Продвинутый емкостной биосенсор на основе нанокомпозита цеолит-оксид железа для быстрого обнаружения IL-3 при сепсисе

Аннотация

Сепсис — крайнее состояние, вызванное системным воспалительным ответом на тяжелую микробную инфекцию, приводящее к фатальным последствиям. При сепсисе иммунная система выделяет в кровоток сигнальные биомолекулы (цитокины), привлекающие иммунные клетки; развивается «цитокиновый шторм», приводящий к повреждению органов и тканей. Ранняя диагностика сепсиса подходящим биомаркером позволяет своевременно начать лечение и спасти жизни. Интерлейкин-3 (IL-3) является независимым предиктором сепсиса и смертности, вырабатываемым B-клетками активатора врожденного ответа (IRA) после активации Toll-подобных рецепторов. Повышенный уровень IL-3 коррелирует с высокой смертностью и играет ключевую роль в иммунном регулировании и ответе на кортикостероиды. Цель работы — квантификация IL-3 с помощью емкостного электрохимического сенсора, модифицированного нанокомпозитом цеолит-оксид железа.

Обнаружение биомолекул биосенсорами сильно зависит от иммобилизации целевой или детектирующей молекулы на поверхности трансляторного электрода. Большее число иммобилизованных проб с правильной ориентацией снижает предел детектирования. Традиционные методы (физическая адсорбция, электростатическое взаимодействие, ковалентное связывание, инкапсуляция в полимеры) часто не обеспечивают воспроизводимость и биосовместимость, особенно для малых молекул (РНК, ДНК, аptaмеры, пептиды). Наноматериалы (золотые наночастицы, силиций, алюминий, графен) улучшают иммобилизацию, биосовместимость и стабильность. Недавно неорганические материалы (цеолит, глина, соль-гель) привлекают внимание для решения этих проблем. Зеленая синтеза наноматериалов поощряется из-за отсутствия опасных веществ и низкой стоимости. В данном работе получен нанокомпозит цеолит-железо, извлеченный из зольного пепла угольной шахты, и использован как субстрат для емкостного электрода для иммобилизации анти-IL-3 антител. По сравнению с предыдущими наноматериалами для детектирования интерлейкинов, текущая система дает улучшения: высокая пригодность для электрохимических сенсоров, меньше экспериментальных этапов, пригодность для поверхностной химической функционализации и высокая антифулинговая способность.

Емкостной биосенсор регистрирует притяжение между пробой и мишенью на поверхности электрода, измеряя изменения диэлектрического слоя на интерфейсе электрод-электролит при связывании мишени с иммобилизованной пробой. Емкость описывается C = (2nε₀εA)/d. Бесфарадейский емкостной биосенсор избегает дентурации белков металлизацией и улучшает взаимодействие проба-мишень. В работе проведен эксперимент с бесфарадейским емкостным биосенсором на поверхности электрода, модифицированного цеолитом-железом. Цеолит-железо прикрепляли к электоду через (3-амино-пропил)-триметоксисилан (APTMS) как аминовый линкер, затем анти-IL-3 антитело присоединяли через взаимодействие аминовой поверхности и карбоксильной группы (COOH) антитела. Модифицированный анти-IL-3 электрод использовался для квантификации IL-3 и диагностики сепсиса.

Материалы и методы

Аппарат и реактивы

Зольный пепел получен с тепловой электростанции в Индии. Гидроксид натрия и серная кислота — Sigma Aldrich (США). APTMS — Merck (США). Фильтровальная бумага Whatman — Thermo Fisher Scientific (США). IL-3 и анти-IL-3 антитела — Santa Cruz Biotechnology (США). Морфология и состав наноматериала изучали FESEM (Hitachi S-4300 SE, Япония) и FETEM (JEM-2100F, JEOL, Япония).

Синтез наноматериала цеолит-железо

Синтез включал три этапа: (1) разделение железных частиц; (2) экстракция натрий-алюмосиликата; (3) получение наночастиц цеолит-железо методом соль-гель.

Разделение железа из зольного пепла

25 г зольного пепла смешали с 500 мкл дистиллированной воды, мешали 30 мин магнитным мешалкой. Железные частицы, прилипшие к мешалке, отделили. 1 г частиц смешали с 25% серной кислотой, мешали 1 ч при 50 °C. Железосодержащий раствор и частицы отделили фильтровальной бумагой Whatman и использовали как основу для оксида железа.

Экстракция натрий-алюмосиликата из зольного пепла

Щелочной экстракцией: 25 г железо-очищенного зольного пепла смешали с 500 мкл 2 М NaOH, нагревали при 100 °C с мешанием 6 ч. После охлаждения натрий-алюмосиликат (раствор) отделили фильтровальной бумагой. Фильтрат использовали как основу для синтеза цеолита.

