Новое иммуно-флюоресцентное обнаружение фрагмента опухолевого маркера цитокератина-19 (CYFRA 21-1) с помощью углеродных квантовых точек / нанокомпозита оксида цинка

Введение

Рак легкого - это самый распространенный и агрессивный тип рака, требующий серьезного лечения. Рецидив опухоли и метастазирование считаются основными ведущими причинами смерти пациентов с раком легкого [1]. Фрагмент опухолевого маркера цитокератина 19 (CYFRA 21-1) представляет собой фрагмент, который существует во многих нормальных, а также злокачественных эпителиальных клетках [2]. Его можно оценить с помощью сэндвич-иммунорадиометрического анализа. Ранние исследования выяснили, что на злокачественных стадиях рака легких CYFRA 21-1 попадает в кровоток пациентов и повышается в их сыворотке [3]. Следовательно, можно улучшить выживаемость пациентов с раком легких за счет раннего выявления и, как следствие, быстрой хирургической реакции [4].

Ранее сообщалось о нескольких методах обнаружения CYFRA 21-1, включая иммуноферментный анализ [5], электрохемилюминесцентный иммуноанализ [6] и иммунорадиометрический анализ [7] . Выгодная стратегия усиления и улучшения чувствительности CYFRA 21-1 в сыворотке крови человека по-прежнему вызывает озабоченность.

В последние годы значительный прогресс и взрывной рост нанотехнологий достигнут почти во всех сферах жизни [8]. Среди этих областей - системы доставки лекарств [9], фармацевтический анализ [10], реакции каталитической активности [11], применение в медицине [12], маркеры рака [13] и визуализация тканей [14].

В настоящее время методы зондирования на основе флуоресценции (FL) привлекают многих исследователей из-за их простой конструкции и превосходной чувствительности. Для биологического мониторинга были разработаны и синтезированы различные сенсорные материалы FL. Системы FL для биологического определения обладают высокой люминесцентностью, вододиспергируемостью, химически стабильными и нетоксичными [15]. Существуют различные иммуноочувствительные флуоресцентные зонды для обнаружения биомаркеров. Гетерогенный конкурентный анализ проводят путем иммобилизации захватывающих молекул на поверхности и затем инкубируют с биомаркерами, конъюгированными с флуорофором. Конкуренция между свободными и конъюгированными биомаркерами за связывание с захватывающими молекулами снижает интенсивность флуоресценции с увеличением концентрации биомаркера [16]. Гетерогенный сэндвич-анализ основан на инкубации молекул захвата и интересующего раствора, образующего комплекс с биомаркерами. Следовательно, интенсивность флуоресценции увеличивается с концентрацией биомаркера [17].

В гомогенном конкурентном анализе две разные молекулы захвата, конъюгированные с флуорофором A, конъюгированы с биомаркерами, конъюгированными с флуорофором B, и раствор, увеличивающий флуоресценцию с концентрациями биомаркеров [18]. Однако у этих методов были определенные недостатки, в том числе длительное экспериментальное время, отсутствие мультиплексного обнаружения, сложность, а иногда и относительно ложные результаты. Развитие нанотехнологий позволило исследователям разработать новые флуоресцентные иммуночувствительные зонды с уникальными оптическими характеристиками [19]. С момента первого использования квантовых точек в обнаружении биомолекул они приобрели большой интерес, поскольку их оптические характеристики обеспечивают высокую гибкость в выборе подходящей длины волны, отличные метки для мультиплексного обнаружения, биосовместимость и способность нацеливания [20]. P>

Квантовые точки углерода (ККТ) продемонстрировали превосходные химические, физические, оптические, магнитные и электрические свойства. CQD могут быть синтезированы с использованием различных методов, включая гидротермальные, электроокисление, лазерную абляцию и микроволновые методы [21,22,23,24]. Из-за их низкой токсичности научные исследователи рассматривали CQD в качестве сильных кандидатов во многих флуоресцентных датчиках. Кроме того, они обладают сильной способностью манипулировать посредством различных контролируемых химических реакций в различных областях, таких как биохимические, фотохимические, биосенсорные, биоимиджинг и системы доставки лекарств [25,26,27], а также в обнаружении иммуноанализа [28]. Более ранние исследования синтеза CQD выявили определенные недостатки при использовании дорогих источников углерода, токсичных химикатов и реагентов или при использовании неселективных процессов [29]. Чтобы ограничить эти недостатки, исследователи начали использовать фруктовые соки как новый и дешевый источник углерода [30]. Поскольку использование фруктовых соков не обеспечивает оптимальной цели использования ресурсов, флуоресцентные CQD недавно были получены из кожуры фруктов [31]. Использование кожуры фруктов является многообещающим путем экологически чистого синтеза ХКД.

