Амперометрический биосенсор матричной металлопротеиназы-7, усиленный Pd-функционализированными углеродными нанокомпозитами

Фон

Матричная металлопротеиназа-7 (ММР-7), фермент, который может разрушать состав внеклеточного матрикса [1], выделяется из-за его ключевой роли в прогрессировании опухоли и метастазировании [2, 3]. Содержание MMP-7 в образцах сыворотки связано с метастазами в лимфатические узлы у пациентов с некоторыми видами рака, такими как рак слюнной железы [4], аденокарцинома толстой кишки [5] и почечно-клеточная карцинома высокой степени злокачественности [6]. Из-за его различных ролей в физиологических процессах высокочувствительное и точное обнаружение MMP-7 привлекло пристальное внимание исследователей [7], что привело к развитию нескольких подходов, включая колориметрию [8], электрохемилюминесценцию (ECL) [9] и флуоресценцию. резонансный анализ переноса энергии (FRET) [10]. Тем не менее, предел обнаружения (LOD) этих подходов обычно находится в диапазоне пикограмм и, следовательно, недостаточно низок. По сравнению с этими методами электрохимические биосенсоры предлагают гораздо более совершенные возможности обнаружения MMP-7 с более низкими LOD на уровне фемтограмм [11]. Более того, были разработаны некоторые аналитические методы для удовлетворения насущных потребностей в сверхчувствительном электрохимическом обнаружении MMP-7 с использованием электрохимических анализов из-за их низкой стоимости и миниатюризации [12].

Во многих электрохимических протоколах ферментативная биокаталитическая реакция применима для усиления сигнала, чтобы улучшить работу амперометрического биосенсора [13, 14]. Однако было хорошо известно, что фермент, наиболее широко используемый катализатор в каталитических реакциях, имел очевидные недостатки как в отношении чувствительности к окружающей среде, так и в отношении низкой стабильности [15,16,17,18,19]. Следовательно, разработка высокоэффективного и стабильного катализатора является высшим приоритетом при создании сверхчувствительного электрохимического анализа для обнаружения MMP-7. Pd - это благородный металл с превосходными каталитическими свойствами и высокой химической стабильностью в каталитических реакциях [20, 21]. Кроме того, углеродный материал может действовать как химический инертный носитель в катализаторах, адсорбируя материалы из благородных металлов и сохраняя каталитические свойства [22, 23].

Принимая во внимание вышеупомянутые ситуации, мы разработали углеродный нанокомпозит, функционализированный Pd, в качестве усилителя импеданса, чтобы резко повысить чувствительность амперометрического анализа MMP-7, который выполняет следующие две функции. (1) Углеродные наносферы - материал с плохой проводимостью [24]; (2) Наночастицы Pd могут катализировать окисление 4-хлор-1-нафтола H ₂ . О ₂ образовывать нерастворимые осадки in situ, образуя высокоомные осадки на электродах [25]. Эти два фактора увеличивают удельное сопротивление и значительно снижают ток, что может значительно повысить чувствительность биосенсора и получить низкий уровень детализации 17,38 фг / мл ⁻¹ . . Созданный Pd-функционализированный нанокомпозит для каталитической реакции осаждения применим в амперометрических анализах MMP-7 с высокой селективностью и чувствительностью.

Методы

Материал

HAuCl ₄ · 3H ₂ О, Н ₂ PtCl ₄ , 4-CN, глюкоза, H ₂ О ₂ (30%), тромбин бычьей сыворотки (TBS) были закуплены у Alfa Aesar (Тяньцзинь, Китай). Оксид графена (GO) был приобретен в JCNANO (Нанкин, Китай). Бычий сывороточный альбумин (BSA, стандартная степень чистоты) был коммерчески получен от Beijing Xinjingke Biotechnologies Co., Ltd. (Пекин, Китай). Пептид (NH ₂ -KKKRPLALWRSCCC-SH) был получен от Science Peptide Biological Technology Co., Ltd. (Шанхай, Китай). Нейрон-специфическая енолаза (NSE) и простатоспецифический антиген (PSA) были приобретены в Shanghai Linc-Bio Science Co. Ltd. (Шанхай). Матричная металлопротеиназа-2 (ММР-2) была приобретена у Yeasen Biotechnologies Co., Ltd. (Шанхай, Китай). ММП-7 был предоставлен Sino Biological Inc. (Пекин, Китай). Клинические образцы сыворотки крови человека были приобретены компанией ZhongKe ChenYu Biotech (Пекин, Китай). Все водные растворы были приготовлены на сверхчистой воде (удельное сопротивление> 18 МОм · см). Раствор фосфатного буфера (PBS) содержит 0,1 М KCl и 10 мМ фосфатный буфер (pH =7,4).

