Формо-зависимая инкубация золотых наноструктур в клетках глиобластомы: от синтеза к клеточному взаимодействию

Аннотация

Золотые наноструктуры (Au NS) с контролируемым размером и формой становятся универсальными инструментами наномедицины. Однако клеточная судьба разных геометрий остается слабо изученной, особенно для агрессивных раков вроде глиобластомы. Здесь синтезированы пять различных Au NS — наностержни (NR), тетрагексаэдры (THH), бипирамиды (BP), сферические частицы (SP) и новая форма, названная нано-макура (NM) — методом роста на семенах с бинарными поверхностно-активными веществами и модифицированным методом Туркевича. Все частицы функционализировали PEG-SH и 11-меркаптундекановой кислотой (MUA) для придания отрицательного заряда и стерической стабильности. Цитотоксичность (LIVE/DEAD) на клетках глиобластомы U-87 MG показала формо-зависимые эффекты: NM вызывала наибольшую гибель клеток (~20 % при 2 мг/мл), в то время как SP и BP оставались в основном нетоксичными. Передаточная электронная микроскопия показала, что NM входит в клетки рецептор-медированной эндоцитозом за 2 ч, а позже запускает макропиноцитоз, приводящий к везикулярному накоплению и отлучению клеток. Эти находки демонстрируют, что морфология частиц, а не только размер, управляет путями клеточного захвата и цитотоксическими исходами, позиционируя NM как перспективного кандидата для таргетной фототермической терапии и доставки лекарств при глиобластоме.

Введение

Золотые наноструктуры ценятся за формо- и размерозависимые оптические и электронные свойства, позволяющие приложения от биосенсоров до фототермической терапии. Локализованный поверхностный плазмонный резонанс (LSPR) в видимом — ближнем ИК диапазоне делает анизотропные частицы, особенно наностержни с высоким соотношением сторон, отличными контрастными агентами для КТ и фотоакустической визуализации. Меньшие наноструктуры демонстрируют превосходное поглощение, повышая фототермическую эффективность. Более того, анизотропные формы могут самоорганизовываться в суперструктуры, генерирующие интенсивные электромагнитные поля, полезные для поверхностно-усиленного Рамановского рассеяния и таргетной доставки лекарств.

Рост на семенах, часто с ионными серебром и смесями ПАВ (CTAB с олеиновой кислотой или DDAB), стал предпочтительным методом для настройки Au NS, так как позволяет точно контролировать соотношение сторон и рост граней. Несмотря на прогресс в синтезе, систематических исследований о том, как разные геометрии взаимодействуют с клетками — особенно глиобластомой, высокопролиферативным и инвазивным опухолем мозга — ограничено. Понимание этих взаимодействий необходимо для проектирования нанолекарств, селективно нацеливающихся на раковые клетки с минимальными внецелевыми эффектами.

Глиобластома мультиформе (GBM) остается самым летальным первичным опухолем мозга, со средней выживаемостью менее 15 месяцев несмотря на агрессивную терапию. Клетки глиобластомы-астроцитомы U-87 MG быстро пролиферируют (время удвоения ~32 ч) и легко интернализают чужие частицы, делая их идеальными для изучения захвата. Здесь представлено всестороннее сравнение пяти форм Au NS с фокусом на синтез, поверхностную функционализацию, цитотоксичность и механизмы захвата в клетках U-87 MG.

Эксперимент

Материалы

Все реактивы (олеиновая кислота, нитрат серебра, CTAB, HAuCl₄·3H₂O, ascorbиновая кислота, NaBH₄, PEG-SH, MUA и др.) приобретены у Sigma-Aldrich или Merck и использованы без дополнительной очистки. Растворы готовили на сверхчистой воде (18,2 МОм·см).

