Адресная доставка доксорубицина с помощью биосовместимых хитозановых нанопузырьков и ультразвука

Аннотация

Ультразвуковые навигируемые нанопузырьки (НП) доставки возникли как неинвазивная стратегия для местоспецифического транспорта лекарств. Хитозановые НП предлагают превосходную биосовместимость и высокую загрузочную способность для химиотерапевтиков. В этом исследовании мы изготовили доксорубицин гидрохлорид (DOX)-загруженные хитозановые НП, квантовали их размер, дзета-потенциал, эффективность инкапсуляции (EE = 54,18%) и профиль выпуска лекарства, и оценили их образовательную производительность, биобезопасность и терапевтическую эффективность в клетках грудного рака MCF-7. DOX-НП выпускали 46% своей нагрузки в течение 5 ч под воздействием ультразвука (УЗ) против 9% без УЗ, и доставляли значительно более высокие внутриклеточные уровни DOX и скорости апоптоза, чем свободный DOX. Эти результаты демонстрируют, что биосовместимые хитозановые НП — перспективная платформа для ультразвук-посреднической, адресной доставки доксорубицина.

Введение

Химиотерапия остается краеугольным камнем лечения злокачественных опухолей, однако системная токсичность ограничивает терапевтический индекс агентов, таких как доксорубицин. Локализованная доставка лекарств может увеличить концентрацию в месте опухоли, щадя здоровые ткани. Ультразвуковая адресная микро-/нано-пузырьковая деструкция (UTN/MD) предоставляет неинвазивное, образ-навигируемое средство усиления проницаемости и улавливания лекарств. Конвенциональные микропузырьки слишком велики для эффективной экстравасации, в то время как нанопузырьки могут проходить через капиллярную стенку и эффективнее достигать паренхимы опухоли.

Существующие формулировки НП часто опираются на синтетические липиды или полимеры, вызывающие биосовместимость опасения. Хитозан, естественный, биоразлагаемый полисахарид, обладает низкой иммуногенностью, антибактериальной активностью и врожденными противоопухолевыми свойствами. В сочетании с лецитином и пальмитиновой кислотой — обоими одобренными FDA, низкотоксичными поверхностно-активными веществами — хитозановые НП могут быть спроектированы безопасными и высокофункциональными.

Материалы и методы

Материалы

Перфторпропан (C₃F₈) служил газовым ядром, в то время как хитозан средней молекулярной массы (100–300 кДа) формировал оболочку. Epikuron 200 (соевый лецитин), пальмитиновая кислота и Pluronic F68 добавлялись для улучшения стабильности и снижения агрегации. Доксорубицин гидрохлорид (Sigma-Aldrich) был модельным химиотерапевтиком.

Клеточная линия

MCF-7 человеческие клетки грудного карциномы (ATCC) культивировались в DMEM + 10% FBS при 37 °C, 5% CO₂.

Подготовка DOX-загруженных хитозановых НП

DOX (1 мг/мл) смешивался с раствором хитозана, вихревался и инкубировался при 65 °C в течение 1 ч. Отдельно, смесь пальмитиновой кислоты–Epikuron 200 гомогенизировалась и заполнялась в 1,5 мл пробирки, которые затем заменялись на C₃F₈ и осциллировались 120 с. Полученные НП комбинировались с DOX-хитозановым раствором в ледяной бане, охлаждались при –4 °C в течение 30 мин, и затем стабилизировались Pluronic F68. Свободный DOX удалялся 30 кДа диализом.

Физико-химическая характеристика

Размер и дзета-потенциал измерялись динамическим рассеянием света (ДРС) и анализатором Delsa Nano C. Морфология визуализировалась флуоресцентной микроскопией (×100 масляная иммерсия) и трансляционной электронной микроскопией (TEM) после уранилацетатного окрашивания.

Стабильность

НП хранились при 4 °C (48 ч) или комнатной температуре (6 ч) и переоценивались ДРС и оптической микроскопией. Стабильность в человеческой сыворотке (Seronorm™) оценивалась после 6 ч инкубации при 25 °C.

Загрузочная способность DOX

UV-Vis стандартная кривая (480 нм) квантовала инкапсулированный DOX. Эффективность инкапсуляции (EE) рассчитывалась как EE = (A/B) × 100% (A = DOX в НП, B = начальный DOX). Лиофилизация и взвешивание давали загрузочную способность 64,12 мг DOX г⁻¹ НП.

Ультразвук-посреднический выпуск DOX

Выпуск DOX мониторился диализом (отсечка 12 000–14 000 Да) при 37 °C с или без УЗ (1,0 Вт/см², 20 кГц, 40 с). Образцы собирались ежечасно в течение 24 ч и квантовались UV-Vis.

In vitro ультразвуковая визуализация

Используя сканер GE LOGIQ E9, мы записывали временно-интенсивные кривые при MI 0,10, глубине 4,5 см и 60-секундных клипах. Децибеловые значения строились для оценки контрастной стабильности.

Цитотоксичность пустых НП

MCF-7 клетки экспонировались переменным НП концентрациям (0–30%) с УЗ при 0,5 Вт/см² (30 с) или 1,0 Вт/см² (30 с). Жизнеспособность клеток измерялась через 24 ч CCK-8 анализом (поглощение 450 нм).

Внутриклеточный улавливание DOX

Клетки обрабатывались DOX-НП (20%) или свободным DOX (эквивалентная концентрация) в течение 1 ч, с или без УЗ (0,5 Вт/см², 30/60 с). После промывки клетки анализировались проточной цитометрией (красный флуоресцентный гейт, 10 000 событий).

Пролиферация клеток и апоптоз

После 24-часового обращения жизнеспособность оценивалась CCK-8. Апоптоз через 6 ч квантовался Annexin V-APC окрашиванием и проточной цитометрией.

Статистический анализ

Данные представляют среднее ± SD из трех независимых экспериментов (p < 0,05). Анализы выполнялись в SPSS 18.0.

Результаты

Физико-химическая характеристика

DOX-НП демонстрировали равномерную сферическую морфологию (Рис. 1). ДРС раскрыл средний диаметр 641 нм (P.I. 0,256) и высокий положительный дзета-потенциал +67,1 мВ, обеспечивающий коллоидную стабильность.

Стабильность и эффективность загрузки

НП оставались стабильными 48 ч при 4 °C; незначительное увеличение размера происходило после 6 ч при 25 °C в ФСБ или сыворотке. Эффективность инкапсуляции составляла 54,18% с загрузочной способностью 64,12 мг/г.

Профиль выпуска DOX

УЗ воздействие ускоряло выпуск DOX: 46,5% выпускалось через 5 ч против 9,3% без УЗ. Через 24 ч ~80% лекарства выпускалось под УЗ, тогда как только 19,4% без.

Стабильность ультразвуковой визуализации

Временно-интенсивные кривые (Рис. 5) подтверждали устойчивое контрастное усиление и медленное затухание, указывая, что DOX-НП обеспечивают надежную визуализацию под клиническими УЗ настройками.

Биобезопасность пустых НП

Жизнеспособность клеток оставалась >80% при 30% НП концентрации с 0,5 Вт/см², 30 с УЗ. Более высокая интенсивность или продолжительное воздействие незначительно снижали жизнеспособность, подтверждая низкую цитотоксичность НП формулировки.

Усиленная доставка DOX УЗ

Проточная цитометрия показала заметно более высокую внутриклеточную DOX флуоресценцию в клетках, обработанных DOX-НП + УЗ, по сравнению со свободным DOX (p < 0,01). Более длинные УЗ импульсы (60 с) дополнительно увеличивали улавливание.

Улучшенная противоопухолевая эффективность

Анализы жизнеспособности раскрыли 21,0% выживание для DOX-НП в одиночку, падающее до 3,1% с 30 с УЗ и 2,2% с 60 с УЗ. Свободный DOX в одиночку давал 6,4% выживание, в то время как свободный DOX + УЗ достигал 4,1%. Анализ Annexin V показывал 45,7% апоптоз с DOX-НП + УЗ против 4,4% со свободным DOX.

Обсуждение

Грудной рак остается ведущей причиной онкологической смертности женщин. Кардиотоксичность доксорубицина необходима адресных систем доставки. Хитозановые НП, покрытые Pluronic F68, сочетают благоприятную биосовместимость с эффективной загрузкой лекарства и УЗ-триггерируемым выпуском. По сравнению с липидными микропузырьками или внекорпусными ударными волновыми подходами, УЗ-навигируемые хитозановые НП предлагают превосходную образовательную способность, более низкую системную токсичность и усиленное улавливание опухолевых клеток через сонопорацию.

Наши данные подтверждают, что УЗ облучение способствует быстрому выпуску DOX из НП и заметно улучшает внутриклеточную доставку и апоптоз. Высокий дзета-потенциал обеспечивает коллоидную стабильность, в то время как естественное происхождение хитозана смягчает быстрый клиренс и иммунную активацию.

Заключение

Мы успешно спроектировали биосовместимые хитозановые нанопузырьки, эффективно загружающие доксорубицин, сохраняющие ультразвуковой контраст и демонстрирующие низкую внутреннюю токсичность. Ультразвуковая стимуляция запускает быстрый выпуск лекарства и значительно улучшает терапевтическую эффективность в клетках грудного рака, подчеркивая потенциал этой платформы для адресной, неинвазивной химиотерапии.

Аббревиатуры

CCK-8

Cell Counting Kit-8

DMEM

Среда Дюльбекко модифицированная Eagle

DOX

Доксорубицин гидрохлорид

EE

Эффективность инкапсуляции

NBs

Нанопузырьки

US

Ультразвук