Аппарат

Микроволновый синтез осуществляли с помощью микроволнового реактора CEM Discover® SP (CEM, США). Изображения на сканирующем электронном микроскопе (СЭМ) получали с использованием СЭМ HITACHI S-4800 (HITACHI, Япония). Изображения на просвечивающем электронном микроскопе (ПЭМ) получали на ТЕМ HITACHI H7650 (HITACHI, Япония). Энергодисперсионная рентгеновская спектроскопия (EDS) была определена на SEM HITACHI SU8010 (HITACHI, Япония). Все электрохимические измерения проводились на электрохимической рабочей станции CHI600 (Chenhua Instruments Co., Шанхай, Китай). Стеклоуглеродный электрод (GCE) (диаметром 4 мм) использовался в качестве рабочего электрода, платиновая проволока и электрод Ag / AgCl были в качестве противоэлектрода и электрода сравнения, таким образом, в эксперименте была сконструирована трех электрохимическая система. Изображения с помощью просвечивающего электронного микроскопа высокого разрешения (HR-TEM) были выполнены Tecnai G ² Ф30 ТЭМ на разгон до 300 кВ

Синтез Pd-функционализированных углеродных нанокомпозитов

Функционализированные Pd углеродные нанокомпозиты (Pd-CNC) были синтезированы согласно ранее опубликованной литературе [26]. Вкратце, 4 г глюкозы растворяли в 40 мл сверхчистой воды с образованием прозрачного раствора. Вышеупомянутый раствор затем переносили в автоклав из нержавеющей стали с тефлоновым покрытием объемом 50 мл и выдерживали при 170 ° C в течение 5 часов. После реакции прозрачный раствор стал темно-коричневым. Полученные углеродные наносферы собирали центрифугированием и несколько раз промывали ультрачистой водой / этанолом. Полученные продукты повторно помещали в 8 мл сверхчистой воды.

Для функционализации наночастиц Pd на углеродных наносферах [24] 1 мл суспензии углеродных наносфер смешивали с 25 мкл HPdCl ₄ решение. Смесь подвергали реакции в микроволновом реакционном приборе (250 Вт) при 100 ° C в течение 15 минут, а затем охлаждали до комнатной температуры естественным путем. Затем полученные наносферы Pd-углерод центрифугировали, промывали сверхчистой водой и повторно помещали в 1 мл сверхчистой воды.

Чтобы избежать неспецифической адсорбции MMP-7, BSA был дополнительно модифицирован на наносферах Pd-углерод. Суспензию наносфер перемешивали со 100 мкл раствора БСА (1 мас.%) В течение 1 ч при комнатной температуре. После нескольких этапов центрифугирования и промывки наносферы Pd-углерод, модифицированные BSA, повторно помещали в сверхчистую воду и хранили при 4 ° C для дальнейших экспериментов.

Электроосаждение Au-rGO на GCE

Перед модификацией GCE полировали суспензией оксида алюминия 0,05 мкм и промывали ультразвуком в сверхчистой воде и этаноле соответственно. Раствор для электроосаждения был сконфигурирован следующим образом [27]. Сначала 8 мг порошка GO диспергировали в 20 мл сверхчистой воды при ультразвуковой обработке в течение 2 часов. Затем 200 мкл HAuCl ₄ раствор (4 мас.%) был добавлен в суспензию GO. Затем электроосаждение Au-rGO на GCE методом циклической вольтамперометрии (CV) в диапазоне от 1,5 до - 1,5 В со скоростью сканирования 50 мВ с ^{- 1} в вышеуказанном растворе для электроосаждения. Наконец, GCE, осажденный Au-rGO (Au-rGO / GCE), промывали сверхчистой водой для удаления остаточного раствора электроосаждения, а затем сушили продувкой азотом при комнатной температуре.