Оксид цинка (ZnO) - один из наиболее важных, потенциально активных, стабильных и малотоксичных оксидов металлов, который широко используется в ультрафиолетовых лазерных устройствах, биомедицине, различных типах сенсоров и фотокатализе [32,33,34,35]. Наночастицы ZnO (ZnONP) проявляли фотолюминесцентные свойства в УФ и видимой областях спектра. Это может быть связано с экситонной эмиссией, которая основана на прямой рекомбинации электронно-дырочных пар [36], или с зелено-желтой эмиссией на длине волны 520 нм в результате электронного перехода с края зоны проводимости на уровень ловушки. [37].

Как правило, углеродные точки представляют собой аморфные или нанокристаллические квазисферические наночастицы, содержащие sp ² и sp ³ углерод, группы на основе O / N и постмодифицированные химические группы. Кроме того, ККТ обладают способностью возбуждать с помощью более высоких длин волн и могут изменять эффективность комбинированных поверхностей электронно-дырочных пар и воздействовать на тушение в анализируемых системах, что может облегчить количественное определение биомолекул [38]. Их можно декорировать оксидами металлов, такими как TiO ₂ . и ZnO для образования оптически активного нанокомпозита, который можно использовать для обнаружения биомаркеров в сыворотке крови человека. ZnO представляет собой материал с широкой запрещенной зоной (3,37 эВ), который может люминесцировать в УФ и синей областях видимого света из-за наличия большой плотности дефектных уровней в запрещенной зоне [39]. Образование нанокомпозита CQD / ZnO увеличивает поглощение видимого света из-за гибридизации ZnO с CQD, а синий сдвиг поглощения люминесценции до 520 нм можно объяснить излучательной рекомбинацией ионизированных вакансий O. Помимо увеличения поглощения видимого света, лучшее разделение электронов и дырок и сокращение времени межфазного переноса электронов можно рассматривать для более высоких оптических характеристик гибридизированных ККТ с наночастицами ZnO [40]. Кроме того, значимое увеличение количества радикалов –OH *, генерируемых из нанокомпозита CQD / ZnO на границе раздела с водой, может вызвать значительное усиление сигналов флуоресценции анализирующей системы. Таким образом, комбинированный нанокомпозит CQD / ZnO усиливает модификацию оптоэлектронных и фотолюминесцентных свойств поверхности ZnO и создает сильный поверхностный дефект с настраиваемой фотолюминесценцией [41]. Более того, CQD, иммобилизованные с помощью биорезонансных антител, образующих систему FL-зондирования антитело-антиген-антитело, обеспечивают жизнеспособный зонд с высокой специфичностью и чувствительностью к целевому аналиту [42].

В предлагаемом исследовании была предложена новая простая и сверхчувствительная система иммуноанализа для определения флуоресценции на основе CQD, украшенных нанокомпозитом ZnO, для определения опухолевого маркера CYFRA 21-1 в сыворотке крови человека. Цитрусовый околоплодник лимона использовали в качестве предшественника углерода для получения CQD в гидротермальных условиях. Более того, он был использован в качестве восстанавливающего и стабилизирующего агента для синтеза нанокомпозита ZnO, сопряженного с CQD. Приготовленный нанокомпозит CQD / ZnO был иммобилизован неконъюгированным моноклональным антителом (mAb) BM 19.21, а лунки для микротитрования были покрыты другим моноклональным антителом KS 19.1 для образования иммуночувствительной системы сэндвич-кэпа.

