Оптимизация поглощения Fe3O4-Au core-shell наночастиц для таргетной эндоцитозы в клетках колоректального рака

Аннотация

Магнетит (Fe₃O₄)-золото (Au) core-shell наночастицы (НЧ) обладают уникальными магнитными и оптическими свойствами. В сочетании с биологическими моиетиями они предлагают новые стратегии для биомедицинских приложений: доставка лекарств и таргетинг рака. Представлен эффективный метод контролируемого клеточного поглощения магнитных core-shell НЧ с биологическими моиетиями. Виментин, структурный белок, биохимически подтвержден как мощно влияющий на фагоцитоз. Виментин влияет на интернализацию экзогенных материалов даже при множественном inhibировании биологических моиетий. В работе продемонстрирована клеточная интернализация Fe₃O₄-Au core-shell НЧ с поверхностной модификацией комбинацией биологических моиетий. Фотофлуоресценция виментин-маркированных НЧ оставалась неизменной при множественных тестах ингибирования, указывая на минимальное влияние нистатина, динасора, цитчалазина D и даже анти-Muc1 антител (Ab). Следовательно, анти-Muc1 Ab может таргетировать специфические молекулы и контролировать специфическую эндоцитозу. Показана возможность контроля специфической эндоцитозы в клетках колоректального рака.

Введение

Наноматериалы открыли новые пути для клинической диагностики и терапии. Особенно наночастицы (НЧ) — важнейшие инструменты для биосенсоров, диагностики, таргетных систем доставки лекарств. Для биомедицинских приложений НЧ обычно состоят из органических материалов на поверхности ядерных материалов. Ядерные материалы (магнитные, полупроводниковые и др.) имеют полезные физико-химические свойства, а внешняя органическая поверхность дает химическую стабильность и функциональность. Для биологического таргетинга критичны не только физико-химические свойства, но и биофункционализированная внешняя поверхность. Примерами таргетирующих моиетиев являются антитела или лиганды, специфичные для мишени. В зависимости от биофункционализированных материалов на внешней поверхности определяются механизмы эндоцитоза НЧ. Механизм входа НЧ в клетки — предмет множества исследований из-за важности для наномедицины.

Магнитные НЧ широко используются в таргетированных приложениях: сортировка клеток, МРТ, изоляция ДНК, доставка лекарств, гипертермическая терапия, таргетинг рака. Среди них магнетитовые нанокристаллы наиболее применяются в биомедицине благодаря биосовместимости и химической стабильности. Несмотря на усилия, остаются критические проблемы: хорошая диспергируемость в водных растворах, функциональность, биосовместимость. Для решения модифицируют поверхность НЧ функциональными группами (карбоксил, амин). Однако прикрепление функциональных групп к магнетиту трудоемко. Core-shell Au-покрытые магнитные НЧ привлекательны, так как Au поверхность легко связывается с биомолекулами и органическими материалами.

Магнитные свойства магнитного ядра-Au оболочки позволяют магнитную сепарацию, повышают разрешение МРТ, применимы к гипертермической терапии. Превосходные химические свойства золота полезны для построения рецептор-медированных систем доставки для специфического таргетинга рака.

За последние десятилетия многие исследовали рецептор-медированные системы доставки для таргетинга рака. Рецептор-медированный таргетинг — форма активного таргетинга. Выбор мишени ключевой для эффективности, мишени должны быть сверхэкспрессированы на внеклеточной мембране. Часто используют монохлоны антител для лечения рака, терапевтический эффект возрастает при комбинации с химиотерапией. Но монохлоны имеют ограничения: большой размер (~150 кДа) препятствует проникновению в опухоль, низкая стабильность и растворимость, неоднородное направление прикрепления к носителю. Для улучшения проникновения разработаны различные форматы антител. Уникальный формат есть у верблюдовых: тяжелоцепные антитела (HCAbs) в периферической крови и молоке. Антигенсвязывающие фрагменты HCAbs состоят из одного домена — тяжелоцепной переменной области (VH) верблюжьего HCAb (VHH). Рекомбинантный VHH (нанободи) имеет молекулярный вес 11–15 кДа — наименьшее среди всех мАб. Малый размер делает их подходящими для таргетинга антигенов в изолированных локациях, легко модифицируемый терминальный конец привлекателен для таргетинга рака.

Эффективная доставка НЧ с подходящим таргетингом и интернализацией также важна. Виментин играет важную роль как компонент прикрепления патогенов и внутриклеточных путей входа. Силенсирование гена виментина ингибирует фагоцитоз, а кливажий виментин — сигнал, значительно увеличивающий фагоцитоз. Нейтрализация резистентности к фагоцитозу, вызванной виментином на поверхности клетки, важна для эффективной доставки НЧ.