Изготовление биосенсора

Au-rGO / GCE инкубировали с 40 мкл раствора пептида (50 мкМ) в течение 40 мин при 37 ° C. Затем модифицированный пептид на GCE активировали 50 мкл раствора глутаральдегида (0,10 мас.%) В течение еще 30 мин (пептиды / Au-rGO / GCE). Затем 20 мкл суспензии Pd-CNC по каплям наносили на электрод, модифицированный пептидами, на 1 час (Pd-CNC / пептиды / Au-rGO / GCE). После каждого этапа модификации модифицированный электрод промывали сверхчистой водой.

Электрохимические измерения

Восемьдесят микролитров раствора ММП-7 (1 нг мл ^-1 ) инкубировали с Pd-CNC / пептидами / Au-rGO / GCE в течение 1 ч при 37 ° C и в достаточной степени промывали ультрачистой водой. Затем 50 мкл 1,0 мМ раствора 4-CN, содержащего 10 мМ H ₂ О ₂ добавляли по каплям для продолжения реакции осаждения в течение 50 мин. Наконец, измерение прямоугольной вольтамперометрии (SWV) было проведено в диапазоне от –0,2 до 0,6 В в 5 мМ [Fe (CN) ₆ ] ^{3– / 4–} раствор с фосфатным буфером (0,1 М, pH =7,4) с амплитудой импульса 25 мВ и потенциалом увеличения 4 мВ с ^-1 .

Результаты и обсуждение

Принцип работы биосенсора пептидного расщепления

Процесс создания биосенсора на основе пептидного расщепления проиллюстрирован на схеме 1. Сначала Au-rGO был нанесен на стеклоуглеродный электрод (GCE) с помощью электрохимического метода, затем пептиды были иммобилизованы на Au-rGO посредством связывания Au-S. Pd-CNC были составлены в качестве каталитического усилителя, а глутаральдегид был выбран в качестве химического линкера между пептидом и усилителями. 4-CN и H ₂ О ₂ были использованы в качестве субстратов для катализированного осаждения для увеличения импеданса. В частности, в качестве фермента расщепления пептида между аланином (A) и лейцином (L) в пептидах был выбран MMP-7 [8], который вызвал нечеткое изменение сигнала тока, измеренного с помощью SWV. Электроосаждение Au-rGO на GCE имеет два преимущества:(1) Au-rGO может эффективно улучшить проводимость чувствительного интерфейса; и (2) он позволяет сайтам иммобилизовать пептиды. Воспользовавшись высоким импедансом и каталитическими характеристиками Pd-CNC, ΔI затем амплифицировали путем замены Pd-CNCs специфическим пептидом (NH2-KKKRPLALWRSCCC-SH) расщепления. Это явление способствует плохой электропроводности Pd-CNC и высокому импедансу осадков, образующихся при окислении 4-CN с помощью H ₂ О ₂ катализируется Pd-CNCs.

Схематическое изображение Pd-функционализированной углеродной наносферы как усилителя импеданса для амперометрического анализа MMP-7

Каталитическая реакция преципитации на GCE была дополнительно охарактеризована с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM) путем инкубации Pd-CNC на поверхности пептидов / Au-rGO / GCE (рис. 1а). Pd-CNC были покрыты нерастворимым слоем после реакции осаждения, что указывает на формирование нерастворимого слоя с плохой проводимостью на модифицированном электроде (рис. 1b). Таким образом, биосенсор для сверхчувствительного обнаружения ММП-7 был успешно создан на основе усиления чувствительности, вызванного как расщеплением пептида, так и каталитическим осаждением.