Методы

Инструменты

Спектрофотометрические спектры как CQD, так и нанокомпозита CQD / ZnO регистрировали с использованием спектрофотометра Ultrospec 2100-Biochrom (Biochrom Ltd., Cambium, Кембридж, Великобритания). Морфология поверхности и гранулометрический состав зеленых синтезированных ККТ и нанокомпозита CQDS / Zn были оценены с использованием просвечивающего электронного микроскопа (ТЕМ), модельного прибора JEOL 1200EX (JEOL Ltd., Фрайзинг, Германия) и сканирующего электронного микроскопа (SEM), модель JSM-7610F. (JEOL, США). Спектры флуоресценции и инфракрасного излучения с преобразованием Фурье (FT-IR) предложенной иммуноочувствительной системы проверяли с использованием многорежимного ридера Biotek Synergy H1 (Biotek, Токио, Япония) и спектрофотометра Perkin Elmer FT-IR (PerkinElmer Ltd., Йокогама, Япония). , соответственно. Рамановские спектры, рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия (XPS) и картина дифракции рентгеновских лучей на порошке (XRD) были измерены с использованием микро-рамановского спектрометра (CRAIC Technologies, Калифорния, США), системы рентгеновской спектроскопии Kratos Axis Ultra (Kratos Analytical Ltd. , Манчестер, Великобритания) и дифрактометр Siemens D-5000 (Сименс, Эрфурт, Германия) соответственно.

Химические вещества и реагенты

Прибор SG-2000-10090 (Barsbuttel, Германия) использовался для сбора деионизированной воды, используемой во всех экспериментах. CYFRA 21-1-неконъюгированные моноклональные антитела (mAb) BM 19.21 и KS 19.1 для формирования иммуносенсорной системы сэндвич-кэппинга были получены от Abcam (Кембридж, Великобритания). Цитрусовый лимон фрукты поставлялись с местных рынков. Солевой раствор с фосфатным буфером (PBS) с pH =7,4 готовили с использованием хлорида натрия, хлорида калия, гидроксида натрия, монокалиевого фосфата и динатрийфосфата (BHD Ltd. Co. Poole, UK). Randox Laboratories (Северная Ирландия-Великобритания) любезно предоставила коммерческие нормальные сыворотки. Случайные образцы крови были собраны у здоровых добровольцев, и перед началом этого исследования было получено информированное согласие. Кроме того, Sigma-Aldrich (Гамбург, Германия) поставила чистый сорт как гидрохлорида карбодиимида (EDC), так и N-гидроксисукцинимида (NHS). Комитет по этике исследований Университета Короля Сауда, КСА (KSU-REC-002-E, 2019) одобрил исследование.

Зеленая гидротермальная подготовка углеродных квантовых точек (ККТ)

Цитрусовый лимон перикарпий был использован для синтеза ККТ в гидротермальных условиях. Примерно 20 г Цитрусово-лимона околоплодник и 200 мл деионизированной воды переносили в круглую колбу и кипятили с обратным холодильником при 100 ° C при непрерывном перемешивании на магнитной мешалке в течение 6 часов. После охлаждения до комнатной температуры полученный экстракт центрифугировали при 3500 об / мин и 20 мл верхнего экстрагированного раствора автоклавировали и нагревали в гидротермальных условиях в интервале температур от 100 до 200 ° C в течение различных интервалов от 6 до 120 часов. После охлаждения до комнатной температуры верхний щелок представляет собой УКТ (Схема 1).

Зеленый синтез CQD с использованием Цитрусовый лимон околоплодник к флуоресцентному раствору CQD и углеродным сферам

Приготовление нанокомпозита из углеродных квантовых точек и оксида цинка

Чтобы приготовить нанокомпозит CQD / ZnO, была проведена простая химическая реакция восстановления с использованием CQD в качестве восстанавливающего и стабилизирующего агента. Нанокомпозит CQD / ZnO получали добавлением 20 мл CQD к 50 мл 5,0 × 10 ^-2 моль л ⁻¹ ацетата цинка при 60 ° C и непрерывном перемешивании в течение 10 мин. Когда цвет смеси изменился с желтоватого на кремовый, смесь оставляли на 30 минут для завершения процесса восстановления и хранили при 4 ° C. Чтобы гарантировать стабильность и проверить агломерацию приготовленного нанокомпозита CQD / ZnO, использовали спектрометрию в УФ-видимом диапазоне для регистрации оптической плотности в течение 20 дней при длине волны 390 нм. Полученные результаты показали высокую стабильность и отсутствие значительного изменения оптической плотности нанокомпозита CQD / ZnO.

Характеристика нанокомпозита из углеродных квантовых точек и оксида цинка

Для обеспечения формирования нанокомпозита CQD / ZnO использовались различные микроскопические и спектроскопические методы. Однородность и морфология поверхности УКТ и нанокомпозита УКТ / ZnO были изучены с использованием просвечивающего электронного микроскопа высокого разрешения (HRTEM) и SEM. Оптические спектры изучались с помощью УФ-видимой, ИК-Фурье спектроскопии, РФЭС и рамановской спектроскопии. Кристаллическая структура полученных ККТ была оценена с помощью рентгенограммы.