В этом исследовании изучаются пути эндоцитоза нанободи-маркированных Fe₃O₄-Au core-shell НЧ, модифицированных PEG (полиэтиленгликоль) спейсерами разной длины. Виментин, сильно влияющий на фагоцитоз, использовался как контроль, подтверждено его эффективное действие на интернализацию НЧ. Muc1 — гликопротеин клеточной поверхности, сверхэкспрессированный в различных раках (поджелудочной, груди, легких, желудка), используется как биомаркер таргетинга рака. Подтверждена эффективная интернализация Fe₃O₄-Au core-shell НЧ и методы контролируемого таргетинга к раковым клеткам через Muc1-рецептор-медированную эндоцитозу в колонических клетках.

Материалы и методы

Материалы

Золото(III) ацетат (Au(OOCCH₃)₃, 99,9%) — Alfa Aesar. Железо(III) ацетилаценат (Fe(acac)₃, 99,9%), 1,2-гексадекандиол (C14H29CH(OH)CH2(OH), 90%), блок-кополимер PEG-PPG-PEG, октиловый эфир (C8H17OC8H17, 99%) — Sigma-Aldrich. OPSS-PEG-NHS (2K, 5K, 10K) — Nanocs. Бикарбонат натрия, WST-1, хлорпромазин, нистатин, цитчалазин D, динасор, brefeldin A (BFA), монензин, трипан-синий — Sigma-Aldrich. Cy3 и Cy7.5 — Lumiprobe. Анти-Muc1 Ab — Abcam Inc. (Cambridge, MA). Фосфатно-буферный раствор (PBS), DMEM, фетальная телячья сыворотка — Invitrogen Corp.

Синтез Fe₃O₄-Au core-shell НЧ

Синтез методом наноэмульсии в два этапа: (1) формирование Fe₃O₄ ядра, (2) покрытие Au оболочкой на магнитных НЧ. Этап 1: Fe₃O₄ НЧ из смеси Fe(acac)₃ (0,1766 г или 0,5 ммоль), 1,2-гексадекандиола (0,6468 г или 2,5 ммоль), блок-кополимера PEO-PPO-PEO (0,4–1,2 г) в октиловым эфире. Нагрев 300 °C для восстановления Fe предкурсора. Охлаждение завершает формирование ядра. Этап 2 без очистки: предкурсоры Au (0,2338 г или 0,62 ммоль) и 1,2-гексадекандиол (0,88 г, 3,4 ммоль) в эмульсию с Fe₃O₄ НЧ, нагрев 230 °C. После охлаждения центрифугирование, разделение core-shell НЧ.

Конструирование рекомбинантного вектора экспрессии анти-Muc1-VHH 5-24 K10

ПЦР с прямым праймером 5′-CCGAATTCGCCGATGTGCAGCTGACCGAG-3′ и обратным 5′-CGG CTCGAGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTGCCTGAGGAGACGGTGACCTG-3′. Продукт ПЦР разрез EcoRI и XhoI, гель-очистка QIA quick Gel Extraction Kit. Клонирование в EcoRI/XhoI-разрезанный pET-23a (Novagen). Трансформация E. coli DH5α тепловым шоком, селекция на LB-агаре с ампициллином 100 мкг/мл.

Экспрессия и очистка рекомбинантного белка

Для экспрессии и очистки анти-Muc1-VHH 5-24 K10: E. coli BL21 трансформировали pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10. Выращивали в LB с ампициллином 100 мкг/мл. Индукция IPTG (0,4 ммоль) 5 ч при 37 °C. Пеллеты ресуспендировали в лизис-буфере (50 мМ NaH₂PO₄, pH 8,0; 300 мМ NaCl), соникация на льду 10 мин. Центрифугация 20 000×g 20 мин 4 °C, Ni-NTA His·Bind Resin (Peptron). His-маркированные белки элюировали буфером с 150 мМ 이미дазолом. Очищенный белок на 15% SDS-PAGE.

Модификация core-shell Fe₃O₄-Au НЧ

OPSS-PEG-NHS разной длины (2, 5, 10 K) растворяли в 0,1 М бикарбонате натрия для активации тиол-групп. Активированный OPSS-PEG-NHS добавляли к синтезированным core-shell НЧ, агитировали 12 ч при 4 °C. Тиол-группы ковалентно связывались с Au оболочкой. Затем раствор нанободи (0,25 мг/мл) добавляли к PEGилированным НЧ на 12 ч при 4 °C. Амин-группы десяти лизинов (K) на терминале ковалентно связывались с NHS-группами OPSS-PEG-NHS при pH 8,3. Cy3 и Cy7.5 маркировали остаточные амин-группы нанободи.

Кривая интернализации

CT26 клетки (5×10³ на колбу) в 96-колбовой пластинке с прозрачным дном, инкубация 24 ч при 37 °C, 5% CO₂ в темноте. Среда заменена на 250 мкл свежей с 50 мкг/мл Cy3-маркированных Fe₃O₄-Au НЧ, PEG-Cy3 или PEG-нанободи-Cy3 НЧ. Инкубация разные периоды (0, 10, 20, 30, 60, 120, 360 мин). Промывка 3× PBS, флуоресценция измерялась SpectraMAX GEMINI с трипан-синим как мембрано-непроницаемым квинчером. Эксперименты с равными количествами НЧ (50 мкг/мл), повторены 3 раза.

Тест ингибирования

CT26 клетки (5×10³/колба) 24 ч при 37 °C, 5% CO₂ в темноте. Среда заменена на 250 мкл со следующими ингибиторами на 1 ч: 20 мкг/мл хлорпромазина (CPZ), 50 мкг/мл нистатина, 20 мкг/мл цитчалазина D, 25 мкг/мл динасора, 20 мкг/мл BFA, 140 мкг/мл монензина, 5 мкМ анти-Muc1 Ab. Затем среда заменена на 250 мкл с 50 мкг/мл Cy3-маркированных Fe₃O₄-Au НЧ, PEG-Cy3 НЧ, PEG-нанободи-Cy3 НЧ или виментин-Cy3 НЧ. Инкубация 1 ч при 37 °C, 5% CO₂. Промывка 3× PBS, флуоресценция измерялась с трипан-синим. Эксперименты с равными НЧ (50 мкг/мл), повторены 4 раза.

Результаты и обсуждение

Core-shell НЧ синтезированы опубликованным методом. TEM (Рис. 1a,b): сферические, средний диаметр 13,5 нм, узкое распределение размеров.

Увеличение от ~8,5 нм ядра (Fe₃O₄) из-за ~2,5 нм толщиной Au оболочки. HRTEM с FFT анализом в доп. инф. Рис. S1. Продукт в органическом растворити очищен магнитной сепарацией, перенесен в воду. Core-shell НЧ хорошо диспергированы и стабильны в воде без модификации поверхности благодаря остаточным блок-кополимерам. Рис. 1c,d: НЧ в воде до и после магнитного поля — от гомогенной дисперсии к прозрачному раствору. UV-Vis (Рис. 1e): пик абсорбции ~530 нм — наличие Au на поверхности (EDX данные в доп. инф. Рис. S2). Магнитные гистерезисные петли (Рис. 1f): оба НЧ суперпарамагнитны с коэрцитивностью ~0 Э при комнатной температуре. Восприимчивость core-shell НЧ выше магнетита, возможно из-за эффектов близости и уникальных пространственных конфигураций. Насыщенная намагниченность ядра ~37 эму/г, core-shell ~21 эму/г при 10 кЭ — разница из-за немагнитного Au.

Ген VHH 5-24 K10 клонирован в pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10 после ПЦР (Рис. 2a). Рекомбинантный белок экспрессирован в E. coli BL21 с pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10 после индукции IPTG и очистки Ni-NTA. Рекомбинантный анти-Muc1-VHH 5-24 K10 легко экспрессирован как растворимый 18-кДа белок. Из 1 л культуры получено 1±0,5 мг очищенного белка.

Очищенный белок верифицирован 15% SDS-PAGE, Coomassie blue — >95% чистота (Рис. 2b). Синтезированные Fe₃O₄-Au НЧ модифицированы тремя этапами: PEGилирование, антител-ярлыкирование, маркировка красителем (Рис. 2c). После каждого этапа измеряли дзета-потенциал для подтверждения. Таблица 1 показывает влияние модификации на дзета-потенциалы. Дзета голых core-shell НЧ: −19,8±6,68 мВ. PEGилирование OPSS-PEG-NHS разной длины (2K, 5K, 10K) для нанокомплексов разного размера. После PEGилирования дзета снизились: −44,9±8,19 мВ (2K), −40,7±7,88 мВ (5K), −39,6±8,74 мВ (10K). После нанободи-ярлыкования дзета повысились: −38,5±5,61 мВ (2K), −23,3±8,61 мВ (5K), −31,8±7,37 мВ (10K). После красителя-дзета: −12,5±7,25 мВ (2K), −17,7±3,94 мВ (5K), −10,6±4,72 мВ (10K). Снижение дзета после PEGилирования (~−40 мВ) указывает на ковалентную связь PEG с Au оболочкой (отрицательно заряженные NHS группы). Повышение после красителя (например, −38,5 → −12,5 мВ для 2K) логично: рекомбинантный нанободи имеет 10 лизиновых хвостов на терминале. Каждый тип нанободи категоризирован дзета-потенциалом, флуоресценция для определения связывания антител.

Рис. 3: все типы НЧ и нанободи хорошо интернализацируются в отсутствие ингибиторов. Кривая интернализации из флуоресценции при 50 мкг/мл Cy3-маркированных Fe₃O₄-Au НЧ, PEG-Cy3 НЧ, PEG-нанободи-Cy3 НЧ за разные периоды (0–360 мин) после удаления среды, промывки, измерения суммарной флуоресценции с трипан-синим.

По интенсивности флуоресценции: НЧ интернализацируются в клетки за 1 ч (Рис. 3a). Максимум за 1 ч, затем постепенное снижение в стационарном состоянии. Небольшая временная разница в зависимости от наличия Ab, но интенсивность не значимо отличается от голых НЧ (Рис. 3b). Рис. 3c: эффект гетерогенных Ab Muc1 и виментина пренебрежим для клеточного поглощения и интернализации НЧ.

WST-1 анализ живучести CT26 клеток в зависимости от концентрации и модификации поверхности Fe₃O₄-Au core-shell НЧ при разных времени экспозиции (Рис. 4a,b). Живучесть не показывает значимых различий после 24 и 48 ч, ни при варьировании доз, ни после модификации. Живучесть >90% и для голых, и для модифицированных НЧ.

Рис. 5: НЧ входят в CT26 клетки через различные пути эндоцитоза (клатрин-зависимый, кавеола-зависимый, фагоцитоз/макропиноцитоз). Интересно, Рис. 5b: анти-Muc1 Ab также в основном влияет на эндоцитоз PEG-нанободи-Cy3 НЧ. Для понимания путей использовали специфические химические ингибиторы (Рис. 5). Пути эндоцитоза делятся на три типа: клатрин-зависимый, кавеола-зависимый, макропиноцитоз/фагоцитоз.

Ингибиторы: CPZ (клатрин-зависимый), нистатин (кавеола-зависимый), динасор (динамин), цитчалазин D (фагоцитоз/макропиноцитоз), BFA (разрушитель аппарата Гольджи), монензин (ингибитор лизосом), анти-Muc1 Ab (рецептор-/транспортер-специфичный конкурент) инкубировали с клетками 1 ч. CPZ, нистатин, динасор, цитчалазин D влияли на эндоцитоз НЧ (Рис. 5a).

Таргетирующее моиети — ключ к успеху таргетинга рака, критически важно в терапии. Для таргетинга эффективная модификация поверхности важна для повышения терапевтической эффективности и ограничения побочных эффектов. Нанободи-маркированные Fe₃O₄-Au core-shell НЧ успешно получены из синтезированных НЧ и рекомбинантного нанободи. Таблица 1 подтверждает успешность каждого этапа модификации.

Живучесть клеток — важный элемент биологического применения наноматериалов. Живучесть >90% для голых и модифицированных НЧ (Рис. 4a,b). Результаты подразумевают, что голые и модифицированные НЧ не вызывают значимой концентрационной- и модификационно-зависимой цитотоксичности, модифицированные НЧ пригодны для биологического применения.

Изучение эффективности интернализации и эффекта ингибиторов дает важную информацию о механизмах входа НЧ в клетки. PEGилированные НЧ интернализацируются медленнее голых, но нанободи-маркированные — немного быстрее голых (Рис. 3a,b). PEGилирование — известный метод предотвращения интернализации, тенденция понятна. Нанободи индуцирует эндоцитоз НЧ. Для проверки специфичности нанободи подтвердили скорость интернализации виментин-Ab-маркированных НЧ. Интересно, виментин-Ab-маркированные НЧ не способствовали клеточной интернализации (Рис. 3c).

Результаты указывают, что нанободи эффективно индуцирует интернализацию наноматериалов в CT26 муцин-клетки и внутренняя тенденция может контролироваться специфической модификацией внешней мембраны НЧ. Механизмы эндоцитоза нанободи-маркированных НЧ показаны через тесты ингибирования и конфокальную микроскопию. Фотофлуоресценция нанободи-маркированных и немаркированных НЧ показывала похожие снижения при CPZ, нистатине, динасоре (Рис. 5a,b). CPZ, нистатин, динасор ингибируют соответственно клатрин-, кавеола-зависимый эндоцитоз и динамин (большой GTPаза, вовлеченный в отпочкование и сколл везикул). Флуоресценция в обоих случаях падала быстро, так как динамин тесно связан с производством везикул для клатрин- и кавеола-зависимого эндоцитоза. На Рис. 5a оба немаркированных (5a) и нанободи-маркированные (5b) НЧ показывали быстрое падение флуоресценции.

В частности, нанободи-маркированные НЧ показывали значимо более низкие значения флуоресценции при CPZ, нистатине, динасоре. К тому же, немаркированные НЧ сильнее влияли цитчалазин D (токсин, блокирующий полимеризацию актиновых филаментов для фагоцитоза). Это подразумевает, что немаркированные НЧ интернализацируются через множественные механизмы: клатрин-, кавеола-зависимый эндоцитоз и фагоцитоз. Следовательно, клеточная интернализация нанободи-маркированных НЧ зависит от клатрин- и кавеола-зависимого эндоцитоза. Кроме того, клеточное поглощение нанободи-маркированных НЧ значительно снижалось при культивировании с анти-Muc1 Ab (Рис. 5b). Это показывает, что свободное анти-Muc1 Ab выступает конкурентом нанободи на модифицированных НЧ для прикрепления к мембране CT26 клеток и играет важную роль в интернализации модифицированных НЧ. Особенно, виментин-Ab-маркированные НЧ показали явные отличия от нанободи-маркированных по ингибирующей способности. Фотофлуоресценция виментин-маркированных НЧ оставалась неизменной при множественных тестах ингибирования, указывая на минимальное влияние нистатина, динасора, цитчалазина D и даже анти-Muc1 Ab. Это явление может свидетельствовать об эффективности виментина, биохимически подтвержденного как мощно влияющего на фагоцитоз. Следовательно, анти-Muc1 Ab может таргетировать специфические молекулы и контролировать специфическую эндоцитозу.

Рис. 6: аналогичные результаты при обработке клеток Cy7.5-маркированными голыми core-shell НЧ и PEG-нанободи-маркированными НЧ, показывая похожее клеточное поглощение в отсутствии ингибирования динасором. Ингибирование динасором вызывало определенно более низкую интернализацию PEG-нанободи-маркированных НЧ по сравнению с голыми (Рис. 6b, нижний ряд). Это подразумевает два механизма эндоцитоза: неспецифический для голых НЧ и ограниченный для нанободи-маркированных через динамин. После прикрепления нанободи к внешней мембране, нанободи-маркированные НЧ легко проходят через мембрану за счет одновременной активации клатрин- и кавеола-зависимых механизмов. Следовательно, основные механизмы — клатрин- и кавеола-зависимый эндоцитоз для интернализации нанободи-маркированных НЧ в CT26 муцин-клетках.

Заключение

Наноматериалы для таргетинга рака и контролируемой вставки экзогенных материалов (лекарства, гены, пептиды) — критические достижения в биомедицине. Эти знакомые, но творческие концепции предлагают стратегии для новых терапевтических методов. В работе продемонстрировано усиленное клеточное поглощение Fe₃O₄-Au core-shell НЧ после PEGилирования с анти-Muc1 антителом. Основные механизмы эндоцитоза нанободи-маркированных НЧ продемонстрированы, показана возможность контролируемой специфической эндоцитозы в клетках колоректального рака. Результаты дают понимание таргетинга между нанободи-маркированными НЧ и клетками колоректального рака для проектирования высокоэффективных таргетирующих носителей.

Доступность данных и материалов

Все данные, сгенерированные или проанализированные в этом исследовании, включены в опубликованную статью.

Аббревиатуры

Fe₃O₄:

Magnetite (магнетит)

Au:

Gold (золото)

NPs:

Nanoparticles (наночастицы)

Ab:

Antibody (антитело)

HCAbs:

Heavy-chain antibodies (тяжелоцепные антитела)

VHH:

VH of the camelid HCAb (VH верблюжьего HCAb)

PEG:

Poly(ethylene glycol) (полиэтиленгликоль)

PPG:

Poly(propylene glycol) (полипропиленгликоль)

PCR:

Polymerase chain reaction (полимеразная цепная реакция)

TEM:

Transmission electron microscopy (проходная электронная микроскопия)

PEO-PPO-PEO:

Poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide)-poly(ethylene oxide)

OPSS-PEG-NHS:

Orthopyridyl disulfide PDP PEG succinimidyl ester (ортопиридил дисульфид PDP PEG сукцинимидиловый эфир)

BFA:

Brefeldin A (брефельдин А)

CPZ:

Chlorpromazine (хлорпромазин)