Биосовместимые этиосомальные везикулы с 5-аминолевулиновой кислотой и золотыми наночастицами: синергетическая фотодинамическая/фототермическая трансдермальная стратегия для гипертрофических рубцов

Аннотация

Мы сообщаем о биосовместимых этиосомальных везикулах (A/A-ES), со-загруженных 5-аминолевулиновой кислотой (ALA) и золотыми наночастицами (AuNPs), приготовленных ультразвуком без токсичных реактивов. A/A-ES показывает выраженную плазмонную полосу поглощения 600–650 нм, позволяя одновременную фотодинамическую (ФДТ) и фототермическую (ФТТ) активацию лазером 632 нм. In vitro трансдермальные исследования подтверждают, что A/A-ES эффективно доставляет и ALA, и AuNPs в ткань гипертрофического рубца (ГР), достигая 48 % удержания ALA через 2 ч. Клеточные тесты с фибробластами гипертрофического рубца (ФГР) показывают, что A/A-ES заметно повышает генерацию реактивных форм кислорода (РФК) и тепловыделение, приводя к усиленной аоптозу и некрозу по сравнению с ФДТ или ФТТ в одиночку. Результаты подчеркивают A/A-ES как перспективную топикальную платформу для синергетической ФДТ/ФТТ ГР.

Введение

Гипертрофические рубецы (ГР) возникают из-за избыточного дермального коллагенового депонирования и характеризуются утолщенной фиброзной кожей, нарушающей функцию и эстетику. Конвенциональные лечения — внутринаadurasные инъекции, компрессионные изделия, лазерная терапия — часто страдают от ограниченной эффективности, дискомфорта или побочных эффектов (гипопигментация, тканевая атрофия). Фотодинамическая терапия (ФДТ) с 5-аминолевулиновой кислотой (ALA) предлагает селективную цитотоксичность через генерацию РФК, но клиническая полезность ограничена плохим проникшением в кожу и низким выходом РФК. Фототермическая терапия (ФТТ), особенно с AuNPs, конвертирующими свет в тепло через локализованный поверхностный плазмонный резонанс (ЛППР), может усилить генерацию РФК и селективно аблировать рубцевую ткань, но высокие лазерные мощности рискуют повреждением окружающей кожи.

Комбинация ФДТ и ФТТ в одной платформе обещает синергетические выгоды: ALA-мединированная генерация РФК может усилиться теплом AuNPs, в то время как фототермический эффект может повысить локальную температуру, дальше бустя выход РФК. Этиосомальные везикулы (ES) дают деформируемый липидный носитель, усиливающий трансдермальную доставку гидрофильных и липофильных препаратов. Ранние работы показывали, что ALA-загруженные ES (ALA-ES) значительно превосходят водные растворы в доставке ALA в ткань ГР. Однако интеграция AuNPs в ES с сохранением биосовместимости и эффективной доставки оставалась сложной. Здесь мы представляем фасилитированный ультразвук-базированный синтез A/A-ES, одновременный инкапсулирующий ALA и AuNPs без токсичных растворителей, достигая высокого захвата ALA (~20 %) и сильного поглощения 600–650 нм.

Результаты и обсуждение

Характеристика A/A-ES

Ультразвук служил двум целям: (1) генерировал AuNPs in situ через радикально-мединированное восстановление AuCl₄⁻, исключая токсичные восстановители; (2) индуцировал реорганизацию липидного бислоя, давая маленькие равномерные везикулы с вместительным ядром для загрузки препаратов. UV-Vis подтвердил сильный пик поглощения 600–650 нм (Рис. 1a), приписываемый плазмонной связке между смежными AuNPs. Динамическое рассеятие света выявило узкое распределение размеров с центром 166±83 нм (Рис. 1b), SEM/TEM показали целые сферические везикулы ~200 нм с явно видимыми AuNPs в бислое (Рис. 1c,d). Эффективность инкапсуляции (ЭЭ) ALA достигла 20 %, превосходя значения для конвенциональных ES формуляций (<10 %). Эти характеристики указывают, что A/A-ES пригоден для преодоления плотной коллагеновой матрицы ГР.