Процесс иммобилизации

Неконъюгированное моноклональное антитело BM 19.21 иммобилизовали на поверхности синтезированного нанокомпозита CQD / ZnO простой пептидной амидной связью между амином и активными карбоксильными группами. Процесс иммобилизации проводили, добавляя по 5,0 мл каждого эквимолярного количества 3,0 × 10 ^-3 моль л ⁻¹ NHS и EDC до 5,0 мл раствора нанокомпозита CQD / ZnO при непрерывном перемешивании в течение 1 часа. Приблизительно 5 мг неконъюгированного моноклонального антитела BM 19.21 растворяли в 1,0 мл 0,01 моль л ^-1 . фосфатно-солевой буфер (pH =7,4) и добавлен к вышеупомянутому чувствительному раствору. Неконъюгированное моноклональное антитело BM 19.21 иммобилизовали на поверхности раствора нанокомпозита CQDs / ZnO после инкубации при 37 ° C в течение 12 ч (схема 2). Спектрофотометрия использовалась для подтверждения успеха процесса иммобилизации.

Иммобилизация моноклонального антитела BM 19.21 на поверхности нанокомпозита CQD / ZnO

Общий принцип метода иммуноанализа

Сэндвич-реакцию антитело-антиген-антитело получали с использованием другого моноклонального антитела KS 19.1, покрывающего поверхность лунок для микротитрования (схема 3). В оптимальных условиях иммуноанализа определяли концентрацию антигена CYFRA 21-1 как функцию увеличения интенсивности сигнала флуоресценции.

Иллюстрированная схема представляет собой сэндвич-реакцию иммуноочувствительной реакции антитело-антиген-антитело

Процедура иммунного контроля

Сбор образцов сыворотки крови человека был предоставлен случайными добровольцами. Перед центрифугированием при комнатной температуре и хранении при 4 ° C обеспечивали полное свертывание. Методика добавок была использована для приготовления стандартных образцов, содержащих антиген CYFRA 21-1 в диапазоне концентраций 0,01–500 нг / мл ^-1 . . Приблизительно 50 мкл образцов с добавлением добавляли в лунки для микротитрования и смешивали с 50 мкл свежеразведенного моноклонального антитела KS 19.1 с использованием фосфатно-солевого буфера с pH =7,4 в течение 30 минут, а затем инкубировали, не закрывая планшет, в течение 1 часа при 37 ° C. Содержимое лунок быстро встряхивали, и лунки трижды промывали деионизированной водой (300 мкл) для каждой лунки. Приблизительно 50 мкл раствора иммобилизованного нанокомпозита CQD / ZnO-BM 19.21 добавляли в каждую лунку, осторожно перемешивали и инкубировали в течение 30 минут при 37 ° C. Подготовленные образцы были подвергнуты флуоресцентному анализу с использованием микротитровального ридера для регистрации интенсивности.

Результаты и обсуждение

Морфологическая оценка углеродных квантовых точек и их нанокомпозита

Просвечивающий электронный микроскоп (ПЭМ) использовался для характеристики морфологии поверхности и распределения ККТ в образцах. Для проведения исследования в ПЭМ примерно 4 мкл приготовленной суспензии ККТ было нанесено на поверхность углеродной сетки ПЭМ. На изображении HRTEM (рис. 1а) наблюдаемые однородные черные пятна с шагом решетки (0,36 нм) указывают на образование ККТ. Был построен график распределения частиц по размерам, и средний размер частиц находился в диапазоне от 1,5 ± 0,5 до 5,0 ± 0,5 нм (фиг. 1b). Полученный размер частиц доказал, что сформированные ККТ действительно являются квантово-размерными наноматериалами. Кроме того, было проведено динамическое рассеяние света (ДРС), и средний размер частиц составил ~ 20 ± 0,2 нм. Наблюдалась разница между двумя предыдущими измерениями. Предыдущие исследования показали, что ПЭМВР не показывает структуру кристаллической решетки образованных ККТ при больших увеличениях из-за их аморфной природы [43]. Аналогичным образом, в этом исследовании естественным предшественником углерода является Цитрусовый лимон . перикарпий и производные ККТ также обладают аморфной природой. Таким образом, различие в измерениях размера частиц может быть связано с агломерацией образованных ККТ, аморфной природой образовавшихся углеродных точек, механизмом, задействованным в каждом эксперименте, и динамикой гидратации частиц.

