Оптимизированная доставка митоксантрона с помощью наночастиц пуллана, модифицированных холестерином: размерозависимая антиопухолевая эффективность против рака мочевого пузыря

Аннотация

Улучшение доставки химиотерапевтиков с помощью наночастиц может снизить системные дозы и уменьшить токсичность. В этом исследовании мы спроектировали холестерин-замещенные пуллановые полимеры (CHP) для загрузки митоксантрона и систематически варьировали гидрофобную замещение для генерации наночастиц (НЧ) различных размеров. Три CHP — CHP-1 (6,82% холестерина, 86,4 нм), CHP-2 (5,78% холестерина, 162,3 нм) и CHP-3 (2,74% холестерина, 222,3 нм) — характеризовали ¹H NMR и динамическим рассеянием света. Высвобождение митоксантрона в фосфатно-буферном растворе (ФСБ, pH 7,4) за 48 ч достигло 38,7%, 42,4% и 58,9% для CHP-1, CHP-2 и CHP-3 соответственно. Кислая среда (pH 4,0) ускоряла высвобождение, особенно для крупнейших частиц (75,5% через 48 ч). In vitro, НЧ CHP-3 проявили наивысшую цитотоксичность (IC₅₀ = 0,25 мкМ при 24 ч) и индуцировали наивысшую апоптоз и ингибирование миграции в клетках рака мочевого пузыря MB49. Эти результаты демонстрируют, что более крупные, холестерин-богатые CHP усиливают загрузку препарата, удерживают высвобождение и улучшают антиопухолевую активность.

Введение

Традиционная химиотерапия страдает от неспецифического распределения и тяжелых побочных эффектов, особенно кардиотоксичности антрациклинов, таких как митоксантрон. Наночастицы-носители могут использовать эффект усиленной проницаемости и удержания (EPR) для преференциального накопления в опухолевой ткани, тем самым улучшая терапевтический индекс. Пуллан — нетоксичный, биодеградируемый полисахарид — может стать аmphифильным путем прививки гидрофобного холестерина через сукциновый спейсер, давая самособирающиеся наносферы с гидрофобным ядром для инкапсуляции препарата.

Размер наночастиц критически влияет на клеточный захват, высвобождение препарата и биодистрибуцию. Оптимальный эндоцитоз обычно происходит для частиц в диапазоне 25–50 нм, в то время как более крупные частицы могут дольше циркулировать в крови и постепеннее высвобождать полезную нагрузку. Настоящая работа исследует, как варьирование холестериновой замещенности — а значит размера НЧ — модулирует высвобождение митоксантрона и антиопухолевую эффективность.

Материалы и методы

Реактивы

Митоксантрон (Aladdin Chemistry), пуллан, сукциновый ангидрид холестеринового эфира (CHS) и другие реактивы приобретены у стандартных поставщиков. Диализационные мембраны (МП 8–12 кДа) использовали для загрузки препарата.

Синтез и характеризация CHP

Пуллан (0,5 г) реагировали с CHS (молярные соотношения загрузки 0,20, 0,15, 0,05 ммоль ммоль⁻¹) в ДМСО под активацией DMAP и EDC. Полученные CHP выпадали в этаноле, очищали и сушили. ¹H NMR (DMSO-d₆) подтвердило прививку холестерина и количественно определило степень замещения (DS) используя пик метилена при 2,53 ppm. Значения DS: 6,82% (CHP-1), 5,78% (CHP-2) и 2,74% (CHP-3).

Подготовка НЧ с загруженным препаратом

Митоксантрон (4 мг) инкорпорировали в каждый CHP (40 мг) диализом против ФСБ. Финальные НЧ лиофилизировали, редиспергировали в воде и анализировали передаточной электронной микроскопией (ТЭМ) и динамическим рассеянием света (ДРС). Дзета-потенциал был −1,12 мВ.

In vitro высвобождение

НЧ инкубировали в ФСБ (pH 7,4), ацетатном буфере (pH 6,8) и цитратном буфере (pH 4,0) при 37 °C. Высвобождение препарата количественно определяли УФ-виз спектрофотометрией на 490 нм, и кумулятивные проценты высвобождения (Q%) рассчитывали за 48 ч.

Клеточные исследования

Муриновые клетки рака мочевого пузыря MB49 культивировали в DMEM + 10% ФСС. Цитотоксичность измеряли МТТ при 24, 48 и 72 ч; значения IC₅₀ выводили из доза-зависимых кривых. Апоптоз оценивали методом Annexin V/PI окраски и потоковой цитометрией. Миграцию клеток оценивали тестом на заживление царапины, с анализом изображений в ImageJ.

Результаты и обсуждение

Структурное подтверждение CHP

¹H NMR спектры показывали характерные сигналы пуллана и новые пики (0,40–2,40 ppm), подтверждающие прививку холестерина. Расчетные DS соответствовали намеченным соотношениям загрузки, подтверждая контролируемую замещенность.

Размер и морфология НЧ

Пустые CHP образовывали наночастицы 79,1, 104,9 и 166,8 нм для CHP-1, CHP-2 и CHP-3 соответственно. При загрузке препарата размеры увеличились до 86,4, 162,3 и 222,3 нм, отражая инкапсуляцию препарата в гидрофобное ядро. ТЭМ изображения выявили равномерные сферические частицы.

Загрузка препарата и высвобождение

Эффективность загрузки составила 88,9% (CHP-1), 82,3% (CHP-2) и 50,7% (CHP-3). Профили высвобождения показывали удерживаемое высвобождение при нейтральном pH, с более крупными частицами высвобождающими больше препарата за 48 ч. Кислые условия ускоряли высвобождение: при pH 4,0 кумулятивное высвобождение достигло 75,5% для CHP-3.

Антиопухолевая активность

МТТ тесты выявили IC₅₀ значения 0,25 мкМ (CHP-3) при 24 ч, по сравнению с 0,20 мкМ (CHP-2) и 0,06 мкМ (свободный митоксантрон). Апоптоз тесты подтвердили более высокие ранние и поздние апоптотические скорости для CHP-3, за которым следовали CHP-2 и CHP-1. Тесты миграции показали сопоставимую ингибирование свободным препаратом и НЧ, с CHP-3 достигающим наиболее выраженного эффекта.

Механистические инсайты

Превосходная эффективность более крупных CHP вероятно происходит из усиленного внеклеточного высвобождения препарата в кислой микросреде опухоли, в сочетании с улучшенным клеточным захватом через пиноцитоз. Стабильность гидрофобного ядра управляет кинетикой высвобождения, в то время как заряд поверхности остается нейтральным, благоприятствуя биодистрибуции.

Заключение

Холестерин-модифицированные пуллановые наночастицы демонстрируют размерозависимую загрузку препарата, высвобождение и антиопухолевую активность. Крупные, холестерин-богатые НЧ (CHP-3) обеспечивают превосходную доставку митоксантрона, достигают более высокой цитотоксичности и апоптоза, и более эффективно ингибируют миграцию клеток рака мочевого пузыря. Эти находки поддерживают дальнейшее развитие CHP как безопасных, биодеградируемых наноносителей для таргетной химиотерапии.