In vitro трансдермальное проникновение A/A-ES

Используя Францевские диффузионные камеры, квантифицировали удержание ALA и AuNPs в свеже эксцизированной ткани ГР. Оба агента пиковали через 2 ч, достигая 48 % приложенной дозы ALA в ткани (Рис. 2a). Последующий спад отражает полное трансдермальное проникновение. TEM (Рис. 2b–d) подтвердил целые везикулы в дерме, затем высвобождение AuNPs, агрегирующихся in situ — благоприятно для теплогенерации при лазерной облучении. Данные устанавливают A/A-ES как эффективный носитель для ко-доставки ALA и AuNPs в ткань ГР.

In vitro ФДТ/ФТТ ФГР

Биосовместимость

Тесты живучести клеток не выявили значимой цитоксичности A/A-ES при концентрациях ≤2,0 мМ, выживаемость >90 % через 12 ч (Рис. 3). Высшие дозы вызывали лишь незначительное снижение, подтверждая профиль безопасности и направляя терапевтическую концентрацию к 2,0 мМ (~14 % об.об.) для последующих экспериментов.

ФДТ/ФТТ для ФГР

Конфокальная микроскопия показала надежное накопление протопорфирина IX (PpIX) в ФГР, обработанных ALA-ES и A/A-ES; Au-ES давала незначительный PpIX (Рис. 4). При облучении лазером 632 нм флуоресценция PpIX снижалась, сигналы РФК усиливались, особенно в A/A-ES клетках — доказательство усиленной генерации РФК через ЛППР AuNPs. Морфологические изменения, такие как пузырчатые мембраны, были выражены в A/A-ES клетках, указывая на смерть клеток. ИК-термография подтвердила, что ALA-ES, Au-ES и A/A-ES поднимали локальную температуру до 41,3 °C (Au-ES/A/A-ES) и 36,5 °C (ALA-ES) под облучением, с быстрым охлаждением после (Рис. 5). Находки подчеркивают двойное фотодинамическое и фототермическое действие A/A-ES.

Апоптоз и некроз

Цитометрия потока Annexin V/PI-окрашенных клеток выявила: лазер-обработанные A/A-ES индуцировали наивысшую некротическую фракцию (61,8 %) против ALA-ES (47,7 %) и Au-ES (24,3 %) (Рис. 6). Ранний и поздний аоптоз также были повышены в A/A-ES, отражая синергетический эффект усиления РФК и фототермического стресса. Результаты количественно демонстрируют превосходство комбинированного ФДТ/ФТТ подхода над одиночными модальностями.

Визуализация A/A-ES в ФГР

ТЭМ выявило обширную агрегацию AuNPs в цитоплазме A/A-ES обработанных ФГР, согласуясь с эффективным слиянием везикул и высвобождением груза. Пост-облучения снимки показывали характерные мембранные пузыри, вздутые митохондрии и разорванные внешние мембраны — маркеры клеточной смерти (Рис. 7). Ультразвуковые изменения подтверждают, что A/A-ES эффективно доставляет ALA и AuNPs в ФГР, приводя к синергетическому фотодинамическому и фототермическому убийству клеток.

Заключение

Мы разработали биосовместимый ультразвуково синтезированный ALA/AuNP-загруженный этиосомальный везикул (A/A-ES), демонстрирующий сильное поглощение 600–650 нм, высокий захват ALA (~20 %) и эффективную трансдермальную доставку в ткань ГР. In vitro исследования подтверждают, что A/A-ES усиливает генерацию РФК и фототермическое нагревание, давая превосходный аоптоз и некроз ФГР по сравнению с ФДТ или ФТТ в одиночку. Находки поддерживают A/A-ES как перспективную топикальную платформу для синергетической фотодинамической/фототермической терапии гипертрофических рубецов, оправдывая будущие in vivo оценки.

Эксперименты и методы

Подготовка A/A-ES

Фосфатидилхолин (180 мг) растворили в 1,8 мл этанола, 0,6 мл 10 мМ HAuCl₄ и 3,6 мл 0,01 М ALA-цитрат буфера (pH 4,0, 12 мг ALA). Смесь перемешивали 700 об/мин 10 мин, затем ультразвуком 200 Вт 30 мин до появления вино-красного цвета. Центрифугация (8000 об/мин, 20 мин) удаляла нереагировавшие реактивы, осадок передиспергировали в 3 мл 2 мг/мл ALA гидроалкогольном растворе. Трансмембранный pH-градиентный метод загрузки использовали для инкапсуляции ALA в ядро везикулы, получая итоговый A/A-ES. Для сравнения ALA-ES и Au-ES готовили с идентичными концентрациями ALA или AuNPs но без другой компоненты.

Характеризация A/A-ES

Негативное окрашивание 1,5 масс.% фосфовольфрамовая кислота затем ТЭМ (JEOL, 120 кВ) оценивали морфологию. SEM (JEOL, 10 кВ) оценивали поверхностные признаки. Распределение размеров DLS (Nicomp 380ZLS). Содержание ALA флуорескамином дериватизацией, ЭЭ ультрафильтрацией. UV-Vis на Varian Cary 50.

In vitro проникновение Францевскими камерами

Ткань ГР (≤24 ч пост-эксцизии) монтировали на Францевской камере со роговым слоем к донорскому отделу. 1 мл A/A-ES наносили, рецептор держали 37 °C. После заданных интервалов ткань промывали, гомогенизировали, ALA экстрагировали диализом 24 ч. AuNPs квантифицировали ИКП-МС. После 2 ч экспозиции ткани обрабатывали для ультратонких сечений и ТЭМ.

In vitro ФДТ/ФТТ ФГР

Клеточная культура

ФГР изолировали из биопсий пациентов ГР коллагеназой I и культивировали в DMEM с 10 % ФБС при 37 °C, 5 % CO₂. Клетки использовали на пассажах 2–3.

Биосовместимость

ФГР (2×10³ клеток/колодец) инкубировали с серийными разведениями ALA-ES, Au-ES или A/A-ES в среде без ФБС 12 ч. Жизнеспособность CCK-8.

Процедура ФДТ/ФТТ

ФГР (4×10⁴ клеток/колодец) инкубировали с 14 % об.об. A/A-ES или контролями 6 ч, затем промывали и облучали лазером 632 нм, 40 мВт/см² He-Ne 20 мин. После облучения культивировали в DMEM с 10 % ФБС 24 ч перед дальнейшими анализами.

Внутриклеточный PpIX и РФК

PpIX и РФК визуализировали КЛСМ (Leica TCS SP5). DCFH-DA окраска квантифицировала РФК, флуоресценция PpIX захватывали при возбуждении 405 нм/эмиссии 635 нм.

Апоптоз и некроз

Annexin V-FITC/PI двойная окраска затем BD FACSCalibur цитометрия потока определяла аоптоз и некроз. Данные анализировали FlowJo 7.6.

Статистический анализ

Данные представлены как среднее ± SD. t-критерий Стьюдента определял значимость (P<0,05).

Аббревиатуры

A/A-ES:

5-аминолевулиновая кислота/золотые наночастицы-загруженные этиосомальные везикулы

ALA:

5-аминолевулиновая кислота

ALA-ES:

ALA-загруженные ES

ALA-ФДТ:

ALA-базированная ФДТ

Au-ES:

AuNP-загруженные ES

AuNPs:

Золотые наночастицы

CLSM:

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

DLS:

Динамическое рассеяние света

DMEM:

Модифицированное среднее Дюльбекко

EE:

Эффективность инкапсуляции

ES:

Этиосомальные везикулы

FBS:

Фетальная бычья сыворотка

HS:

Гипертрофический рубец

HSF:

Фибробласты гипертрофического рубца

ICP-MS:

Индуктивно связанная плазма-масс-спектрометрия

LSPR:

Локализованный поверхностный плазмонный резонанс

PDT:

Фотодинамическая терапия

PDT/PTT:

Фотодинамическая/фототермическая терапия

PpIX:

Протопорфирин IX

PTT:

Фототермическая терапия

ROS:

Реактивные формы кислорода

SEM:

Раскатная электронная микроскопия

TEM:

Проходная электронная микроскопия