а Изображение ККТ диаметром 5 нм и b с помощью просвечивающего электронного микроскопа высокого разрешения (HRTEM) график распределения размеров CQD на основе TEM

Полученный нанокомпозит CQD / ZnO исследовали с помощью ПЭМ и СЭМ. На изображении ПЭМ (рис. 2а) присутствие гексагональных частиц, прикрепленных к ККТ, указывает на образование нанокомпозита ККТ / ZnO. В SEM образец нанокомпозита был покрыт золотом для предотвращения поглощения электронов образцом и накопления заряда. Приложенное ускоренное напряжение составляло 15 кВ при увеличении × 30 000 (рис. 2b).

а и b представляют изображения CQD / ZnO нанокомпозита с помощью просвечивающего электронного микроскопа и сканирующего электронного микроскопа

Были изучены УФ-видимые спектры и спектры флуоресценции CQD, и зарегистрированные спектры показали два значимых пика при 224 и 280 нм, которые можно отнести к p ~ p * и н ~ P * переход C =C и C =O соответственно. Кроме того, спектр флуоресценции CQD показывает два сигнала с максимальным λ _ex =360 и λ _em =453 нм (рис. 3а, б). Кроме того, был изучен УФ-видимый спектр нанокомпозита CQD / ZnO. Значительный пик поглощения наблюдался при 370 нм с сине-зеленым сдвигом (рис. 4а). Исследованы фотолюминесцентные (ФЛ) свойства нанокомпозита CQD / ZnO. Размер и поверхностные дефекты УКТ сильно влияют на их люминесцентные свойства. В зависимости от длины волны возбуждения излучение (PL) ККТ варьировалось [38]. Кроме того, наноразмерные частицы ZnO демонстрировали связанное с дефектами излучение в видимой области поглощения от синего до зеленого [41]. Таким образом, ZnONP, декорированные CQD, являются отличным нанокомпозитом для излучения ФЛ. Как показано на фиг. 4b, спектр ФЛ CQD / ZnO демонстрирует синий сдвиг со значительным пиком при 520 нм после длины волны возбуждения 470 нм. Наблюдаемый сдвиг можно объяснить перекрытием энергетических зон ККТ и ZnONP. Отображаемый синий сдвиг соответствует уровню излучения дефекта 2,1 эВ.

Спектроскопические спектры ККТ ( a ) УФ-видимый спектр при 224 и 280 нм и ( b ) спектр флуоресценции ХКТ при λ _ex =360 и λ _em =452 нм

Спектроскопические спектры ККТ / ZnONP a УФ-видимый спектр в пике поглощения при 370 нм и b спектр фотолюминесценции УКТ / ZnONP при λ _ex =470 и λ _em =520 нм

Для подтверждения образования нанокомпозита CQD / ZnO и иммобилизованного нанокомпозита CQD / ZnO с неконъюгированным моноклональным антителом BM 19.21 было проведено сравнительное исследование FT-IR. Записанный ИК-Фурье спектр ККТ выявил присутствие различных отдельных пиков, соответствующих определенным функциональным группам, включая пики валентных колебаний при 3462 см ^-1 и 2932 см ⁻¹ для групп C – OH и C – H соответственно. Кроме того, при 1749 см ⁻¹ наблюдались три полосы поглощения колебаний. , 1375 см ⁻¹ , и 1246 см ⁻¹ что соответствует наличию функциональных групп C =O, C – N и C – O – C соответственно (рис. 5а). Новый пик на 436 см ⁻¹ соответствующая полосе валентных колебаний Zn – O. Восстанавливающие и стабилизирующие свойства ККТ достигаются за счет присутствия на их поверхности групп –OH и COOH. Эти функциональные группы действуют как доноры электронов и обладают сильным сродством к образованию нанокомпозита CQD / ZnO. Таким образом, CQD восстанавливают и стабилизируют сформированный нанокомпозит (рис. 5b). Как показано на рис. 5c, было замечено, что два новых пика образовались при 3254 см ⁻¹ . и 1675 см ⁻¹ . Эти пики были приписаны валентным колебаниям N – H и C =O соответственно и подтверждали иммобилизацию CQD / ZnO-BM 19.21 через пептидные связи.

