующих анализов.

Влияние концентрации пептида (а), времени инкубации 50 мкМ пептида (b), времени кливирования пептида (c) и времени реакции осаждения (d) на токовые ответы биосенсора

Аналитическая производительность

Биосенсор демонстрирует линейный ответ (R² = 0,9967) между пиковым током и log[ММП-7] на 0,1 пг/мл–100 нг/мл (Ур. 1). ПД, рассчитанный при S/N = 3, составляет 17,38 фг/мл. По сравнению с недавними пептид-кливирующими сенсорами, это устройство превосходит другие в чувствительности и динамическом диапазоне (Таблица 1).

а КВВ ответы электрохимического детектирования ММП-7 в 5 мМ [Fe(CN)₆]³⁻/⁴⁻ фосфат буфере (0,1 М, pH 7,4) при концентрациях от 100 фг/мл до 100 нг/мл. b Линейная калибровочная кривая тока и логарифма концентрации ММП-7. Полоски ошибок — стандартные отклонения для n = 3.

Специфичность, стабильность и практическое применение

Тесты воспроизводимости (n = 3) дали относительные стандартные отклонения 1,3–4,0% в диапазоне 0,01–100 нг/мл. Изучение интерференции с ММП-2, НСЭ, ПСА, тромбином и БСА (100 нг/мл каждое) показало незначительные изменения сигнала, подтверждая высокую специфичность. Хранение при 4 °C на 28 дней дало RSD < 10%, указывая на надежную стабильность. Эксперименты восстановления в засеченной сыворотке (10–100 нг/мл) вернули 86,3–117,2%, демонстрируя клиническую применимость.

Заключение

Мы спроектировали Pd-функционализированный углеродный нанокомпозит, служащий импедансным усилителем, использующий каталитическую мощь Pd для окисления 4-ХН и низкую проводимость углеродных наносфер для создания высокорезистивного, осадок-базированного сигнального усиления. Полученный амперометрический биосенсор доставляет ПД 17,38 фг/мл и широкий линейный диапазон (0,1 пг–100 нг/мл) для ММП-7, связанный с отличной специфичностью, воспроизводимостью и стабильностью. Эта платформа иллюстрирует силу импедансных усилителей в электрохимических анализах и пролагает путь для следующего поколения биосенсоров в онкологической диагностике.

Аббревиатуры

4‑CN:

4-хлоро-1-нафтол

BSA:

Бычий сывороточный альбумин

EDS:

Энергодисперсионная рентгеновская спектроскопия

FCC:

Лице-центрированная кубическая

FFT:

Быстрое преобразование Фурье

GCE:

Стеклянноуглеродный электрод

GO:

Оксид графена

HR‑TEM:

Высокоразрешающее трансляционное электронное микроскопирование

LOD:

Предел детектирования

MMP‑2:

Матриксный металлопротеиназа-2

MMP‑7:

Матриксный металлопротеиназа-7

NSE:

Нейрон-специфическая энолаза

PBS:

Фосфатно-буферный раствор

Pd‑CNCs:

Pd-функционализированные углеродные нанокомпозиты

PSA:

Простато-специфический антиген

RSD:

Относительные стандартные отклонения

SEM:

Растровый электронный микроскоп

SWV:

Квадратно-волновая вольтамметрия

TBS:

Тромбин бычьей сыворотки

TEM:

Трансляционный электронный микроскоп