Синтез анизотропных Au NS

Семенные частицы (~5 нм) получали восстановлением HAuCl₄ с NaBH₄ в CTAB. Для наностержней, тетрагексаэдров и бипирамид раствора роста содержали CTAB, ко-ПАВ (олеиновая кислота или DDAB), AgNO₃ и аскорбиновую кислоту, нагревали до 80 °C. После охлаждения добавляли семенной раствор и HAuCl₄, смесь перемешивали при 35 °C 24 ч. Изменение соотношения олеиновая кислота/CTAB давало нужную морфологию: низкие соотношения давали наностержни «собачья кость», более высокие — удлиненные тетрагексаэдры, а комбинация CTAB/DDAB — бипирамиды. Для новой формы нано-макура применяли двухстадийный рост: первичная реакция на семенах с последующей второй стадией роста с использованием промежуточного раствора, образуя трехмерные неправильные частицы, напоминающие подушку (подушка = макура по-японски).

Синтез сферических Au NS

SP получали модифицированным методом Туркевича: 10 мМ раствор натриевого цитрата (10 мл) нагревали до 70 °C, затем капельно добавляли 1,5 мМ HAuCl₄ (10 мл). Смесь становилась пурпурно-красной через ~8 мин и охлаждали до комнатной температуры перед центрифугированием (14 500 об/мин, 10 мин).

Поверхностная функционализация

Частицы сначала инкубировали с PEG-SH (1 мг/мл) 2 ч для замещения CTAB и придания стерической стабилизации. После центрифугирования PEGилированные NS обрабатывали MUA (250 мкл 10 мМ в EtOH/H₂O) 1 ч при 55 °C, достигая полного удаления CTAB и отрицательного поверхностного заряда. Размер и дзета-потенциал контролировали DLS; XPS подтверждал удаление брома с поверхности.

Клеточная культура и тест живучести

Клетки U-87 MG культивировали в EMEM с 10 % FBS, 2 мМ L-глутамина, 1 % NEAA, 1 мМ пирувата натрия и 1,25 % гентамицина. Для цитотоксичности клетки при 70 % конфлюэнтности инкубировали с Au NS при 100, 200, 500 мкг/мл и 2 мг/мл 24 ч. Гибель клеток количественно определяли тестом LIVE/DEAD (кальcein AM и этидиев гомодимер-1) и окраской ядер Hoechst, визуализируя на микроскопе Zeiss Axiovert 200 M. Анализировали три независимых колодца на концентрацию.

Временнозависимое изучение захвата (NM)

Клетки экспонировали 2 мг/мл NM на 2, 6, 12 и 24 ч. После инкубации клетки фиксировали 2 % параформальдегидом и 2,5 % глютаральдегидом, пост-фиксировали тетраоксидом осмия (± цианидом калия), дегидратировали и встраивали для ультротонких (70 нм) TEM-срезов. TEM-изображения использовали для отслеживания локализации и морфологии NM внутри клеточных компартментов.

Характеризация

Ярко-польное STEM и HRTEM (JEOL 2100, 200 кВ) оценивали морфологию и кристалличность. УФ-Вис спектры (200–800 нм) регистрировали на Shimadzu UV-2401PC. Динамическое световое рассеяние и дзета-потенциал измеряли на Malvern Zetasizer Nano-ZS. XPS выполняли на спектрометре Kratos Axis Ultra DLD (Al Kα, 1486,6 эВ).

Результаты и обсуждение

Синтез и характеристика анизотропных Au NS

Рост на семенах с бинарными ПАВ дал высокий выход наностержней (~20 нм × 50 нм), тетрагексаэдров (~50 нм длина ребра) и бипирамид (~200 нм). Частицы нано-макура показали уникальную трехмерную неправильную морфологию, подтвержденную TEM при множественных ориентациях. HRTEM выявил однокристаллические ядра с гладкими гранями для NR, в то время как NM показывал зазубренные поверхности и более широкую полосу LSPR, отражающую их полидисперсию. УФ-Вис спектры продемонстрировали отдельные продольные и поперечные плазмонные пики: NR (516, 679, 796 нм), THH (~568 нм), BP (~593 нм), NM (~557 и 760 нм). SP показывали единичный пик при 520 нм.