ИК-Фурье спектры a CQD, b Нанокомпозит CQD / ZnO и c иммобилизованные CQD / нанокомпозит ZnO-BM 19.21

Были исследованы спектры рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (XPS) зеленых синтезированных ККТ. Полученный спектр ККТ (рис. 6а) показал различные функциональные группы при 288 и 286 эВ для C =O и COOH соответственно. Кроме того, для Zn 2p _1/2 наблюдались два значительных пика энергии связи при 1044,4 и 1021,5 эВ. и Zn 2p _3/2 соответственно (рис. 6б). Более того, спектр XPS высокого разрешения нанокомпозита CQD / ZnO подтвердил наличие различных пиков энергии связи при 560, 385, 350, 246 и 200 эВ для O 1s, C 1s, Zn 3s, Zn 3p и Zn 3d, соответственно (рис. 6в). Все ранее упомянутые данные подтверждают присутствие ZnO на поверхности УКТ, образующих нанокомпозит УКТ / ZnO.

Спектры рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (XPS) a CQD, b ZnO и c Нанокомпозит CQD / ZnO

Было проведено сравнительное исследование рентгенограмм CQD и нанокомпозита CQD / ZnO. На рентгенограмме ККТ был замечен широкий пик при 20 ° (2Ɵ) для углеродных точек (рис. 7a). Однако различные острые пики были обнаружены при 27 °, 32 °, 34 °, 45 °, 57 °, 64 °, 67 °, 70 °, 73 °, 78 ° и 80 ° (2 °) для Zn (100), (002), (101), (102), (110), (103), (200), (112), (201), (004) и (202) соответственно. Наблюдаемые пики отражают распределение ZnO на поверхности УКТ, образующих нанокомпозит УКТ / ZnO (рис. 7b).

Рентгенограмма a CQD и b Нанокомпозит CQD / ZnO

Исследованы спектры комбинационного рассеяния полученных ККТ, ККТ / ZnO и иммобилизованных ККТ / нанокомпозита ZnO-BM 19.21. Рамановские сигналы обычно используются для исследования кристаллической структуры и ее дефектов. На рисунке 8а показаны две типичные полосы D и G при 1300 и 1520 см ^-1 . для углеродных наночастиц соответственно. Как сообщалось ранее, полоса D обычно представляет собой sp ³ дефекты, а G-полоса - это особенность плоской вибрации sp ² -связанные угли [44]. Я _Д / Я _G Соотношение было рассчитано для приготовленных ККТ, и оно составило 1,02 ± 0,03. Новые резкие пики наблюдались при 440 и 520 см ^-1 . для наночастиц ZnO и типичные пики ККТ наблюдались при 1364 и 1595 см ^-1 . Соотношение I _Д / Я _G оказалось, что оно составляет 1,2 ± 0,01, что указывает на образование нанокомпозита CQD / ZnO (рис. 8b). Рамановский спектр иммобилизованного нанокомпозита CQD / ZnO-BM 19.21 показал многочисленные пики, которые можно легко распознать как подтверждающие признаки вторичных и третичных структур. Пики, наблюдаемые в области 1007–1128 см ⁻¹ были заданы для представления основной вторичной структуры моноклонального антитела. Рамановские пики находятся в области 550–682 см ⁻¹ . области были отнесены к дисульфидным конформациям, в то время как область 867–797 см ⁻¹ единицы были назначены для представления состояния водородных связей остатков тирозина. Кроме того, значительный сдвиг пика рамановского спектра до 1630 см ^-1 можно объяснить наличием третичной структуры иммобилизованного антитела [45] (рис. 8в). Соотношение I _Д / Я _G был увеличен до 1,4 ± 0,04, показывая лучшую кристаллическую структуру из-за образования иммобилизованного CQD / нанокомпозита ZnO-BM 19.21.

Сдвиг спектров комбинационного рассеяния a CQD, b Нанокомпозит CQD / ZnO и c иммобилизованные CQD / нанокомпозит ZnO-BM 19.21