СЭМ-изображения Pd-CNCs / пептидов / Au-rGO / GCE ( a ), обработанный реакцией каталитического осаждения ( b )

Характеристика ЧПУ Pd

Типичным гидротермальным методом были успешно приготовлены гомогенные Pd-CNC. Морфология углеродных наносфер, Pd-углеродных наносфер и Pd-CNC была охарактеризована с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и энергодисперсионной рентгеновской спектрометрии (EDS). Наночастицы Pd были сформированы и распределены на углеродных наносферах после микроволновой реакции (рис. 2b), демонстрируя успешное получение Pd-углеродных наносфер диаметром 150 нм (рис. 2a). Морфология Pd-CNCs показана на рис. 2c. Результаты EDS подтверждают химический состав углеродных наночастиц, Pd-углеродных наносфер и Pd-CNCs, что показывает, что углеродные наночастицы содержат C и O (рис. 2d). После функционализации наночастиц Pd, Pd также присутствовал в спектрах наносфер Pd-углерод (рис. 2e), в то время как S и N, обнаруженные в спектрах Pd-CNC, происходят из BSA, который использовался для блокировки наносфер Pd-углерод ( Рис. 2е). Эти результаты интуитивно показывают успешный синтез каталитических усилителей Pd-CNC. Изображения ПЭМ-ВР наносфер Pd-углерод (рис. 3a) показывают, что функционализированные наночастицы Pd (рис. 3b) находятся в кубической (ГЦК) фазе с наблюдаемой плоскостью решетки (1,1,1) (рис. 3в). Соответствующие изображения быстрого преобразования Фурье (БПФ) (рис. 3d) также подтверждают ГЦК-кристаллическую природу наночастиц палладия.

Электронные микроскопы углеродной наносферы ( a ), Наносферы Pd-углерод ( b ) и Pd-CNC ( c ) EDS углеродной наносферы ( d ), Наносферы Pd-углерод ( e ) и Pd-CNC ( f )

Изображения ПЭМ-ВР наносфер Pd-углерод ( a ), увеличенные изображения наночастиц Pd ( b, c ) и БПФ-изображения наночастиц Pd ( d )

Описание процедур создания биосенсора

Процедуры построения биосенсора контролировались измерениями SWV (рис. 4a) и спектроскопией электрохимического импеданса (EIS) (рис. 4b). По сравнению с токовым сигналом GCE без покрытия (кривая GCE без покрытия) пиковый ток в диапазоне потенциалов увеличился примерно до 420 мкА (кривая Au-rGO / GCE) после электроосаждения Au-rGO, что может быть связано с отличной проводимостью Au-rGO. Затем пик тока сигнала уменьшился после иммобилизации пептидов на электроде (кривая пептидов) и еще больше уменьшился после связывания между пептидами и Pd-CNC из-за высокого импеданса пептидов и энхансеров (кривая Pd-CNC). После инкубации с MMP-7 пиковый ток увеличивался (кривая расщепления MMP-7), что может быть вызвано специфическим расщеплением пептидов MMP-7 и частичным удалением энхансеров с поверхности электрода. При тех же условиях текущее изменение (ΔI ₁ ) между кривыми «Pd-CNCs» и «расщепление MMP-7» было рассчитано как 48,7 мкА. Затем пиковый ток уменьшали после реакции каталитического осаждения 4-CN, с пиком тока 136,1 мкА (кривая осаждения расщеплением MMP-7). Напротив, биосенсор без ММР-7 индуцировал более низкий пик тока (54,9 мкА, кривая осаждения), который был заявлен как холостой сигнал после катализируемой реакции осаждения. В данных обстоятельствах ΔI ₂ разность текущего сигнала между кривыми «преципитация» и кривой «преципитация расщепления ММП-7» увеличилась с 48,7 до 81,2 мкА. EIS также использовался для контроля изготовления биосенсора. Сопротивление переносу электрона соответствовало диаметру полукруга графиков Найквиста (рис. 4б). Для сравнения, график пептиды / Au-rGO / GCE (кривая пептидов) показывает больший полукруг и, следовательно, большую устойчивость, чем у Au-rGO / GCE (кривая Au-rGO / GCE) и GCE без покрытия (кривая без GC) с наименьшим кружком, что указывает на успешную модификацию пептидов на GCE. Устойчивость увеличивалась, когда пептиды были связаны с усилителем через глутаральдегид (кривая Pd-CNCs). Диаметр полукруга немного уменьшился (кривая расщепления MMP-7) после инкубации с MMP-7, что можно приписать MMP-7, специфически расщепляющему пептиды. Напротив, сопротивление значительно увеличилось, когда биосенсор был погружен в раствор 4-CN и H ₂ . О ₂ (кривая осаждения) _. При прохождении реакции как пептидного расщепления, так и каталитического осаждения, устойчивость явно снижалась (кривая осаждения расщепления MMP-7).

SWV ( a ) и EIS ( b ) реакции процесса модификации электрода в 5 мМ [Fe (CN) ₆ ] ^{3– / 4-} фосфатный буфер (0,1 M, pH =7,4)

Оптимизация условий обнаружения

Количество и время инкубации пептидов, как важных факторов для детектирования биосенсора, были дополнительно оптимизированы. Было обнаружено, что текущий сигнал соответственно уменьшался, когда концентрация пептида увеличивалась с 20 до 40 мкМ и оставалась постоянной между 50 и 80 мкМ (фиг. 5a). Чтобы избежать неспецифической адсорбции, мы выбрали 50 мкМ для последующих измерений, а затем оптимизировали время инкубации 50 мкМ пептида (рис. 5b). Ток SWV постепенно уменьшался от 20 до 40 мин, а затем оставался постоянным через 40 мин. Таким образом, в качестве времени инкубации пептидов было выбрано 40 мин. Время реакции расщепления также является важным фактором для аналитических характеристик биосенсора (рис. 5c). Сигнал биосенсора увеличивался, когда время расщепления составляло от 30 до 50 минут, затем оставался постоянным через 50 минут, что свидетельствует о полном расщеплении пептида. Таким образом, для следующих экспериментов в качестве времени расщепления было выбрано 50 мин. Было обнаружено, что реакция преципитации, которая также влияет на чувствительность биосенсора (рис. 5d), усиливается в течение 50 мин, а электрохимический сигнал непрерывно снижается. Поскольку текущий сигнал поддерживался постоянным при дальнейшем увеличении времени реакции, для следующего анализа было выбрано 50 минут в качестве времени реакции осаждения.

Влияние концентрации пептида ( a ), время инкубации 50 мкМ пептида ( b ), время расщепления пептида ( c ) и время реакции осаждения ( д ) на текущие отклики биосенсора

Производительность предлагаемого биосенсора

После инкубации с различными концентрациями ММП-7 в оптимальных условиях была определена производительность предложенного биосенсора. Как показано на фиг. 6, с уменьшением концентрации MMP-7 сигнал SWV уменьшался. График калибровки показывает хорошую линейную зависимость между текущими пиками и логарифмом концентраций аналита в диапазоне от 0,1 пг / мл ^-1 до 100 нг мл ^-1 . Линейное уравнение было определено как ( I =- 16,53lgCMMP-7-137,26) с коэффициентом корреляции 0,9967. Предел обнаружения биосенсора составил 17,38 фг / мл ^-1 . для MMP-7 при отношении сигнал / шум 3 (S / N =3; - стандартное отклонение сигнала в холостом растворе). По сравнению с недавними сообщениями об обнаружении пептидного расщепления MMP-7, биосенсор показал лучшие аналитические характеристики (таблица 1).

а SWV-ответы электрохимического обнаружения MMP-7 в 5 мМ [Fe (CN) ₆ ] ^{3– / 4–} забуференный фосфатом (0,1 М, pH =7,4) при концентрациях от 100 фг / мл ^-1 до 100 нг мл ^-1 . б Линейная калибровочная кривая тока и логарифм концентрации ММП-7. Планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения для n =3

Оценка эффективности иммуносенсора

Для оценки воспроизводимости биосенсора три модифицированных электрода инкубировали с 0,01, 0,1, 1, 10 и 100 нг / мл ^-1 ММП-7. Соответствующие стандартные отклонения были рассчитаны и составили 1,3%, 1,4%, 4,0%, 1,0% и 3,0% соответственно, что указывает на хорошую воспроизводимость биосенсора. MMP-2, NSE, PSA, TBS и BSA использовались в качестве отвлекающих факторов для анализа специфичности этого биосенсора. При инкубации биосенсора с отдельными смесями 1 нг / мл ^-1 очевидных ответов не наблюдалось. ММП-7 с (100 нг мл ^-1 каждый) MMP-2, NSE, PSA, TBS и BSA. По сравнению с биосенсором, инкубированным всего с 1 нг / мл ^-1 MMP-7, текущие сигналы каждой смеси были почти одинаковыми (рис. 7a), что демонстрирует, что биосенсор демонстрирует превосходную специфичность для MMP-7. Для исследования стабильности сконструированный биосенсор хранился при 4 ° C в течение 28 дней, и его эффективность при обнаружении MMP-7 оценивалась каждые 7 дней (рис. 7b). Относительные стандартные отклонения (RSD) между параллельными экспериментами были менее 10%, что свидетельствует о замечательной стабильности биосенсора.

Текущие ответы SWV ( a ) о противоинтерференционной способности биосенсора (планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения для n =3). Концентрация отвлекающих факторов:MMP-2 (100 нг / мл ^-1 ), NSE (100 нг / мл ^-1 ), ПСА (100 нг / мл ^-1 ), THR (100 нг мл ^-1 ) и БСА (100 нг / мл ^-1 ), соответственно. Смесь содержит все эти отвлекающие факторы (100 нг / мл ^-1 ) и MMP-7 (1 нг мл ^-1 ). Ответы SWV ( b ) предлагаемых биосенсоров, хранимых при 4 ° C в течение разного времени для обнаружения 1 нг / мл ⁻¹ ММП-7

Для исследования возможности применения предложенного метода были проведены восстановительные эксперименты. Выделение варьировалось от 86,3 до 117,2% (таблица 2), что еще раз указывает на многообещающую применимость биосенсора в клинических анализах.

Выводы

Таким образом, углеродный нанокомпозит, функционализированный Pd, был изготовлен как новый усилитель импеданса, который обнаруживает многообещающий H ₂ О ₂ каталитические свойства для окисления 4-CN. Используя высокий импеданс осаждения нерастворимого окисленного 4-CN на электроде, был сконструирован амперометрический биосенсор для обнаружения MMP-7. Биосенсор обладает сопоставимой чувствительностью, широким диапазоном обнаружения, хорошей практичностью и выдающейся селективностью по сравнению с обнаружением MMP-7, что предполагает его потенциальное применение в различных биологических приложениях. Наша работа также подчеркивает важность усилителя импеданса в улучшении характеристик амперометрических анализов, поощряя производство новых усилителей с повышенной каталитической активностью и высоким сопротивлением.

Сокращения

4-CN:

4-хлор-1-нафтол

BSA:

Бычий сывороточный альбумин

EDS:

Энергодисперсионная рентгеновская спектроскопия

FCC:

Кубическая грань-центр

БПФ:

Быстрое преобразование Фурье

GCE:

Стеклоуглеродный электрод

GO:

Оксид графена

HR-TEM:

Просвечивающий электронный микроскоп высокого разрешения

LOD:

Предел обнаружения

MMP-2:

Матричная металлопротеиназа-2

MMP-7:

Матричная металлопротеиназа-7

NSE:

Енолаза, специфичная для нейронов

PBS:

Фосфатный буферный раствор

ЧПУ PD:

Углеродные нанокомпозиты, функционализированные pd

PSA:

Простатоспецифический антиген

RSD:

Относительные стандартные отклонения

SEM:

Сканирующий электронный микроскоп

SWV:

Прямоугольная вольтамперометрия

TBS:

Тромбин бычьей сыворотки

ТЕМ:

Просвечивающий электронный микроскоп