Инновационная нанопartikelная терапия на основе метotreксáта-фолáта с лазерно-ассистированным фототермическим подходом усиливает лечение рака груди

Аннотация

Низкоуровневая лазерная терапия (LLLT) — безопасный вид фототерапии для таргетирования опухолевых тканей/клеток. Таргетированные наночастицы повышают эффективность канцеротерапии. Исследование посвящено совместному эффекту силика-покрытых золотых наночастиц (Au@SiO₂), загруженных фолатом (FA) и метotreксáтом (MTX), и LLLT в борьбе с раком груди.

Наночастицы синтезированы и охарактеризованы (FTIR, TEM, DLS-зета). Частицы сферические, средний диаметр ~25 нм, положительный заряд (+13,3 мВ); после конъюгации с FA и MTX заряд меняется на −19,7 мВ.

Изучение клеточного захвата показало усиленную интернализацию FA/MTX-нагруженных наночастиц в обеих линейках рака груди, особенно в MDA-MB-231 (высокая экспрессия фолатовых рецепторов). LLLT сама по себе проявляла пролиферативный эффект, но в сочетании с таргетированными наночастицами эффективность комбинированной химио-фототермической терапии значительно возрастала (МТТ-тест, p<0,05, DAPI-окрашивание, анализ клеточного цикла). Максимальный апоптотический эффект наблюдался при комбинации MTX-FA-Au@SiO₂ NP + LLLT (DAPI, задержка в subG0/G1 фазе). Комбинация химиотерапии и LLLT улучшает перспективы лечения рака груди с минимальными побочными эффектами.

Введение

Рак груди (РГ) — наиболее частый женский онкологический заболевание: 1,7 млн новых случаев в год в мире. Из-за сложной этиологии и плохого отклика на терапию — главная причина онкологической смертности женщин. В США ~40 тыс. смертей в 2014 г. Всего 522 тыс. смертей, 5-я причина онкосмертности; ~800 тыс. случаев в развивающихся и столько же в развитых регионах. В Азии пик заболеваемости 40–50 лет, на Западе — 60–70 лет. Факторы риска: пол, наследственность, возраст, репродуктивные факторы (поздние роды, ранняя менархе, поздняя менопауза, нулипаритет).

Цель онкотерапии — эффективные схемы с низкой токсичностью и высокой специфичностью для устранения опухолей, метастазов и профилактики рецидивов. Текущие методы (хирургия, химио-, лучевая терапия) имеют побочные эффекты и не достигают цели.

Последние десятилетия: прогресс в термической терапии. Фототермическая терапия (PTT) — перспективный неинвазивный метод. PTT на базе фотоабсорбирующих наноструктур — альтернатива стандартным подходам. Типичная PTT: PTT-агенты при NIR облучении (700–1100 нм) нагревают опухоль до 42 °C — точное и минимально инвазивное уничтожение. Многочисленные наночастицы изучаются как контрастные агенты, носители лекарств, преобразователи энергии (лазер, радиоволны, ультразвук) в тепло.

Золотые наночастицы (AuNPs) привлекают внимание: высокий локализованный поверхностный плазмонный резонанс (LSPR), легкая конъюгация с биомолекулами. Высокая фототермическая конверсия в NIR без токсичности. Но: низкая фототермическая стабильность при повторном NIR облучении (потеря способности), плохая грузоподъемность и контроль высвобождения лекарства. Альтернатива — мезопористые силика наночастицы (MSN): высокая загрузка лекарств/ДНК/белков, нет токсичных продуктов деградации, большая площадь, контролируемый размер, поры, удобная функционализация.

Конъюгация наночастиц с химиотерапевтиком и таргетирующим лигандом преодолевает недостатки стандартной химиотерапии: неспецифическая доставка, низкая растворимость, низкий терапевтический индекс. Химиотерапевтики (доксорубицин, циклофосфамид, метotreксáт, фторурацил, докetakсель) используются как мономерно, так и в комбинациях, иногда с PTT. Неблагоприятные эффекты химиотерапии — от неспецифического распределения: поражение быстро делящихся нормальных клеток (кровь, слизистые, волосяные фолликулы).

Метotreксáт (MTX) — частый препарат при ревматоидном артрите и опухолях (кожа, легкие, голова/шея, грудь). Ингибирует дигидрофолат редуктазу (DHFR) → блок синтеза тетрагидрофолата → остановка синтеза тимидилата и пуринов → ингибиция ДНК, РНК, тимидилатов, белков → подавление роста и пролиферации.

