Быстрый, чувствительный флуоресцентный иммуноассей для CYFRA 21-1 с использованием нанокомпозита углеродных квантовых точек/оксида цинка

Аннотация

Быстрое обнаружение рака легких на ранних стадиях с использованием антигена фрагмента цитокератина-19 (CYFRA 21-1) как опухолевого маркера в сыворотке человеческой крови играет важную роль в выживаемости пациентов и оперативной хирургической реакции. Цель данного исследования — использовать зеленый синтезированный нанокомпозит из углеродных квантовых точек, конъюгированных с оксидом цинка, в качестве высокочувствительного флуоресцентного иммуносенсорного решения для быстрого определения антигена CYFRA 21-1 в сыворотке человека. Предлагаемый метод проводился путем применения гидротермального метода для приготовления углеродных квантовых точек с использованием перкарпа Citrus lemon. Полученные углеродные квантовые точки использовались для восстановления и стабилизации ацетата цинка для синтеза нанокомпозита углеродных квантовых точек/оксида цинка. Для формирования сэндвич-иммуносенсорной системы антитело-антиген-антитело антиген CYFRA 21-1 был захвачен путем иммобилизации неконъюгированного моноклонального антитела BM 19.21 на поверхности нанокомпозита углеродных квантовых точек/оксида цинка и другого моноклонального антитела KS 19.1, нанесённого на поверхность мокротitr-пододонника. Данная система обладает настраиваемым флуоресцентным признаком, регистрируемым при длине волны возбуждения λ_ex = 470 нм и эмиссии λ_em = 520 нм. Предлагаемая нанокомпозитная флуоресцентная иммуносенсорная система демонстрировала линейную зависимость в диапазоне 0,01–100 нг/мл с пределом обнаружения 0,008 нг/мл. Система на основе нанокомпозита углеродных квантовых точек/оксида цинка предоставляет перспективный подход для быстрой диагностики рака легких путем обнаружения CYFRA 21-1 в сыворотке человека.

Введение

Рак легких — наиболее распространенный и агрессивный тип онкологии с серьезными вызовами в медицинском лечении. Рецидив опухоли и метастазирование считаются главными причинами смертности пациентов с раком легких [1]. Опухолевой маркер фрагмента цитокератина-19 (CYFRA 21-1) — фрагмент, существующий во многих нормальных и злокачественных эпителиальных клетках [2]. Он может быть оценен с помощью сэндвич-иммунорадиометрического анализа. Ранние исследования прояснили, что на злокачественных стадиях рака легких CYFRA 21-1 высвобождается в кровоток пациентов и повышается в их сыворотке [3]. Поэтому возможно улучшить выживаемость пациентов с раком легких путем раннего обнаружения и, как следствие, быстрой хирургической реакции [4].

Ранее сообщалось о нескольких техниках для обнаружения CYFRA 21-1, включая ферментативный иммуноассей [5], электрохемолюминесцентный иммуноассей [6] и иммунорадиометрический анализ [7]. Выгодная стратегия для усиления и улучшения чувствительности CYFRA 21-1 в сыворотке человека всё еще остается проблемой.

В последние годы достигнут значительный прогресс и взрывной рост нанотехнологий почти во всех областях жизни [8]. Среди этих областей: системы доставки лекарств [9], фармацевтический анализ [10], каталитические реакции [11], медицинские применения [12], опухолевые маркеры [13] и тканевая визуализация [14].

В настоящее время флуоресцентные (FL) сенсорные техники привлекли многих исследователей благодаря их простому дизайну и отличной чувствительности. Различные флуоресцентные сенсорные материалы были разработаны и синтезированы для биологического мониторинга. FL-системы для биологического определения высоколюминесцентны, водорастворимы, химически стабильны и нетоксичны [15]. Существуют различные флуоресцентные иммуносенсорные зонды для обнаружения биомаркеров. Гетерогенный конкурентный анализ проводится путем иммобилизации захватывающих молекул на поверхности и последующей инкубации с флуорофор-конъюгированными биомаркерами. Конкуренция между свободными и конъюгированными биомаркерами за связывание с захватывающими молекулами снижает интенсивность флуоресценции с концентрацией биомаркера [16]. Гетерогенный сэндвич-ассей основан на инкубации захватывающих молекул и исследуемого раствора с формированием комплекса с биомаркерами. Следовательно, интенсивность флуоресценции увеличивается с концентрацией биомаркера [17].