Синтез наноматериала цеолит-железо методом соль-гель

Извлеченное железо и натрий-алюмосиликат использовали как основу. В стакане 200 мл натрий-алюмосиликата при pH 12 под мешанием на горячей пластине капали железный раствор (pH 1) до pH 7. При pH 7 образовывался белый гель, который мешалиovernight для однородного распределения наночастиц. Гель отделяли центрифугированием (10000×g, 10 мин), вымывали 25% этанолом и дистиллированной водой. Продукт сушили при 100 °C 1 ч для получения порошка наноматериала цеолит-железо. Поверхность характеризовали FETEM, FESEM и EDX.

Аминовная модификация цеолит-железа и функционализация поверхности емкостного электрода

Амин покрывали на поверхности цеолит-железа силилановым связующим APTMS. 1 г цеолит-железа смешали с 1% KOH 10 мин, излишки KOH удалили водой. Затем KOH-обработанный цеолит-железо смешали с 1% APTMS и мешали на нагревательной мешалке overnight. Наноматериал вымывали этанолом, отделяли центрифугированием (10000×g, 10 мин). APTMS-цеолит-железо наносили на гидроксилированный электрод и выдерживали при комнатной температуре 3 ч. Связывание происходит черезсилилановое сцепление с оксидными группами, образуя множественные связи и пространственную структуру на сенсирующей поверхности. После промывки этанолом и водой проводили иммобилизацию анти-IL-3 антител для взаимодействия с IL-3.

Определение IL-3 на поверхности анти-IL-3 модифицированного емкостного электрода

IL-3 определяли на поверхности анти-IL-3 модифицированного емкостного электрода. 100 пг/мл IL-3 разводили в буфере PBS и капали на антител-модифицированную поверхность. После иммобилизации антител свободная поверхность блокировали PEG-COOH (1 мг/мл). Реакция аналогична антител-APTMS. Емкость измеряли до и после взаимодействия с IL-3. Разница считалась связыванием IL-3 с антителом. Для расчета предела детектирования IL-3 титровали от 3 до 50 пг/мл, капали независимо на антител-модифицированные поверхности. Разницу емкости для каждой концентрации рассчитывали и строили для определения детекции IL-3 по R². Прикрепление IL-3 к антител-модифицированной поверхности дает истинное взаимодействие.

Биофулинг и селективное определение IL-3 на цеолит-железо модифицированном емкостном электроде

Эксперимент по биофулингу проводили в трех условиях: (1) вместо анти-IL-3 антитела — неиммунное антитело; (2) вместо IL-3 — контрольный белок; (3) без анти-IL-3 антитела. Емкость сравнивали для специфического взаимодействия анти-IL-3 с IL-3. Селективный эксперимент: IL-3 вносили в 1:100 разбавленную человеческую сыворотку и капали на анти-IL-3 модифицированный электрод. Изменения емкости регистрировали для каждой концентрации IL-3. Воспроизводимость подтверждали тройным повторением на аналогичных приборах из одной партии. Оценивали срок хранения и стабильность пробо-модифицированной поверхности.

Результаты и обсуждение

Сепсис сопровождается массовым выбросом химикатов иммунной системой, вызывающим общее воспаление и повреждение органов. Рис. 1a — схема идентификации IL-3 на анти-IL-3 модифицированной емкостной сенсирующей поверхности. APTMS-модифицированный цеолит-железо использовали для присоединения захватного антитела к сенсирующему электоду. APTMS на наноматериале иммобилизован на электоде через взаимодействие аминов на наноматериале и OH-групп на электоде. Антитело связывалось через COOH и амин цеолит-железа. Цеолит-железо способствует присоединению большего числа APTMS на сенсирующем электроде, что позволяет захватывать больше антител. Различные исследования показывают, что иммобилизация захватной пробы на сенсирующей поверхности играет ключевую роль в снижении предела детектирования. В данном исследовании наноматериал цеолит-железо использовали для присоединения анти-IL-3 антитела к сенсирующему электоду. Более высокая иммобилизация анти-IL-3 с правильной ориентацией помогает достичь более низких пределов детектирования IL-3.

Рис. 1b подтверждает целостность поверхности электрода на емкостном сенсоре (высокое разрешение). Рис. 1c — морфологический анализ цеолит-железа FESEM: наноматериалы сформированы с равномерным распределением и в продольном измерении. Рис. 1d — EDX анализ: обнаружены основные элементы Si, Al, Fe, O.

Морфологический анализ наноматериала цеолит-железо FESEM и FETEM

Рис. 1c, d (вставка) — морфологические изображения цеолит-железа FESEM при разных увеличениях и EDX анализ. Полученный наноматериал гладкий, равномерно распределенный, с плотно упакованной продольной наноструктурой. Размер ~30 нм, нанокомпозит расположен с равномерными формами на должном расстоянии. FETEM изображения (рис. 2a, b) подтверждают похожую форму. EDX (рис. 2c, d) подтверждает наличие Fe, Al, Si, O. Основные атомные проценты: Si 3,46%, Al 0,78%, Fe 2,13%, O 24,39%. FESEM и EDX подтверждают формирование наноматериалов цеолит-железо.

Подготовка сенсирующего электрода для определения IL-3

Иммобилизация анти-IL-3 антител на емкостном биосенсоре подтверждалась изменением емкости после каждой стадии иммобилизации. Рис. 3a: KOH-привязанная поверхность электрода показывает емкость 1,74×10⁹ нФ, после капельного добавления APTMS-цеолит-железа — 2,02×10⁹ нФ (подтверждает присоединение наноматериалов). После добавления анти-IL-3 антитела емкость резко возрастает до 3,42×10⁹ нФ из-за большего количества иммобилизованных антител на APTMS-модифицированном цеолит-железе. Наноматериалы показывают правильную упаковку с большим числом APTMS на поверхности, привлекая больше антител. Наконец, добавляли PEG-COOH для блокировки, емкость увеличивалась до 3,64×10⁹ нФ. Сенсор работает за счет изменений поверхностного заряда и емкости. Каждая молекула несет разные заряды и влияет на емкость. Разницу в емкости учитывали для измерений. Более высокие изменения емкости отмечались из-за более высокой загрузки антител IL-3 (рис. 3b). PEG-COOH снижает неспецифическое связывание IL-3 и устраняет ложноположительные результаты. Доказано, что PEG-полимеры на сенсирующих поверхностях улучшают биосовместимость, снижают отношение сигнал/шум и обеспечивают правильную ориентацию иммобилизованных биомолекул, снижая предел детектирования. Поскольку APTMS поверхность электростатически привлекает другие биомолекулы, PEG-COOH использовали для покрытия излишков APTMS на наноматериале цеолит-железо, уменьшая биофулинг. Эта анти-IL-3 модифицированная поверхность использовали для идентификации IL-3.

Определение и квантификация IL-3 на поверхности анти-IL-3 антител

IL-3 квантифицировали на анти-IL-3 модифицированной емкостной сенсирующей поверхности. Изначально тестировали высокую концентрацию IL-3 (100 пг/мл): емкость выросла с 3,74×10¹⁰ нФ до 13×10¹⁰ нФ, подтверждая взаимодействие IL-3 с анти-IL-3 (рис. 4a). Проводили титрование IL-3 3–50 пг/мл (рис. 4b): емкость увеличивалась до 4,56×10¹⁰, 5,84×10¹⁰, 6,64×10¹⁰, 8,39×10¹⁰, 12×10¹⁰ нФ. С ростом концентрации IL-3 емкость постепенно возрастала (рис. 5a). Разницу емкости рассчитывали и строили в Excel, предел детектирования IL-3 составил 3 пг/мл при R²=0,9673 (рис. 5b). Найдена линейная дозозависимая зависимость в диапазоне 3–100 пг/мл. При дальнейшем титровании образцы насыщались.

Биофулинг/антифулинг на APTES-цеолит-железо модифицированном емкостном электроде

Биофулинг — главная проблема биосенсоров, приводящая к ложноположительным результатам. Блокирующие агенты (BSA, этаноламин, PEG-полимеры) уменьшают биофулинг. Здесь использовали PEG-COOH. Биофулинг проверяли тремя контрольными экспериментами: без анти-IL-3 антитела, с неиммунным антителом, с контрольным белком (IL-8). Рис. 6a: все три контрольных эксперимента не дали увеличения емкости, подтверждая специфическое обнаружение IL-3 без биофулинга.

Внесение IL-3 в человеческую сыворотку и стабильность

Разные концентрации IL-3 внедряли в человеческую сыворотку и проводили ту же процедуру для идентификации IL-3 в реальных условиях. Рис. 6b: внедренный IL-3 в сыворотке явно давал увеличение емкости с ростом концентрации, подтверждая селективную идентификацию IL-3 анти-IL-3 модифицированным емкостным электродом.

Воспроизводимость: сенсирующая поверхность ведет себя хорошо, с минимальными ошибками. Эксплуатационный срок сенсирующей поверхности с наноматериалом может быть продлен до 3 месяцев при хранении в десикаторе. После присоединения пробы поверхность стабильна 2 недели, теряя 19% стабильности, потеря становится крутой с 3-й недели. Сравнение с доступными сенсорами показывает сопоставимость и превосходство в ряде случаев (таблица 1).

Заключение

Сепсис угрожает жизни, вызывает чрезмерную иммунную реакцию, опасен и затрагивает весь организм. В работе продемонстрирована идентификация биомаркера сепсиса (IL-3) на емкостном электроде. Наноматериал цеолит-железо извлечен из угольного зольного пепла и использован для модификации емкостного электрода для увеличения тока при связывании биомолекул. Аминовую модификацию проводили для присоединения анти-IL-3 антитела к цеолит-железу. Детекция IL-3 на антител-модифицированном электроде достигла предела 3 пг/мл. Контрольные эксперименты не показали увеличения емкости, подтверждая специфическое обнаружение IL-3, селективные эксперименты с внедренным IL-3 в человеческой сыворотке демонстрировали явный рост емкости. Данный экспериментальный метод квантифицирует уровень IL-3 и помогает диагностировать сепсис.