Главная проблема PTT-агентов — селективное накопление в опухоли после системного введения. Таргетированная терапия доставляет лекарство в раковые клетки, щадя здоровые, позволяя более высокие дозы в опухоли при низкой системной токсичности. Лиганд-таргетированные наночастицы распознают маркеры, переэкспрессированные на раковых клетках.

Фолиевая кислота (фолат, витамин B9) — ключевая для роста и метаболизма клетки. Высокая аффиность к фолатовым рецепторам делает её инструментом таргетирования. Фолатовый рецептор — опухолевой биомаркер, переэкспрессирован в раке груди, яичника, легких, почки, мозга, толстой кишки. Фолат-конъюгированные системы доставки усиливают клеточный захват через эндоцитоз.

Материалы и методы

Реактивы и материалы

Двужды дистиллированная вода, аналитически чистые реактивы. Sigma-Aldrich: TEOS (98%), MPTES (95%), фолиевая кислота, родaмин B. Merck: HCl (37%), аммиак (25%), толуол, NaOH (98%), растворители. MTX — Zahravi Farma (Табриз, Иран).

Оборудование

TEM (LEO 906, Германия) — размер/морфология (~100 мкл суспензии на углеродную пленку, фриз-сушка, 80 кВ). DLS (Zetasizer Nano ZS90, Malvern, 25 °C) — размер. Зета-потенциал (Zetasizer-ZS, Malvern). UV-Vis (UV-1601 PC, Shimadzu, 700 мкл кювета, 10 мм). FTIR (Bruker Tensor 27, KBr таблетки). pH-метр (Metrohm 713). Механический перемешиватель (Heidolph RZR 2102). HPLC (Waters 2690 + UV-Vis детектор Waters 2500, колонка C18 Bondapak 250×4,6 мм, 10 мкм, 125 Å) — эффективность инкапсуляции FA и MTX.

Синтез Au@SiO₂ наночастиц

Четыре этапа: 1) SiO₂ NPs (соль-гель); 2) тиол-функционализация SiO₂ (TFSNPs, по пред. работе); 3) AuNPs цитратным редуктированием (Туркевич); 4) покрытие TFSNPs AuNPs. TFSNPs диспергировали в воде (банный ультразвук 1 ч), добавили к AuNPs, ультразвук 30 мин. Реакция в темноте, динамическое перемешивание, 25 °C, 2 суток. Au@SiO₂ (фиолетовые) осадили центрифугированием (10 000 об/мин, 10 мин), сушили в вакуумной печи.

Загрузка MTX и FA

MTX (10 мг) в 10 мл разбавленной суспензии Au@SiO₂ в ФСБ (5 мг/мл, pH 7,4), перемешивание в темноте 1 сутки. Осадили, супернатант — на незгруженный MTX. Затем FA (10 мг) в ту же суспензию, перемешивание 1 сутки в темноте. Осадили FA-MTX-Au@SiO₂, супернатант — на свободный FA. Лиофилизация. Незгруженные MTX и FA — HPLC (протокол). FA растворили в аммиаке (10%), разбавили мобильной фазой. Время удержания: MTX 10,5 мин, FA 5,95 мин. Трипликаты. Эффективность загрузки (DLE): DLE(%) = (начальные лекарства — незгруженные) / начальные лекарства × 100.

Клеточные линии и культура

Две линии рака груди с известной экспрессией фолатового рецептора (FR): MCF-7 и MDA-MB-231 (Pasteur Cell Bank, Тегеран). Среда: RPMI-1640 + 10% ФСК + 1% пенициллин/стрептомицин, 37 °C, 5% CO₂, 95% влажность.

Цитотоксичность (МТТ)

1,5×10⁴ клеток/колодец 96-колодчатой пластинки, 24 ч, затем обработка: свободный MTX, Au@SiO₂, FA-MTX-Au@SiO₂. Контроль — без обработки. MTT (5 мкг/мл) 4 ч, 37 °C. Формазан растворили в DMSO, абсорбция 570 нм (ELISA ридер). Жизнеспособность к контролю, фон вычтен.

In vitro лазерная терапия (LLLT)

NIR лазер 810 нм (Diode Mustang 2000, Россия), 185 мВт. Клетки (1,5×10⁴) + Au@SiO₂ или FA-MTX-Au@SiO₂ → облучение дозами 30, 60, 75, 90, 105 Дж/см² (фиксированное время 139 с). Контроли: только лазер (позитивный), ничто (негативный). Через 24 ч — МТТ-тест.

Клеточный захват наночастиц

Количественный (цитометрия) и качественный (флуоресцентная микроскопия) анализ. NPs загрузили родaмином B (RhoD) в ФСБ 24 ч, темнота. Разделили Amicon Filter (NMWL 30 кДа), центрифуга 5000 об/мин 15 мин, промывка ФСБ. Клетки (5×10⁵/колодец) → конфлюенция → обработка RhoD-NPs 30, 90, 180 мин. Трипсинизация, промывка, цитометрия (BD FACSCalibur). Качественно: клетки на стеклышках 24 ч → свободные Au@SiO₂ и MTX-FA-Au@SiO₂ → 30/90/180 мин → промывка → флуоресцентная микроскопия (Olympus BH2-FCA).

Апоптоз (DAPI)

Ядерная морфология DAPI (связывается с ДНК). Протокол: 5×10⁵ клеток/колодец 6-колодчатой пластинки, 24 ч → обработка: MTX, Au@SiO₂, MTX-FA-Au@SiO₂ ± лазер → промывка → фиксация 10% формальдегид → пермеабилизация Triton X-100 (15 мин) → DAPI (5 мин) → флуоресцентная микроскопия (Olympus). Негативный контроль — без обработки; позитивный — только лазер.

Анализ клеточного цикла

Цитометрия (PI окраска ДНК). 5×10⁵ клеток → 80% конфлюенция → обработка: MTX, Au@SiO₂, MTX-FA-Au@SiO₂ ± LLLT (75 Дж/см²). Негативный контроль — без обработки; позитивный — только лазер. Трипсинизация, промывка, фиксация этанолом 48 ч → промывка → RNase A (Cinaclone) → PI (Sigma) в темноте → FACS (Beckton Dickinson).

Статистика

Три повторения, среднее ± SD. ANOVA (SPSS). p<0,05 — значимо.

Результаты и обсуждение

Характеризация синтезированных НП

Синтез Au@SiO₂ (рис. 1): 4 этапа. FTIR (рис. 2а) подтверждает успех: Si–O–Si ~1088 см⁻¹; широкий пик 3000–3700 и 803 см⁻¹ — O–H растяжение и деформация вывихнутых силианолов; алифатический C–H ~2950 см⁻¹; C–O метоксисилана ~1191 см⁻¹.

DLS (рис. 2б): FA-MTX-Au@SiO₂ размер 105±2,3 нм, узкое распределение.

Зета-потенциал (рис. 2в): Au@SiO₂ +13,3 мВ; после двойной загрузки MTX-FA — −19,7 мВ (желаемый диапазон ±20 мВ для электростатическо-стерической стабилизации). MTX (pKa 3,8, 4,8) и FA (pKa 3,5, 4,3) при pH 7,4 депротонированы (карбоксилаты) → отрицательный заряд, подтверждающий конъюгацию.

TEM (рис. 3): AuNPs — темные сферы на сером слое SiO₂. Родные Au@SiO₂ — однородные сферы ~25 нм.

Загрузка лекарств

Фолат медиатор рецептор-мединированного эндоцитоза в клетках с переэкспрессией FR, преодолевая низкую интернализацию AuNPs. FR — опухолевой маркер, фолат все чаще для таргетирования. После конъюгации MTX-FA зета с +13,3 на −19,7 мВ (pH 7,4 > pKa → депротонация двух карбоксиловых групп каждого лекарства) — подтверждение успешной загрузки. DLE: FA 22,6%, MTX 77,5% (рис. 2г — хроматограмма). Литература: загрузка MTX на AuNPs 18/30 нм — 15±0,4% и 10±1,0%. Наши данные выше.

Клеточный захват

Внутриклеточные фототермические агенты повышают эффективность PTT. Изучали роль FA как таргетирующего агента и эффект покрытия на захват Au@SiO₂. MCF-7 и MDA-MB-231 обрабатывали свободными Au@SiO₂ и MTX-FA-Au@SiO₂.

Цитометрия (рис. 4): захват Au@SiO₂ растет во времени в обеих линиях. После декорирования MTX-FA захват значительно увеличивается в обеих линиях (FR+). Захват MTX-FA-Au@SiO₂ в MDA-MB-231 > MCF-7 (более высокое FR → больше рецептор-мединированного эндоцитоза). Литература: фолат-конъюгированные NPs интернализаются только в раковых клетках с высоким FR, не в здоровых. Конъюгация Au@SiO₂ с FA усиливает захват NPs и MTX → повышенная токсичность к MDA-MB-231.

Флуоресцентная микроскопия (рис. 5): визуально подтверждает более яркую флуоресценцию (больше NPs) в MDA-MB-231 при MTX-FA-Au@SiO₂ vs свободные Au@SiO₂.

Цитотоксичность (МТТ, рис. 6)

Свободный MTX, пустые Au@SiO₂, MTX-FA-Au@SiO₂ — 24/48/72 ч. Au@SiO₂ не цитотоксичны. Сравнение при равных концентрациях MTX (25–200 мкг/мл): свободный MTX и MTX-FA-Au@SiO₂ дают 10–25% смертность за 24 ч. Литература: AuNPs проявляют пролиферативный эффект на некоторых линиях (MC3T3-E1, стволовые пародонта). Наши данные: свободные Au@SiO₂ стимулируют пролиферацию (рис. 6а, б). Равная цитотоксичность MTX и MTX-FA-Au@SiO₂ может быть связана с этим феноменом.

Лазерное облучение (LLLT, рис. 7)

Жизнеспособность MCF-7 и MDA-MB-231 после Au@SiO₂ или MTX-FA-Au@SiO₂ + LLLT (30–105 Дж/см²). Смертность при MTX-FA-Au@SiO₂ (MTX 100 мкг/мл) + 75 Дж/см²: MCF-7 ~39%, MDA-MB-231 ~45,5%. При тех же условиях Au@SiO₂+лазер или только лазер — нет явной цитотоксичности. При 105 Дж/см² смертность 60–75% для обеих линий; Au@SiO₂+лазер или лазер один — нет эффекта. IC₅₀ комбинации (MTX 100 мкг/мл): MCF-7 — 90 Дж/см², MDA-MB-231 — 75 Дж/см². Без лазера при MTX 100 мкг/мл смертность 15–25%. Комбинация MTX-FA-Au@SiO₂ + LLLT показывает синергистический эффект, значимо снижая жизнеспособность (p<0,001) vs только лазер. Таргетированные NPs повышают эффективность лазерной терапии.

Апоптоз (DAPI, рис. 8)

Изучали MCF-7 и MDA-MB-231 после: Au@SiO₂; MTX-FA-Au@SiO₂ ± лазер. Контроль, только лазер, свободные Au@SiO₂ без лазера — типичные ядра, нет апоптоза. Свободный MTX, Au@SiO₂+лазер, MTX-FA-Au@SiO₂ без лазера — частичные апоптотические ядра. MTX-FA-Au@SiO₂ + лазер (810 нм, 75 Дж/см², 139 с) — масштабное падение популяции клеток, высокая фрагментация ядер, полное разрушение. Новые MTX-FA-Au@SiO₂ NPs усиливают фототермический эффект.

Клеточный цикл (рис. 9)

Распределение по фазам (PI, цитометрия) после MTX, Au@SiO₂, MTX-FA-Au@SiO₂ ± LLLT (75 Дж/см²). Контроль — активная S-фаза. Только лазер — незначительное снижение S-фазы, значимый рост G0/G1 (безопасность LLLT). NPs один — нет нарушений. Свободный MTX ± лазер — нарушения (снижение S). MTX-FA-Au@SiO₂ один — снижение S. MTX-FA-Au@SiO₂ + лазер — выраженное накопление в subG0/G1 (маркер апоптоза). В MDA-MB-231 subG0/G1 ~18% vs MCF-7 ~12% (p<0,05) — коррелирует с более высоким захватом NPs.

Литература: LLLT увеличивает S и G2/M в опухолевых клетках, снижает пролиферацию, индуцирует старение. LLLT (15 Дж/см²) — G1 арест (согласуется с нашим «только лазер»). PTT в основном задевает S-фазу, увеличивает G2/M арест → радиосенсибилизация. Наши данные: нарушение цикла, снижение S, рост апоптотической субG0/G1 после комбо-терапии. Комбинация LLLT + таргетированных MTX-FA-Au@SiO₂ усиливает терапию рака груди.

Заключение

Разработаны MTX-FA-Au@SiO₂ NPs для таргетированной терапии рака груди в комбинации с LLLT (неинвазивный, FDA-утвержденный лазер). Частицы: сферические, ~25 нм, ζ=−19,7 мВ — подходящие для биодистрибуции. Таргетирующая стратегия подтверждена: более высокий захват в MDA-MB-231 (высокое FR) vs MCF-7. МТТ, DAPI, клеточный цикл показывают синергистический эффект комбо-терапии: значимый рост цитотоксичности и апоптоза, особенно в MDA-MB-231 (p<0,001). Поскольку Au@SiO₂ и LLLT отдельно не цитотоксичны, эффект синергистичен на мишени. Результаты полезны для проектирования будущих программ био-химиотерапии с низкоуровневыми лазерами.