В однородном конкурентном ассей два разных флуорофора А-конъюгированных захватывающих молекул конъюгируются с флуорофором В-конъюгированными биомаркерами и раствор, увеличивающий флуоресценцию с концентрацией биомаркеров [18]. Однако эти техники показывали определенные недостатки, включая длительное экспериментальное время, отсутствие мультиплексного обнаружения, сложность и иногда относительно ложные результаты. Прогресс в нанотехнологиях позволил исследователям разрабатывать новые флуоресцентные иммуносенсорные зонды с уникальными оптическими характеристиками [19]. С первого использования квантовых точек в обнаружении биомолекул они завоевали большой интерес, так как их оптические особенности обеспечивают высокую гибкость в выборе подходящей длины волны, отличные метки для мультиплексного обнаружения, биосовместимость и таргетирующую способность [20].

Углеродные квантовые точки (УКТ) продемонстрировали отличные химические, физические, оптические, магнитные и электрические свойства. УКТ могут синтезироваться различными техниками, включая гидротермальную, электрооксидацию, лазерную абразию и микроволновые методы [21–24]. Благодаря своим свойствам низкой токсичности научные исследователи рассматривали УКТ как мощных кандидатов во многих флуоресцентных зондах. Кроме того, они обладают сильной способностью к манипулированию через различные контролируемые химические реакции в различных требованиях: биохимических, фотохимических, биосенсорных, биообразования, систем доставки лекарств [25–27], а также в иммуноассеях [28]. Ранние исследования по синтезу УКТ выявили определенные недостатки при использовании дорогих источников углерода, токсичных химикатов и реагентов или неселективных процессов [29]. Для ограничения этих недостатков исследователи начали использовать фруктовые соки как новые и дешевые источники углерода [30]. Поскольку использование фруктовых соков не обеспечивает оптимальной цели рационального использования ресурсов, флуоресцентные УКТ недавно получали из фруктовых кожур [31]. Использование фруктовых кожур предоставляет перспективный маршрут для эко-френдли и зеленого синтеза УКТ.

Оксид цинка (ZnO) — один из наиболее важных, потенциально активных, стабильных и малотоксичных металлических оксидов, широко используемых в ультрафиолетовых лазерных приборах, биомедицинской области, различных типах сенсоров и фотоctalysis [32–35]. Наночастицы оксида цинка (ZnO NPs) демонстрировали фотолюминесцентные свойства вблизи УФ и видимого спектрального диапазона. Это может быть attribuтировано к экситонной эмиссии, основанной на прямой рекомбинации электронно-дырочных пар [36] или благодаря желто-зеленой эмиссии при 520 нм в результате электронного перехода от края проводимости к ловушечному уровню [37].

В общем, углеродные точки — это аморфные или нанокристаллические квазисферические наночастицы, содержащие sp² и sp³ углерод, O/N-базированные группы и пост-модифицированные химические группы. Кроме того, УКТ способны возбуждаться более длинными длинами волн и могут менять эффективность комбинированных поверхностей электронно-дырочных пар и обрабатывать гашение в анализируемых системах, что может облегчить количественное определение биомолекул [38]. Они способны декорироваться металлическими оксидами, такими как TiO₂ и ZnO, для формирования оптически активных нанокомпозитов, которые могут быть использованы для обнаружения биомаркеров в сыворотке человека. ZnO — материал с широкой запрещенной зоной (3,37 эВ), который может люминесцировать в УФ и синих областях видимого света из-за наличия большой плотности дефектных уровней в запрещенной зоне [39]. Формирование нанокомпозита УКТ/ZnO увеличивает поглощение видимого света из-за гибридизации ZnO с УКТ, а синий сдвиг в люминесцентном поглощении до 520 нм может быть attribuтирован радиативной рекомбинации ионизированных вакансий кислорода. Помимо увеличения поглощения видимого света, лучшее разделение электрон-дырка и сокращение времени интерфейсного электронного переноса могут рассматриваться для более высокой оптической производительности гибридизированных УКТ с наночастицами ZnO [40]. Кроме того, значительное увеличение радикалов –OH*, генерируемых нанокомпозитом УКТ/ZnO на водном интерфейсе, может вызывать значительное повышение флуоресцентных сигналов анализируемой системы. Таким образом, комбинированный нанокомпозит УКТ/ZnO усиливает модификацию оптоэлектронных и фотолюминесцентных свойств поверхности ZnO и производит сильный поверхностный дефект с настраиваемой фотолюминесценцией [41]. Более того, УКТ, иммобилизованные с био-распознающими антителами, формирующие антитело-антиген-антитело FL-сенсорную систему, обеспечивают жизнеспособный зонд с высокой специфичностью и чувствительностью к целевому аналиту [42].

Предлагаемое исследование предложило новый простой и ультрачувствительный иммуноассей флуоресцентной сенсорной системы на основе УКТ, декорированных нанокомпозитом ZnO, для определения опухолевого маркера CYFRA 21-1 в сыворотке человека. Перкарп Citrus lemon использовался как предшественник углерода для получения УКТ в гидротермальных условиях. Более того, он использовался как восстанавливающий и стабилизирующий агент для синтеза нанокомпозита УКТ/ZnO. Приготовленный нанокомпозит УКТ/ZnO был иммобилизован неконъюгированным моноклональным антителом BM 19.21 (mAb), а мокротitr-пододонники были покрыты другим моноклональным антителом KS 19.1 для формирования сэндвич-каппинг иммуносенсорной системы.

Методы

Приборы

Спектрофотометрические спектры как УКТ, так и нанокомпозита УКТ/ZnO записывались с помощью спектрофотометра Ultrospec 2100-Biochrom (Biochrom Ltd., Камбиум, Кембридж, Великобритания). Поверхностная морфология и распределение размеров частиц зеленого синтезированных УКТ и нанокомпозита УКТ/Zn оценивались с помощью передаточного электронного микроскопа (TEM) модели JEOL 1200EX (JEOL Ltd., Фрайзинг, Германия) и сканирующего электронного микроскопа (SEM) модели JSM-7610F (JEOL, США). Флуоресцентные и Фурье-преобразования инфракрасной (FT-IR) спектры предлагаемой иммуносенсорной системы проверялись с помощью мультимодального ридера Biotek Synergy H1 (Biotek, Токио, Япония) и спектрофотометра Perkin Elmer FT-IR (PerkinElmer Ltd., Йокогама, Япония) соответственно. Рамановские спектры, X-фотоэлектронная спектроскопия (XPS) и рентгеновская порошковая дифракция (XRD) измерялись с помощью микро-Рамановского спектрометра (CRAIC Technologies, CA, США), системы X-спектроскопии Kratos Axis Ultra (Kratos Analytical Ltd., Манчестер, Великобритания) и дифрактометра Siemens D-5000 (Siemens, Эрфурт, Германия) соответственно.

Химикаты и реагенты

Прибор SG-2000-10090 (Барсбуттель, Германия) использовался для получения деионизированной воды, использованной во всех экспериментах. Неконъюгированные моноклональные антитела (mAb) BM 19.21 и KS 19.1 к CYFRA 21-1 для формирования сэндвич-иммуносенсорной системы были получены от Abcam (Кембридж, Великобритания). Плоды Citrus lemon поставлялись местными рынками. Фосфатно-буферный раствор (ФБР) pH = 7,4 готовился из хлорида натрия, хлорида калия, гидроксида натрия, монофосфата калия и дифосфата натрия (BHD Ltd. Co. Пуль, Великобритания). Randox Laboratories (Северная Ирландия-Великобритания) любезно предоставили коммерческие нормальные сыворотки. Случайные образцы крови собирались от здоровых волонтеров, и перед началом исследования было получено информированное согласие. Кроме того, Sigma-Aldrich (Гамбург, Германия) снабдила чистыми карбодиимидом гидрохлоридом (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS). Этический комитет исследований Короля Саудовского Университета, КСА (KSU-REC-002-E, 2019) одобрил исследование.

Зеленый гидротермальный приготовление углеродных квантовых точек (УКТ)

Перкарп Citrus lemon использовался для синтеза УКТ в гидротермальных условиях. Примерно 20 г перкарпа Citrus lemon и 200 мл деионизированной воды переносились в круглое колбо и рефлюксировали при 100 °C под непрерывным магнитным перемешиванием в течение 6 ч. После охлаждения до комнатной температуры полученный экстракт центрифугировали при 3500 об/мин, и 20 мл верхнего экстрагированного раствора автоклавировали и нагревали в гидротермальных условиях в диапазоне температур от 100 до 200 °C в течение различных интервалов 6–120 ч. После охлаждения до комнатной температуры верхний ликер представляет собой УКТ (Схема 1).

Зеленый синтез УКТ с использованием перкарпа Citrus lemon до флуоресцентного раствора УКТ и углеродных сфер

Приготовление нанокомпозита углеродных квантовых точек/оксида цинка

Для приготовления нанокомпозита УКТ/ZnO выполнялась простая химическая реакция восстановления с использованием УКТ как восстанавливающего и стабилизирующего агента. Нанокомпозит УКТ/ZnO получался путем добавления 20 мл УКТ к 50 мл 5,0 × 10⁻² моль/л ацетата цинка при 60 °C под непрерывным перемешиванием в течение 10 мин. Когда цвет смеси менялся с желтоватого на кремовый, смесь оставляли на 30 мин для завершения процесса восстановления и хранили при 4 °C. Для обеспечения стабильности и проверки агломерации приготовленного нанокомпозита УКТ/ZnO УФ-Vis спектрометрия использовалась для регистрации абсорбции в течение 20 дней при 390 нм. Результаты показали высокую стабильность и отсутствие значимых изменений в абсорбции нанокомпозита УКТ/ZnO.

Характеризация нанокомпозита углеродных квантовых точек/оксида цинка

Для подтверждения формирования нанокомпозита УКТ/ZnO использовались различные микроскопические и спектроскопические техники. Равномерность и поверхностная морфология УКТ и нанокомпозита УКТ/ZnO изучались с помощью высокоразрешающего передаточного электронного микроскопа (HRTEM) и SEM. Оптические спектры изучались с помощью УФ-Vis, FT-IR, XPS и Рамановской спектроскопии. Кристаллическая структура приготовленных УКТ оценивалась с помощью XRD-паттерна.

Процесс иммобилизации

Неконъюгированное моноклональное антитело BM 19.21 иммобилизовалось на поверхности синтезированного нанокомпозита УКТ/ZnO простой пептидной амидной связью между амином и активными карбоксиловыми группами. Процесс иммобилизации проводился путем добавления 5,0 мл каждого равно-молярного 3,0 × 10⁻³ моль/л NHS и EDC к 5,0 мл раствора нанокомпозита УКТ/ZnO под непрерывным перемешиванием в течение 1 ч. Примерно 5 мг неконъюгированного моноклонального антитела BM 19.21 растворяли в 1,0 мл 0,01 моль/л фосфатно-буферного раствора (pH = 7,4) и добавляли к вышеуказанному сенсорному раствору. Неконъюгированное моноклональное антитело BM 19.21 иммобилизовалось на поверхности раствора нанокомпозита УКТ/ZnO после инкубации при 37 °C в течение 12 ч (Схема 2). Спектрофотометрия использовалась для подтверждения успешности процесса иммобилизации.

Иммобилизация моноклонального антитела BM 19.21 на поверхности нанокомпозита УКТ/ZnO

Общий принцип иммуноассейного метода

Сэндвич-каппинг реакция антитело-антиген-антитело была получена с использованием другого моноклонального антитела KS 19.1, покрывающего поверхность мокротitr-пододонников (Схема 3). При оптимальных условиях иммуноассейя концентрация антигена CYFRA 21-1 определялась как функция увеличения интенсивности флуоресцентного сигнала.

Иллюстрированная схема представляет сэндвич-каппинг иммуносенсорную антитело-антиген-антитело реакцию

Иммуносенсорная процедура

Сбор образцов человеческих сывороток обеспечивался случайными волонтерами. Полное свертывание обеспечивалось перед центрифугированием при комнатной температуре и хранением при 4 °C. Техника шпикирования использовалась для приготовления стандартных образцов, содержащих антиген CYFRA 21-1 в диапазоне концентраций 0,01–500 нг/мл. Примерно 50 мкл шпикированных образцов дозировались в мокротitr-пододонники и смешивались с 50 мкл свеже разбавленного моноклонального антитела KS 19.1 с использованием фосфатно-буферного раствора pH = 7,4 в течение 30 мин, а затем инкубировали без покрытия пластины в течение 1 ч при 37 °C. Содержимое пододонников встряхивалось, и пододонники промывались три раза деионизированной водой (300 мкл) для каждого пододонника. Примерно 50 мкл иммобилизованного нанокомпозита УКТ/ZnO-BM 19.21 добавлялись в каждый пододонник, мягко смешивались и инкубировали в течение 30 мин при 37 °C. Приготовленные образцы подвергались флуоресцентному анализу с использованием мокротitr-ридера для регистрации интенсивностей.

Результаты и обсуждение

Морфологическая оценка углеродных квантовых точек и их нанокомпозита

Передаточный электронный микроскоп (TEM) использовался для характеристики поверхностной морфологии и распределения УКТ в образцах. Для проведения исследования под TEM примерно 4 мкл приготовленной суспензии УКТ капали на поверхность углеродной сетки TEM. На HRTEM-изображении (рис. 1a) наблюдались равномерные черные точки с решетчатым интервалом (0,36 нм), указывающие на формирование УКТ. График распределения размеров частиц был построен, и средний размер частиц варьировал от 1,5 ± 0,5 до 5,0 ± 0,5 нм (рис. 1b). Полученный размер частиц доказал, что сформированные УКТ действительно являются квантовыми наноматериалами. Кроме того, проводилась динамическое световое рассеяние (DLS), и средний размер частиц составлял ~ 20 ± 0,2 нм. Разница между предыдущими двумя измерениями была замечена. Предыдущие исследования раскрывали, что HRTEM не показывает кристаллическую решетчатую структуру сформированных УКТ при более высоких увеличениях из-за их аморфной природы [43]. Аналогично, в данном исследовании натуральный предшественник углерода — перкарп Citrus lemon, и полученные УКТ также демонстрировали аморфную природу. Следовательно, разница в измерениях размера частиц может быть attribuтирована агломерации сформированных УКТ, аморфной природе сформированных углеродных точек, механизму, вовлеченному в каждый эксперимент, и гидратационной динамике частиц.

a Изображение высокоразрешающего передаточного электронного микроскопа (HRTEM) УКТ с диаметром 5 нм и b график распределения размеров УКТ на основе TEM

Приготовленный нанокомпозит УКТ/ZnO исследовали с помощью TEM и SEM. На TEM-изображении (рис. 2a) присутствие шестиугольных частиц, прикрепленных к УКТ, указывало на формирование нанокомпозита УКТ/ZnO. В SEM образец нанокомпозита покрывали золотом для предотвращения поглощения электронов образцом и накопления заряда. Применяемое ускоряющее напряжение составляло 15 кВ при увеличении × 30 000 (рис. 2b).

a и b представляют изображения передаточного и сканирующего электронного микроскопа нанокомпозита УКТ/ZnO

УФ-Vis и флуоресцентные спектры УКТ изучались, и записанные спектры показывали два значимых пика при 224 и 280 нм, которые могут быть attribuтированы p~p* и n~P* переходам C=C и C=O соответственно. Также флуоресцентный спектр УКТ демонстрировал два сигнала при максимальном λ_ex = 360 и λ_em = 453 нм (рис. 3a, b). Кроме того, изучался УФ-Vis спектр нанокомпозита УКТ/ZnO. Значительный пик абсорбции наблюдался при 370 нм, демонстрируя синий-зеленый сдвиг (рис. 4a). Фотолюминесцентные (PL) свойства нанокомпозита УКТ/ZnO изучались. Размер и поверхностные дефекты УКТ сильно влияют на их люминесцентные свойства. Как функция длины волны возбуждения, (PL) эмиссия УКТ варьировалась [38]. Также наноразмерные частицы ZnO демонстрировали дефект-связанную эмиссию в сине-зеленой области видимого поглощения [41]. Следовательно, УКТ-декорированные ZnO NPs производили отличный нанокомпозит для PL-эмиссии. Как показано на рис. 4b, PL-спектр УКТ/ZnO демонстрировал синий сдвиг с значительным пиком при 520 нм после длины волны возбуждения 470 нм. Наблюдаемый сдвиг может быть attribuтирован перекрытию между энергетическими полосами УКТ и ZnO NPs. Отображенный синий сдвиг находился в уровне дефектной эмиссии 2,1 эВ.

Спектроскопические спектры УКТ (a) УФ-Vis спектр при 224 и 280 нм и (b) флуоресцентный спектр УКТ при λ_ex = 360 и λ_em = 452 нм

Спектроскопические спектры УКТ/ZnO NPs a УФ-Vis спектр с пиком абсорбции при 370 нм и b фотолюминесцентный спектр УКТ/ZnO NPs при λ_ex = 470 и λ_em = 520 нм

Для подтверждения формирования нанокомпозита УКТ/ZnO и иммобилизованного нанокомпозита УКТ/ZnO с неконъюгированным моноклональным антителом BM 19.21 проводилось сравнительное FT-IR исследование. Записанный FT-IR спектр УКТ раскрыл наличие различных выраженных пиков, соответствующих определенным функциональным группам, включая растягивающие вибрационные пики при 3462 см⁻¹ и 2932 см⁻¹ для групп C–OH и C–H соответственно. Кроме того, три вибрационные абсорбционные полосы наблюдались при 1749 см⁻¹, 1375 см⁻¹ и 1246 см⁻¹, соответствующие наличию функциональных групп C=O, C–N и C–O–C соответственно (рис. 5a). Новый пик при 436 см⁻¹, соответствующий растягивающей вибрационной полосе Zn–O, был замечен. Восстанавливающие и стабилизирующие свойства УКТ были получены от наличия –OH и COOH групп на их поверхности. Эти функциональные группы действуют как электронные доноры и имеют сильную аффинность к формированию нанокомпозита УКТ/ZnO. Следовательно, УКТ восстанавливали и стабилизировали сформированный нанокомпозит (рис. 5b). Как изображено на рис. 5c, замечалось, что два новых пика сформировались при 3254 см⁻¹ и 1675 см⁻¹. Эти пики attribuтировались растягивающей вибрации N–H и C=O соответственно, и подтверждали иммобилизацию УКТ/ZnO-BM 19.21 через пептидные связи.

FT-IR спектры a УКТ, b нанокомпозита УКТ/ZnO, и c иммобилизованного нанокомпозита УКТ/ZnO-BM 19.21

Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия (XPS) спектры зеленого синтезированных УКТ изучались. Полученный спектр УКТ (рис. 6a) показывал различные функциональные группы при 288 и 286 эВ для C=O и COOH соответственно. Также два значимых пика энергии связи наблюдались при 1044,4 и 1021,5 эВ для Zn 2p_1/2 и Zn 2p_3/2 соответственно (рис. 6b). Более того, высокоразрешающий XPS спектр нанокомпозита УКТ/ZnO подтвердил наличие различных пиков энергии связи при 560, 385, 350, 246 и 200 эВ для O 1s, C 1s, Zn 3s, Zn 3p и Zn 3d соответственно (рис. 6c). Все вышеупомянутые данные доказали наличие ZnO на поверхности УКТ, формируя нанокомпозит УКТ/ZnO.

Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия (XPS) спектры a УКТ, b ZnO, и c нанокомпозита УКТ/ZnO

Сравнительное исследование между XRD-паттернами УКТ и нанокомпозита УКТ/ZnO проводилось. Широкий пик при 20° (2θ) для углеродных точек замечался в XRD-паттерне УКТ (рис. 7a). Однако различные острые пики распознавались при 27°, 32°, 34°, 45°, 57°, 64°, 67°, 70°, 73°, 78° и 80° (2θ) для Zn (100), (002), (101), (102), (110), (103), (200), (112), (201), (004) и (202) соответственно. Наблюдаемые пики отражали распределение ZnO на поверхности УКТ, формируя нанокомпозит УКТ/ZnO (рис. 7b).

Рентгеновский дифракционный паттерн a УКТ и b нанокомпозита УКТ/ZnO

Рамановские спектры приготовленных УКТ, нанокомпозита УКТ/ZnO и иммобилизованного нанокомпозита УКТ/ZnO-BM 19.21 изучались. Рамановские сигналы обычно используются для изучения кристаллической структуры и её дефектов. На рис. 8a показаны два типичных D- и G-бэнда при 1300 и 1520 см⁻¹ для углеродных наночастиц соответственно. Как сообщалось ранее, D-бэнд обычно представляет sp³ дефекты, а G-бэнд — особенность плоскостной вибрации sp²-связанных углеродов [44]. Отношение I_D/I_G было рассчитано для приготовленных УКТ и составило 1,02 ± 0,03. Новые острые пики наблюдались при 440 и 520 см⁻¹ для наночастиц ZnO, и типичные пики УКТ наблюдались при 1364 и 1595 см⁻¹. Отношение I_D/I_G составило 1,2 ± 0,01, указывая на формирование нанокомпозита УКТ/ZnO (рис. 8b). Рамановский спектр иммобилизованного нанокомпозита УКТ/ZnO-BM 19.21 демонстрировал многочисленные пики, которые могут быть легко распознаны как подтверждающие признаки вторичной и третичной структур. Пики, наблюдаемые в области 1007–1128 см⁻¹, были ассоциированы с представлением основной вторичной структуры моноклонального антитела. Рамановские пики в области 550–682 см⁻¹ были ассоциированы с представлением дисульфидных конформаций, в то время как в области 867–797 см⁻¹ — с представлением состояния водородных связей тирозиновых остатков. Также значительный сдвиг рамановского спектрального пика до 1630 см⁻¹ может быть attribuтирован наличию третичной структуры иммобилизованного антитела [45] (рис. 8c). Отношение I_D/I_G увеличилось до 1,4 ± 0,04, раскрывая лучшую кристаллическую структуру из-за формирования иммобилизованного нанокомпозита УКТ/ZnO-BM 19.21.

Сдвиг рамановских спектров a УКТ, b нанокомпозита УКТ/ZnO, и c иммобилизованного нанокомпозита УКТ/ZnO-BM 19.21

Оптимизация условий флуоресцентного иммуносенсирования

Выбор и оптимизация предлагаемых условий флуоресцентного иммуносенсирования проводились путем изучения различных параметров. В общем, количество иммобилизованного нанокомпозита, pH и концентрация используемого буфера, время инкубации между целевым аналитом в сывороточных образцах и иммуносенсорными реагентами должны быть изучены и оптимизированы. Для выбора подходящего количества иммобилизованного нанокомпозита УКТ/ZnO-BM 19.21 тестировались различные объемы в диапазоне 10–100 мкл. Максимальная интенсивность флуоресценции наблюдалась при добавлении 50 мкл иммобилизованного нанокомпозита УКТ/ZnO-BM 19.21 (рис. 9a). Четыре фосфатно-буферных раствора pH 7,2–7,5 готовились и тестировались как функция интенсивности флуоресценции. Небольшое изменение интенсивности флуоресцентного сигнала наблюдалось при изменении значений pH. При pH 7,2 и 7,3 флуоресцентный сигнал снижался из-за химической нестабильности иммобилизованного нанокомпозита УКТ/ZnO. Флуоресцентный сигнал увеличивался при pH 7,4–7,5 благодаря отличному взаимодействию между моноклональными молекулами на поверхности нанокомпозита (рис. 9b). Было найдено, что 7,4 — наиболее подходящее значение pH для поддержания активности целевого антигена, который может декомпозироваться при повышении pH выше 7,5. Поэтому pH 7,4 был выбран для дальнейших исследований.

Оптимизация флуоресцентного определения антигена CYFRA 21-1 при λ_ex = 470 и λ_em = 520 нм. a Эффект добавленного иммобилизованного нанокомпозита УКТ/ZnO-BM 19.21, b эффект фосфатного буферного раствора pH 7,3–7,5, c эффект концентрации буфера с использованием ФБР в диапазоне 0,01–0,05 моль/л, и d эффект времени иммунореакции 10–60 мин

Влияние концентрации фосфатно-буферного раствора на интенсивность флуоресценции оценивалось с использованием диапазона концентраций 0,01–0,05 моль/л. Максимальный сигнал интенсивности флуоресценции получался при концентрации буфера 0,01 моль/л. При более высоких концентрациях буфера иммобилизованный нанокомпозит УКТ/ZnO-BM 19.21 агломерировал, и нестабильность иммуносенсорного раствора могла вызывать снижение интенсивности флуоресценции (рис. 9c). Для расчета времени иммунореакции аналитическая процедура повторялась с использованием времени реакции от 10 до 60 мин. Максимальный сигнал интенсивности флуоресценции наблюдался при поддержании реакции между тестируемым антигеном и иммуносенсорным раствором минимум 30 мин (рис. 9d).

Аналитическая квантификация

При оптимизированных условиях предлагаемый иммуноассейный метод выполнялся с использованием 12 сывороточных образцов, содержащих антиген CYFRA 21-1 в диапазоне концентраций 0,01–500 нг/мл¹. Результаты строились для построения калибровочного графика, который был линейным в диапазоне концентраций 0,01–100 нг/мл⁻¹ с пределом обнаружения 0,008 нг/мл⁻¹. Расчетное уравнение было I_F = 7,933C + 181,24 (r² = 0,9992). После шести повторений процент относительного стандартного отклонения (%RSD) составил 1,3%. Приемлемые результаты раскрыли высокую чувствительность иммуносенсорного флуоресцентного метода для квантификации антигена CYFRA 21-1 в сывороточных образцах.

Пригодность системы

Пригодность системы исследовалась путем проведения сравнительного исследования между предлагаемым иммобилизованным нанокомпозитом УКТ/ZnO-BM 19.21 иммуносенсорным методом и ранее описанными методами. Предлагаемая флуоресцентная система обеспечивала значительные преимущества, такие как простота, экологичность и легкое обнаружение целевого аналита в сывороточных образцах. Записанные результаты раскрыли высокую чувствительность с широким линейным диапазоном обнаружения 0,01–100 нг/мл¹ и более низким пределом обнаружения 0,008 нг/мл¹ (табл. 1).

Точность, точность и селективность иммобилизованной иммуносенсорной системы

Для обеспечения точности предлагаемой иммобилизованной флуоресцентной иммуносенсорной системы УКТ/ZnO-BM 19.21 для определения антигена CYFRA 21-1 в сывороточных образцах тестировались 12 сывороточных образцов. Полученные данные сравнивались с другой ранее сообщенной техникой [6], основанной на электрохемолюминесцентном ассейе с использованием трис(2,2′-бипиридил)рутений(II) комплекса для возбуждения трипропиламином. Приемлемые результаты были получены, как указано в таблице 2. Внутридневной и междневной ассей использовались для исследования точности предлагаемого метода. Тест проводился с использованием сывороточного образца, содержащего 10 нг/мл⁻¹ антигена CYFRA 21-1. Средние относительные стандартные отклонения составили 1,1% и 1,3% для внутри- и междневного ассея соответственно, что раскрыло высокую точность. Кроме того, селективность предлагаемого метода по отношению к определению антигена CYFRA 21-1 оценивалась с использованием некоторых возможных интерферирующих веществ: аминокислот (цистеин, лизин, серин, тирозин, глицин), некоторых катионов (K⁺, Na⁺, Ca²⁺, Mg²⁺, Zn²⁺) и других биомаркеров, таких как CA 15-3, CA 27-29, CA 19-9 и CA 125. Тест проводился при оптимальных условиях с использованием человеческой сыворотки, содержащей 10 нг/мл⁻¹ антигена CYFRA 21-1 в присутствии 10 нг/мл⁻¹ косуществующих веществ. Полученные данные рассчитывались как относительная процентная ошибка (Er%) и соответствующий результат не превышал ±5% для каждого интерферирующего вещества (табл. 3). Расчетные значения толерантности (F-F⁰/F⁰) находились в пределах толерантных лимитов (< 5%). Следовательно, предлагаемая иммобилизованная флуоресцентная иммуносенсорная система УКТ/ZnO-BM 19.21 демонстрировала высокую селективность по отношению к определению антигена CYFRA 21-1 в человеческой сыворотке.

Анализ реальных образцов

В реальных человеческих образцах предлагаемая иммуносенсорная флуоресцентная система на основе иммобилизованного раствора УКТ/ZnO-BM 19.21 использовалась для обнаружения и квантификации процента (%) восстановления опухолевого маркера антигена CYFRA 21-1. Как упоминалось ранее в иммуносенсорной процедуре, предлагаемая система использовалась для определения антигена CYFRA 21-1 путем нахождения связи между интенсивностью флуоресценции и концентрацией антигена CYFRA 21-1 в сывороточных образцах. Определенные количества целевого антигена (0,5, 1,0 и 2,0 нг/мл⁻¹) добавлялись к оцениваемым образцам, и увеличение интенсивности сигналов оценивалось. После шести определений рассчитывались процентные относительные стандартные отклонения (%RSD). Процент восстановления варьировался от 96,7 ± 0,7 до 100,0 ± 1,3%. Рассчитанный %RSD находился в диапазоне 0,2–1,4%. Протестированные сывороточные образцы анализировались с использованием ранее сообщенного метода [6], и процент восстановления варьировался от 96,1 ± 1,6 до 100,0 ± 0,4% с %RSD 0,3–1,7%. Для обеспечения пригодности предлагаемой иммуносенсорной флуоресцентной техники с использованием иммобилизованного раствора УКТ/ZnO-BM 19.21 проводилось сравнительное статистическое исследование с использованием t-критерия Стьюдента и F-критерия [46] между настоящими результатами и полученными другими из ранее проведенных методов (табл. 4). Полученные значения t-критерия и F-критерия варьировались от 0,354 до 2,181 (2,228)* и от 1,16 до 4,0 (5,05)* относительно табличных значений при P = 0,05 соответственно. Результаты раскрыли хорошее соответствие между предлагаемым методом и ранее опубликованными процедурами. Также все обнаруженные количества антигена CYFRA 21-1 в сывороточных образцах находились в пределах нормы, указывая на отсутствие диагностированного рака легких в исследуемых сывороточных образцах.

Заключение

Настоящее исследование касалось приготовления зеленого синтеза УКТ, конъюгированных с нанокомпозитом ZnO с использованием Citrus lemon как предшественника. Нанокомпозит УКТ/ZnO использовался для формирования новой флуоресцентной иммуносенсорной системы путем иммобилизации моноклонального антитела BM 19.21 через простые пептидные связи. Высокочувствительная флуоресцентная система использовалась для определения опухолевого маркера рака легких (CYFRA 21-1) в сыворотке человека. Антиген CYFRA 21-1 определялся через сэндвич-каппинг реакцию антитело-антиген-антитело с использованием другого моноклонального антитела KS 19.1, покрывающего мокротitr-пододонники. Уникальные особенности и высокая чувствительность предлагаемой системы облегчают определение целевого опухолевого маркера с высокой стабильностью и воспроизводимостью. Сравнительное исследование было проведено, и полученные результаты подтвердили пригодность и высокую чувствительность предлагаемой иммуносенсорной системы, а результаты согласовывались с ранее сообщенной традиционной техникой.