Оптимизация условий иммуночувствительности к флуоресценции

Выбор и оптимизация предложенных условий иммуночувствительности к флуоресценции проводились путем изучения различных параметров. Как правило, необходимо исследовать и оптимизировать количество иммобилизованного нанокомпозита, pH и концентрацию используемого буфера, время инкубации между целевым аналитом в образцах сыворотки и реагентами для иммуночувствительности. Чтобы выбрать подходящее количество иммобилизованных CQD / нанокомпозита ZnO-BM 19.21, были протестированы различные количества в диапазоне 10–100 мкл. Максимальную интенсивность флуоресценции наблюдали при добавлении 50 мкл иммобилизованного нанокомпозита CQD / ZnO-BM 19.21 (рис. 9а). Были приготовлены четыре забуференных фосфатом физиологических раствора со значениями pH 7,2–7,5, которые были протестированы в зависимости от интенсивности флуоресценции. Небольшое изменение интенсивности сигнала флуоресценции наблюдалось при изменении значений pH. При pH 7,2 и 7,3 сигнал флуоресценции снижался из-за химической нестабильности иммобилизованного нанокомпозита CQD / ZnO. Сигнал флуоресценции увеличивался при pH от 7,4 до 7,5 из-за превосходного взаимодействия между моноклональными молекулами на поверхности нанокомпозита (рис. 9b). Было обнаружено, что 7,4 является наиболее подходящим значением pH для поддержания активности антигена-мишени, который может разлагаться при повышении pH более чем на 7,5. Поэтому для дальнейших исследований был выбран pH 7,4.

Оптимизация определения флуоресценции антигена CYFRA 21-1 при λ _ex =470 и λ _em =520 нм. а Влияние добавленных иммобилизованных ХКТ / нанокомпозита ZnO-BM 19.21, b действие фосфатно-солевого буферного раствора с диапазоном pH 7,3–7,5, c effect of buffer concentration using PBS in the concentration range of 0.01–0.05 mol L ⁻¹ , и d effect of immunoreaction time using 10–60 min

The influence of phosphate-buffered saline concentration on the fluorescence intensity was estimated using a concentration range of 0.01–0.05 mol L ⁻¹ . The maximum fluorescence intensity signal was obtained using the buffer concentration of 0.01 mol L ⁻¹ . At higher buffer concentrations, the immobilized CQDs/ZnO-BM 19.21 nanocomposite was aggregated, and the instability of the immunosensing solution may cause a decrease in fluorescence intensity (Fig. 9c). To calculate the immunoreaction time, the analytical procedure was repeated using reaction time ranging from 10 to 60 min. The maximum fluorescence intensity signal was observed by maintaining the reaction between the tested antigen and the immunosensing solution for at least 30 min (Fig. 9d).

Analytical Quantification

Under optimized conditions, the suggested immunoassay method was performed using 12 serum samples containing CYFRA 21-1 antigen in concentration range of 0.01–500 ng mL ¹ . The outcome results were plotted to construct the calibration graph which was linear over a concentration range of 0.01–100 ng mL ⁻¹ with a detection limit of 0.008 ng mL ⁻¹ . The calculated equation was found to be I _F  = 7.933C + 181.24 (r ²  = 0.9992). After six repetitions, the percentage of the relative standard deviation (%RSD) was 1.3%. The acceptable results revealed a high sensitivity of the immunosensing fluorescence method for the quantification of CYFRA 21-1 antigen in serum samples.

System Suitability

System suitability was investigated by carrying out a comparative study between the suggested immobilized CQDs/ZnO-BM 19.21 immunosensing method and the previously addressed methods. The suggested fluorescence system provided significant advantages such as simplicity, eco-friendly, and easy to detect the target analyte in serum samples. The recorded results revealed high sensitivity with a wide linear detection range of 0.01–100 ng mL ¹ and lower detection limit of 0.008 ng mL ¹ (Table 1).

Accuracy, Precision, and Selectivity of the Immobilized Immunosensing System

To ensure the accuracy of the suggested immobilized CQDs/ZnO-BM 19.21 fluorescence immunosensing system for the determination of CYFRA 21-1 antigen in serum samples, 12 serum samples were tested. The outcome data were compared with another previously reported technique [6], which was based on electrochemiluminescence assay using tris 2,2′-bipyridyl ruthenium (II) complex to be excited by tripropylamine. Acceptable results were obtained as indicated in Table 2. Intra-day and inter-day assay were used to investigate the precision of the suggested method. The test was carried out using a serum sample containing 10 ng mL ^− 1 of CYFRA 21-1 antigen. The mean relative standard deviations were 1.1% and 1.3% for both intra- and inter-day assay, respectively, which revealed high precision. Furthermore, the selectivity of the suggested method towards the determination of CYFRA 21-1 antigen was evaluated using some possible interfering species such as amino acids (cysteine, lysine, serine, tyrosine, and glycine), some cations (K ⁺ , Na ⁺ , Ca ²⁺ , Mg ²⁺ , and Zn ²⁺ ) and some other bio-markers such as CA 15-3, CA 27-29, CA 19-9, and CA 125. The test was carried out under optimum conditions using human serum containing 10 ng mL ⁻¹ CYFRA 21-1 antigen in the presence of 10 ng mL ⁻¹ coexisting species. The outcome data were calculated as relative percentage error (Er%) and the corresponding result did not exceed ± 5% for each interfering species (Table 3). The calculated tolerance values (F-F ⁰ /F ⁰ ) were found to be with the tolerance limits (< 5%). Therefore, the suggested immobilized CQDs/ZnO-BM 19.21 immunosensing fluorescence system displayed high selectivity towards the determination of CYFRA 21-1 antigen in human serum.

Analysis of Real Specimens

In real human specimens, the suggested immunosensing fluorescence system based on immobilized CQDs/ZnO-BM 19.21 solution was exploiting to detect and quantify the percentage (%) recoveries of the tumor marker CYFRA 21-1 antigen. As previously mentioned in the immunosensing procedure, the suggested system was used to determine the CYFRA 21-1 antigen by finding the relationship between the fluorescence intensity and the concentration of CYFRA 21-1 antigen in serum samples. Certain amounts of the target antigen (0.5, 1.0, and 2.0 ng mL ⁻¹ ) were added to the estimated samples, and the increase in signal intensities was evaluated. After six determinations, the percentage relative standard deviations (%RSD) were calculated. The outcome percentage recoveries were found to be ranged from 96.7 ± 0.7 to 100.0 ± 1.3%. The calculated %RSD was in the range of 0.2–1.4%. The tested serum samples were analyzed using a previously reported method [6] and the percentage recoveries were found to be ranged from 96.1 ± 1.6 to 100.0 ± 0.4% with %RSD 0.3–1.7%. In order to ensure the suitability of the suggested immunosensing fluorescence technique using an immobilized CQDs/ZnO-BM 19.21 solution, a comparative statistical study using Student’s t test and F test [46] was carried out between the present results and those obtained by others from previously conducted methods (Table 4). The obtained t test and F test values were found to be ranged from 0.354 to 2.181 (2.228)* and 1.16 to 4.0 (5.05)* with respect to the tabulated values of P  = 0.05, respectively. The results revealed good agreement between the suggested method and the previously published procedures. Also, all detected quantities of CYFRA 21-1 antigen in serum samples were within the normal limit indicating no lung cancer was diagnosed in the investigated serum samples.

Conclusion

The present study concerned with the preparation of green synthesis CQDs conjugated with ZnO nanocomposite using Citrus lemon as a precursor. The CQDs/ZnO nanocomposite was employed to form a new fluorescence immunosensing system by immobilizing a monoclonal BM 19.21 antibody through simple peptide bonds. The highly sensitive fluorescence system was used to determine the tumor marker of lung cancer (CYFRA 21-1) in human serum. CYFRA 21-1 antigen was determined via sandwich capping antibody-antigen-antibody reaction using another monoclonal antibody KS 19.1 coating the microtiter wells. The unique features and high sensitivity of the suggested system facilitate the determination of the target tumor marker with high stability and reproducibility. A comparative study was carried out and the outcome results confirmed the suitability and high sensitivity of the suggested immunosensing system, and the results were in agreement with a previously reported conventional technique.

Доступность данных и материалов

The only outcome data from this study was presented in the manuscript.

Сокращения

%RSD:

Percentage relative standard deviation

BM 19–21:

Specific monoclonal antibody

CQDs:

Carbon quantum dots

CQDs/ZnO:

Carbon quantum dots/zinc oxide

CYFRA-21-1:

Cytikeratin-19 fragment

DLS:

Динамическое рассеяние света

EDC:

Carbodiimide hydrochloride

eV:

Electron volt

FT-IR:

Fourier transform infrared

HRTEM:

High-resolution transmission electron microscope

KS 19-1:

Monoclonal cytokeratin 19-specific antibody

Ltd. Co:

Limited company

mAb:

Monoclonal antibody

NHS:

N-hydroxysuccinimide

P:

Degree of confidence

PBS:

Phosphate-buffered saline

SEM:

Сканирующий электронный микроскоп

ТЕМ:

Просвечивающий электронный микроскоп

UK:

Unite Kingdom

USA:

United States of America

UV-Vis:

Видимость в ультрафиолете

XPS:

Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия

XRD:

X-ray powder diffraction

ZnO:

Zinc oxide

ϴ:

Theta degree

λ_max :

Wavelength