Результаты поверхностной функционализации

DLS показал прирост размера после покрытия PEG-SH и MUA, кроме BP, где наблюдали незначительное уменьшение из-за более плотной упаковки. Дзета-потенциал сместился от положительного (CTAB-покрытые) к отрицательным (MUA-покрытые) значениям, подтверждая успешный обмен лигандами. XPS-спектры показывали пренебрежимое количество брома, указывая на почти полное удаление CTAB. Оптические спектры оставались в основном неизменными, с незначительным расширением пиков для анизотропных форм, приписываемым увеличению размера и шероховатости поверхности.

Формо-зависимая цитотоксичность

Тесты LIVE/DEAD выявили, что NM индуцирует наибольшую гибель клеток (~20 % при 2 мг/мл), тогда как SP и BP оставались <5 % цитотоксичными при всех концентрациях. NR, несмотря на высокое соотношение сторон и положительный заряд поверхности, не повышали гибель клеток относительно других форм, что предполагает, что дзета-потенциал может не точно отражать истинный локальный заряд на анизотропных частицах. В целом, размер играл второстепенную роль: как 15 нм SP, так и 650 нм BP показывали сопоставимый захват и токсичность.

Механизмы захвата нано-макура

Вреmennо-разрешенная TEM показала ассоциацию NM с плазматической мембраной через 2 ч, за которой следовала интернализация через рецептор-медированный эндоцитоз. При 12 ч везикулы с NM указывали на переход к макропиноцитозу, вероятно из-за агрегации и адсорбции белков. NM предпочтительно локализовались на периферии эндосом, выстраиваясь вдоль везикулярной мембраны, и трафиковали в перинуклеарную область. При 24 ч экстенсивное везикулярное накопление коррелировало с морфологическими изменениями: клетки теряли филоподии, становились округлыми и отлепали от субстрата, указывая на нарушение цитоскелета и а폽тоз.

Обсуждение

Эти результаты подчеркивают критическое влияние морфологии частиц на пути клеточного захвата. Хотя анизотропные формы могут улучшать оптические и фототермические свойства, их неправильная геометрия может также увеличивать формирование белкового коронника, способствуя макропиноцитозу и цитотоксичности. Частицы нано-макура с подушкообразной структурой достигли эффективной интернализации и значительной гибели клеток, делая их привлекательными кандидатами для терапии глиобластомы. Будущие исследования должны изучить биодистрибуцию in vivo и терапевтическую эффективность, а также функционализацию таргетными лигандами для улучшения селективности.

Заключение

Синтезированы пять золотых наноструктур различных форм и размеров, единообразно функционализированные PEG-SH и MUA для получения стабильных, отрицательно заряженных частиц. Форма, а не только размер, диктовала клеточный захват и цитотоксичность в клетках глиобластомы U-87 MG. Новая форма нано-макура продемонстрировала превосходную интернализацию, ведущую к значительной гибели клеток через рецептор-медированный эндоцитоз и последующий макропиноцитоз. Эти находки позиционируют нано-макура как перспективную платформу для комбинированной фототермической терапии и доставки лекарств в агрессивных опухолях мозга.

Аббревиатуры

AgNO₃

Нитрат серебра

Au

Золото

BF

Яркое поле

BPs

Бипирамиды

CTAB

Цетилтриметиламмоний бромид

DDAB

Дидецилдиметиламмоний бромид

DLS

Динамическое световое рассеяние

EMEM

Минимальное среда Эгла

EthD-1

Этидиев гомодимер-1

GBM

Глиобластома мультиформе

HAuCl₄

Хлорауриновая кислота

HRTEM

Высокоразрешающая передаточная электронная микроскопия

IR

Инфракрасный

LSPR

Локализованный поверхностный плазмонный резонанс

MUA

11-меркаптундекановая кислота

Na-citrate

Дигидрат натриевого цитрата

NM

нано-макура

NRs

Наностержни

Ns

Наноструктура

OA

Олеиновая кислота

PEG-SH

O-[2-(3-меркаптпропионамидо)этил]-O-этилполиэтиленгликоль

STEM

Сканирующая передаточная электронная микроскопия

TEM

Передаточная электронная микроскопия

THH

Тетрагексаэдры

UV-Vis

Ультрафиолетово-видимая спектроскопия

XPS

Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия