Наночастицы диоксида кремния, украшенные мембраной раковых клеток, содержащие miR495 и доксорубицин для преодоления лекарственной устойчивости для эффективной терапии рака легких

Введение

Недавние исследования предлагают накопление доказательств положительной корреляции между множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) и неэффективностью химиотерапии [1, 2]. Одним из наиболее широко известных механизмов МЛУ является переносчик АТФ-связывающей кассеты (ABC), среди которых наиболее изученным является P-гликопротеин (P-gp) [1, 3]. Было обнаружено, что P-gp может эффективно откачивать внутриклеточные химиотерапевтические препараты из клеток, что приводит к уменьшению накопления внутриклеточного лекарственного средства, что в результате приводит к снижению эффективности [4, 5]. Ингибирование P-gp продемонстрировало положительный эффект на преодоление МЛУ, который может быть потенциальной целью для борьбы с МЛУ.

МикроРНК (миРНК) представляют собой встречающийся в природе тип некодирующей РНК. Однако miRNA играет важную роль в регуляции клеточной трансфекции и экспрессии белков [6]. В результате было сообщено, что на экспрессию P-gp влияют различные miRNA, что зависит от типа опухоли [7]. Предыдущее исследование показало, что miR495 может эффективно подавлять экспрессию P-gp в клетках рака яичников и желудка с множественной лекарственной устойчивостью [8]. В данном исследовании miR495 был использован для дальнейшего изучения его роли в регуляции P-gp в клетках рака легких с множественной лекарственной устойчивостью.

Благодаря несравненным преимуществам, таким как значительное уменьшение побочных эффектов наряду с повышенной биодоступностью, системы доставки лекарств (DDS) выросли за последние десятилетия и были признаны альтернативой бесплатным лекарствам в доставке лекарств, особенно в терапии рака [9,10 , 11,12]. В результате разработка многофункциональных DDS, способных преодолевать сложные внеклеточные и внутриклеточные барьеры противораковой терапии и в то же время подходящих для загрузки различных видов лекарств, становится предметом исследований [13,14,15,16]. Наночастицы диоксида кремния (SLI), как один из наиболее широко применяемых кандидатов, обладают универсальными достоинствами, такими как простота приготовления, высокая способность загружать лекарство и хорошая биосовместимость, и являются предпочтительными наноносителями. Естественно, SLI использовался многими DDS в качестве наноносителя для достижения удовлетворительной эффективности [17, 18].

Однако доклинические исследования показали, что адресная доставка DDS также жизненно важна для успешной терапии рака. Для достижения лучшего эффекта нацеливания наиболее распространенным подходом является изменение лигандов нацеливания на поверхности DDS, которые могут связываться с соответствующими рецепторами на поверхности раковых клеток [16, 19, 20]. От малых молекул (молекулярная масса менее 1000 Да) до моноклональных антител (молекулярная масса более 10 кДа) эти нацеленные лиганды, как сообщается, успешно применяются для DDS [21,22,23]. Однако из-за эктогенной природы некоторых лигандов или по другим причинам возникали побочные эффекты, такие как иммунореакция и цитотоксичность. В последние годы клеточные плазматические мембраны становятся еще одним многообещающим материалом не только для модификации поверхности наночастиц, но и в качестве биосовместимого нацеливающего компонента. На основе взаимодействия гомологичной мембраны раковых клеток (CCM) с раковыми клетками было показано, что CCM значительно увеличивает способность DDS к самонаведению в опухоли [24, 25].

Чтобы объединить свойство CCM и P-gp, нацеленное на miR495, к опухоли, в одном DDS для коктейльной терапии рака легких (выбранной в качестве модельного рака в нашем исследовании), сначала был изготовлен положительно заряженный амин SLI и предварительно загружен доксорубицин (DOX ). В загруженный DOX амин SLI впоследствии загружали miR495 для образования ядра совместной доставки (SLI / R-D). Наконец, SLI / R-D украшали отрицательно заряженным CCM (полученным из клеток A549 / DOX) для получения DDS для совместной доставки и нацеливания на опухоль (CCM / SLI / R-D). Ожидалось, что CCM может специфически направлять CCM / SLI / R-D к гомогенной клетке A549 / DOX для усиления его направленного на опухоль эффекта и увеличения внутриклеточного поглощения. Между тем, выпущенный miR495 может преодолеть MDR A549 / DOX и достичь синергетического противоракового эффекта с DOX.

Материалы и методы

Материалы

Метилтиазолилтетразолий (МТТ), N - (2-аминоэтил) -3-аминопропилтриметоксисилан (AEAPS), тетраэтилортосиликат (TEOS), доксорубицин (DOX) и Triton X-100 были получены от Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). MiR495 предоставлен Cell Biolabs Inc. (Сан-Диего, Калифорния, США). Другие химические вещества и реагенты были получены от Aladdin Co., Ltd (Шанхай, Китай) и имели аналитическую чистоту.

Культура клеток и модель животных

Клеточные линии A549 (карцинома легких человека), A549 / DOX (линия DOX-устойчивых клеток) и NIH3T3 (эмбриональные фибробласты мыши) культивировали в среде DMEM с добавлением 10% (об. / Об.) Фетальной бычьей сыворотки (FBS), пенициллина (100%). Ед / мл) и стрептомицин (100 Ед / мл) в инкубаторе с постоянной температурой 37 ° C, содержащем 5% CO ₂ . A549 / DOX (линия клеток, устойчивых к DOX) была создана путем инкубации клеток A549 с постепенно увеличивающейся концентрацией DOX, как сообщалось [26]. Все клеточные линии культивировали по стандартному протоколу, как сообщалось ранее [27]. Самцы голых мышей Balb / c (~ 20 г) были получены из Института модельных животных Уханьского университета (Ухань, Китай) и выращивались по стандартным протоколам. Модель ксенотрансплантата опухоли A549 / DOX была создана на основе предыдущей статьи [28]. Все эксперименты на животных были одобрены институциональным комитетом по этике Третьей дочерней больницы Университета Сунь Йет-сена.

Модель сфероида многоклеточной опухоли

Сфероид многоклеточной опухоли (MCTS) был установлен на основании предыдущего сообщения [29]. Вкратце, 96-луночный планшет (Corning, США) покрывали автоклавированным раствором агарозы для создания гелевой подушки. После этого смешанные клетки A549 / DOX и NIH3T3 (1:1) высевали в планшет и инкубировали для образования MCTS. За образованием MCTS наблюдали с помощью оптического микроскопа (CX 23, Olympus, Япония).

Подготовка CCM / SLI / R-D

Изготовление аминового SLI было выполнено в микроэмульсии вода в масле на основе предыдущего сообщения [30]. Вкратце, содержащая DOX микроэмульсия вода в масле была изготовлена ​​при комнатной температуре. Затем AEAPS, TEOS и NH ₄ Последовательно добавляли ОН для запуска реакции. После реакции в течение 24 часов, аминовый SLI, нагруженный DOX, осаждали, используя избыточное количество этанола, и собирали с помощью центрифугирования (3000 об / мин, 10 мин).

MiR495 растворяли в буфере HEPES и по каплям добавляли в водный раствор нагруженного DOX амина SLI при различных соотношениях вес / вес (вес / вес) на вортексе для получения бинарных комплексов SLI / R-D [31].

Выделение CCM из клеток A549 / DOX было выполнено на основе предыдущего отчета [32]. Таким образом, клетки A549 / DOX были собраны и сконцентрированы с помощью центрифугирования. После этого клетки диспергировали в буфере для экстракции и дополнительно центрифугировали (10,000 g , 10 мин) с последующим вторым ультрацентрифугированием (100 000 g , 60 мин), чтобы окончательно получить ККМ. Все процедуры выполнялись при 4 ° C. Концентрация белка CCM была определена количественно с использованием набора BCA (Beyotime, Шанхай, Китай).

Покрытие CCM на SLI / R-D использовало протокол, аналогичный связыванию miR495. Таким образом, различные объемы раствора CCM были добавлены к SLI / R-D (1 мг / мл) на вортексе. Наконец, смесь обрабатывали ультразвуком (100 Вт, 5 мин), а затем центрифугировали (10000 g , 10 мин) для получения CCM / SLI / R-D.

Характеристика

Распределение по размерам и дзета-потенциал CCM / SLI / R-D оценивали с помощью Zetasizer (ZS90, Malvern, UK). Кроме того, для наблюдения за морфологией наноносителей был применен просвечивающий электронный микроскоп (ТЕМ, JEM1230, JEOL, Япония).

Связывающую способность SLI с miR495 изучали с помощью анализа задержки в геле с использованием «голой» miR495 в качестве контроля. SLI / RD, приготовленные с различными весовыми отношениями (0,2-25, SLI к miR495), загружали в 2% агарозный гель, содержащий Goldview (Solarbio Science &Technology Co., Ltd., Пекин), и подвергали электрофорезу в 0,5 × трис-борате. -EDTA буфер (90 В, 60 мин). Визуализацию miR495 выполняли с помощью анализатора Gel-Pro (Genegenius, Syngene, UK).

Буфер для лизиса (Beyotime, Шанхай) использовали для точного определения общего белка из CCM, после чего набор BCA использовали для количественного определения концентрации. Затем образцы переносили на мембрану из поливинилиденфторида (ПВДФ). Наконец, мембрану окрашивали соответствующими первыми антителами (Abcam, США) и вторыми антителами (Abcam, США). Для визуализации использовался денситометр (E-Gel Imager, Thermo-Fisher, США).

Содержание загрузки лекарственного средства (DLC) CCM / SLI / R-D определяли путем выхода предварительно приготовленных наноносителей в метаноле в течение 48 часов. Образцы центрифугировали (10 000 об / мин, 30 мин), и супернатанты собирали для определения DOX с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) [33]. Загрузку miR495 определяли по УФ-поглощению при 260 нм (UV5Nano, МЕТТЛЕР ТОЛЕДО, Швейцария).

Изменения размера частиц CCM / SLI / R-D в PBS и плазме мышей регистрировали в каждый момент времени в течение 48 часов. Профиль выпуска DOX из CCM / SLI / R-D был исследован в соответствии с предыдущим отчетом [34].

Внутриклеточная трансфекция

Клетки A549 / DOX высевали в 6-луночные планшеты на 24 часа, а затем культивировали с CCM / SLI / miR495 (концентрации miR495, 1-25 нг / мл) в течение 48 часов. После этого клетки отделяли, собирали и подвергали вестерн-блоттингу экспрессии P-gp.

Внутриклеточную концентрацию препарата определяли согласно предыдущему отчету [23]. Вкратце, после обработки CCM / SLI / miR495 в течение различных интервалов времени клетки A549 / DOX инкубировали с DOX. Через заранее определенные интервалы времени (4 и 8 ч) клетки отделяли, собирали и диспергировали в 5 мл экстрагирующего раствора DOX (этанол 0,6 M HCl, 1:1, об. / Об.) С последующей обработкой ультразвуком при 400 Вт в ледяной бане. за 40 раз. Смесь оставляли при 4 ° C на 24 часа и центрифугировали при 12000 об / мин (4 ° C) в течение 10 минут. Супернатант собирали и измеряли содержание DOX, как описано выше.

Жизнеспособность ячейки

Эффект цитотоксичности свободных от лекарств наноносителей (10–200 мкг / мл) и CCM / SLI / RD (концентрация DOX 2–50 мкМ; концентрация miR495 10–250 нМ; молярное соотношение между DOX и miR495 фиксировалось на уровне 200) на клетках A549 / DOX в течение 48 ч определяли с помощью анализа 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромида (МТТ). Вариации уровня белков, связанных с апоптозом, также определяли с помощью вестерн-блоттинга.

MCTS диаметром 300–400 мкм инкубировали со средой, содержащей различные составы (концентрация DOX, 25 мкМ), при 37 ° C в течение 5 дней. Оптический микроскоп использовался для регистрации изменений диаметра MCTS.

Таргетинг на CCM / SLI / R-D in vitro и in vivo

Меченная FAM миРНК была адаптирована для создания DDS. Клетки A549 / DOX высевали в 6-луночные планшеты на 24 часа. Затем клетки инкубировали с избыточным CCM в течение 2 часов и добавляли SLC / siRNA и CCM / SLC / siRNA. Через установленные интервалы времени клетки собирали и определяли с помощью проточного цитометра (FCM, FC500MCL, Beckman Coulter) для количественной оценки.

Меченый Cy5 miR495 был использован для создания DDS. Мышей с опухолью A549 / DOX вводили внутривенно. вводили SLI / miR495 и CCM / SLI / miR495, и распределение miR495 контролировали в заранее определенные интервалы времени с использованием системы визуализации в реальном времени (ZEWTON 7.0, Vilber, France). После введения в течение 12 часов опухоли и основные органы были получены от умерщвленных мышей и визуализированы с использованием той же системы для аналитического анализа.

Противораковый анализ in vivo

Противоопухолевый анализ CCM / SLI / R-D in vivo оценивали с использованием мышей, несущих опухоль A549 / DOX. Подробно мышей случайным образом разделили на 5 групп ( n =6):(1) физиологический раствор (в качестве контроля), (2) свободный DOX, (3) CCM / SLI / DOX, (4) CCM / SLI / miR495 и (5) CCM / SLI / R-D. После этого мышам внутриопухолево вводили композиции в дозировке 5 мг / кг DOX и 0,25 мг / кг miR495 7 раз в течение 14 дней. Объем опухоли и масса тела мышей в каждой группе определялись каждые 2 дня.

Результаты и обсуждение

Подготовка CCM / SLI / R-D

Для достижения хорошей способности загружать лекарство и биосовместимости в одном DDS для изготовления SLI был использован синхронный гидролиз TEOS и AEAPS в микроэмульсии вода-в-масле. DOX был предварительно захвачен в матрицу SLI во время изготовления. Как показано на фиг. 1а, результат динамического светорассеяния (DLS) продемонстрировал, что аминовый SLI, нагруженный DOX, имел диаметр ~ 100 нм. Изображение ПЭМ также показало, что наночастицы имели сферическую форму с узким распределением, что соответствовало результатам, полученным DLS.

а Изменения размера и дзета-потенциала SLI / R-D при различных соотношениях вес / вес. б Анализ связывания miRNA бинарных комплексов SLI / R-D при различных весовых соотношениях. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение ( n =3)

Амин SLI, нагруженный DOX, имел поверхностный потенциал 26,83 мВ, что было полезно для использования в качестве носителя miR495. Согласно предыдущему отчету [31], сборка miR495 и SLI с образованием бинарных комплексов управляется электростатическим взаимодействием. W / w SLI к miR495 в бинарных комплексах оказывает значительное влияние на конечную эффективность трансфекции. Как показано на рис. 1а, из-за того, что miR495 представляет собой отрицательно заряженную макромолекулу, при низком мас. / Мас. Отношении SLI к miR495 бинарные комплексы показали отрицательный поверхностный заряд со значительно увеличенным размером частиц, что может быть связано с адгезия соседних наночастиц. Однако с увеличением отношения вес / вес поверхностный заряд бинарных комплексов постепенно становился положительным со стабильным размером частиц, наблюдаемым около 100 нм. Было показано, что когда весовое соотношение достигло 20, и размер частиц, и поверхностный потенциал бинарных комплексов оставались стабильными без значительных изменений с увеличением весового отношения.

Связывающая и защитная способность наноносителей для miR495 жизненно важна для доставки генов. Способность SLI связывать miR495 оценивали с помощью анализа задержки геля. Как показано на рис. 1b, голая miR495 не показывала замедления, в то время как добавление SLI значительно изменяло поведение miR495. Было замечено, что SLI демонстрирует растущую способность связывания miR495 с увеличением весового отношения, что обеспечивает полное замедление действия miR495 при весовом отношении 5.

Подводя итог, был сделан вывод, что бинарные комплексы с соотношением масс / масс 20 с надлежащим размером частиц и желаемым поверхностным зарядом, а также с эффективными свойствами связывания и защиты miR495 были оптимальным составом, который был выбран в качестве модели для выполнения. следующие эксперименты.

Затем мы исследовали оптимальное соотношение белка CCM к бинарным комплексам путем смешивания CCM с бинарными комплексами при различных массовых соотношениях (SLI к белку CCM, мас. / Мас.). Оптимальное соотношение определялось полученным размером частиц и зарядом поверхности в различных условиях. Как показано на рис. 2а, добавление CCM (отрицательный заряд) привело к значительным колебаниям размера продукта, но непрерывному уменьшению поверхностного заряда. Результаты показали, что CCM успешно закрепился на поверхности бинарных комплексов. Что наиболее важно, было замечено, что и размер частиц, и поверхностный заряд CCM / SLI / R-D достигли плато при массовом соотношении 7,5 и что дополнительный CCM показал незначительное влияние на поверхностные заряды и лишь небольшое увеличение размера. В частности, диаметр наночастицы достиг 121,28 ± 3,36 нм, а дзета-потенциал изменился до -28,04 ± 2,64 мВ, что было аналогично поверхностному заряду свободного CCM (-27,95 ± 3,06 мВ), что позволяет предположить, что декорирование CCM достиг насыщения при этих условиях. В результате CCM / SLI / R-D при массовом соотношении 7,5 был выбран в качестве модели для проведения следующих экспериментов.

а Изменения размера и дзета-потенциала CCM SLC / R-D при различных весовых соотношениях. Вставленное изображение представляет собой западный анализ трех репрезентативных белков в CCM и CCM / SLI / R-D. б Распределение по размерам и ПЭМ CCM / SLI / R-D. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение ( n =3). Шкала 100 нм

Характеристика CCM / SLI / R-D

Предыдущие сообщения показали, что белки в CCM способны перемещаться по гомологичным опухолевым клеткам, если они используются для модификации наночастиц [35, 36]. Поэтому были отобраны три мембранных белка (Na-K АТФаза, AT1R и CXCR4), и их уровни экспрессии в CCM сравнивались с CCM / SLI / R-D. Как показано на вставленном изображении на рис. 2a, количество всех трех белков в CCM показало интенсивность, аналогичную количеству CCM / SLI / RD, что продемонстрировало, что интегрированные белки в CCM были унаследованы CCM / SLI / RD после нанесения покрытия и потеря или деградация были незначительны во время этого процесса. Этот результат также предоставил убедительные доказательства, подтверждающие успешное построение CCM / SLI / R-D, что было полезно для увеличения самонаведения опухоли CCM / SLI / R-D.

Распределение по размерам и морфология CCM / SLI / R-D также были изучены с использованием DLS и TEM. Как показано на рис. 2b, DLS выявила, что CCM / SLI / RD имеет узкое распределение примерно на 120 нм, в то время как TEM показала, что CCM / SLI / RD характеризовались сферической структурой оболочки ядра и липидный бислой, который можно было четко наблюдать на поверхностном слое. слой.

DLC DOX в CM / SLI / R-D (определенная с помощью ВЭЖХ) может достигать 17,96%, а загрузка miR495 (определенная УФ-спектрофотометром) может достигать 1,64%.

Предыдущие исследования пришли к выводу о нескольких предварительных требованиях для безопасной доставки молекул лекарств. Прежде всего, принятый DDS должен поддерживаться стабильным без резких изменений размера в физиологических условиях, поскольку размер частиц вносит решающий вклад в судьбу системы in vivo [10, 37]. В результате была исследована зависящая от времени стабильность CCM / SLI / R-D. Чтобы определить коллоидную стабильность CCM / SLI / R-D в физиологической среде, изменения размера DDS в PBS (pH 7,4) и плазме мышей регистрировали до 48 часов. Как показано на рис. 3а, CM / SLN / Ce6 может эффективно сохранять свой размер в течение всего диапазона испытаний без значительных изменений. Таким образом, был сделан вывод, что CCM / SLI / R-D способен поддерживать стабильное физиологическое состояние. Как показано на рис. 3b, CCM / SLI / RD может сохранять стабильность во внеклеточных условиях (32,76% лекарств высвобождается через 120 часов инкубации), что указывает на то, что во время процесса доставки CCM / SLI / RD может безопасно инкапсулировать загруженная молекула лекарственного средства, не вызывая потенциальных побочных эффектов. Наиболее важно то, что при попадании в клетки и воздействии кислой среды раковых клеток, лекарства легко высвобождались (75,93%), что можно объяснить высокой концентрацией водорода, которая ослабляет комбинацию лекарства и носителей [6, 38].

а Коллоидная стабильность LCC / R-A в PBS (pH 7,4) и плазме мыши при 37 ° C в течение до 48 часов. б Профили высвобождения лекарственного средства DOX из LCC / R-A в среде высвобождения при внеклеточных и внутриклеточных условиях pH (7,4 и 5,5). Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение ( n =3)

Внутриклеточная трансфекция

Чтобы выявить связь между трансфекцией miR495 и экспрессией P-gp, клетки A549 / DOX трансфицировали различными концентрациями miR495. После этого уровень экспрессии P-gp в этих клетках определяли с помощью вестерн-блоттинга. Как показано на рис. 4a, экспрессия P-gp показала отрицательную связь с концентрацией miR495, предполагая, что CCM / SLI может быть применен в качестве полезного инструмента для доставки miR495, что полезно для CCM / SLI / RD, чтобы обратить вспять МЛУ в клетках A549 / DOX. В качестве доказательства концепции было дополнительно изучено влияние трансфекции miR495 на изменение внутриклеточного накопления DOX. После обработки CCM / SLC / siRNA в течение 48 или 72 часов (фиг. 4b) клетки A549 / DOX обрабатывали DOX в течение различных интервалов времени. Как показано на рис. 5d, при предварительной обработке CCM / SLC / siRNA в течение 48 часов клеточная флуоресценция DOX в клетках A549 / DOX увеличивалась в 1,49 раза (через 4 часа после инкубации) и в 1,47 раза (через 8 часов после инкубации). , соответственно. При предварительной обработке CCM / SLC / siRNA в течение 72 часов внутриклеточная флуоресценция DOX в клетках A549 / DOX увеличивалась в 1,63 раза (через 4 часа после инкубации) и в 1,85 раза (через 8 часов после инкубации). В результате был сделан вывод, что CCM / SLC / siRNA могут преодолеть MDR в A549 / DOX за счет увеличения внутриклеточного накопления DOX по сравнению с необработанными клетками.

а Связь между концентрацией miR495 и экспрессией белков P-gp в клетках A549 / DOX после обработки CCM / SLI / miR495 в течение 48 часов. б Накопление внутриклеточного DOX в клетках A549 / DOX после обработки LCC / miR495 в течение различных интервалов времени. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение ( n =3)

Жизнеспособность клеток A549 / DOX, обработанных носителем, не содержащим лекарств ( a ) или лекарственное средство, содержащее ( b ) различных составов при разных концентрациях наночастиц / лекарственного средства в течение 48 часов. c Вестерн-блоттинг экспрессии белков каспазы-3, цитохрома С и bcl-2 после различных обработок. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение ( n =3). ^** P <0,01

Противораковый анализ in vitro

Цитотоксичность носителя, не содержащего лекарств (CCM / SLI), была изучена для дальнейшего выявления биосовместимости DDS. Как показано на рис. 5a, после инкубации с CCM / SLI в течение 48 часов при максимальной концентрации 200 мкг / мл A549 / DOX все еще демонстрировал более 90% жизнеспособности, что свидетельствует о биосовместимости CCM / SLI с незначительными токсичными веществами. в ячейки.

После этого оценивали противоопухолевый анализ in vitro. Как показано на фиг. 5b, противораковые эффекты всех составов положительно связаны с концентрациями лекарственного средства. В частности, жизнеспособность клеток A549 / DOX все еще составляла 72,6% при максимальной концентрации DOX (50 мкМ). CCM / SLI / DOX и CCM / SLI / miR495 в одинаковых условиях достигли аналогичной жизнеспособности клеток, у которых была 59,4% и 63,3% соответственно, что было выше, чем у DOX. Однако было отмечено, что жизнеспособность клеток для обработки CCM / SLI / R-D значительно снизилась до 38,5%. Кроме того, индекс CI в CCM / SLI / R-D был определен как 0,84, что свидетельствует о сильном синергетическом эффекте miR495 и DOX на уничтожение клеток A549 / DOX.

Чтобы еще раз подтвердить вывод, общепринятые белки регуляции апоптоза (каспаза-3, bcl-2 и цитохром-3) были оценены в различных препаратах. Как показано на фиг. 5c, количество расщепленной каспазы-3 было самым высоким в клетках, обработанных CCM / SLI / RD, а уровень bcl-2 (супрессор апоптоза) был самым низким среди всех тестируемых групп, что дополнительно подтверждает предпочтительное противораковое средство. эффективность CCM / SLI / RD. Кроме того, CCM / SLI / R-D показал значительно повышенную экспрессию цитохрома-3, что позволяет предположить, что апоптоз в этой группе был связан с повреждением митохондрий.

MCTS был адаптирован для имитации солидной опухоли и для оценки противоопухолевого эффекта различных составов. Как показано на рис. 6а, объем MCTS в группе свободного DOX неуклонно растет в течение всего периода эксперимента, что позволяет предположить, что MDR в A549 / DOX может значительно снизить цитотоксичность DOX. Системы одиночной доставки (SLI / DOX и SLI / miR495) показали определенный эффект подавления с умеренным снижением роста. Наиболее важно то, что комбинация miR495 и DOX в CCM / SLI / R-D показала значительно повышенную эффективность с отрицательным увеличением объема, наблюдаемым в конце теста. На оптическом изображении на рис. 6b также были сделаны аналогичные выводы.

Громкость меняется ( a ) и соответствующие оптические изображения ( b ) MCTS после различных процедур. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение ( n =3). ^** P <0,01

Таргетинг in vitro и in vivo

Чтобы выявить возможные причины различительного противоопухолевого эффекта различных препаратов, было оценено клеточное поглощение, чтобы выяснить, может ли модификация CCM положительно увеличить способность к интернализации наночастиц в клетках A549 / DOX, поскольку многие исследования продемонстрировали, что поверхностная модификация CCM может усиливать опухоль. -нацеливающая способность наноносителей [39, 40]. Как показано на рис. 7a, интенсивность внутриклеточной флуоресценции увеличивалась в группах CCM / SLI / miR49 и SLI / miR495 как функция времени, указывая на положительную связь между временем и клеточным поглощением в обеих наночастицах. Кроме того, было отмечено, что более высокие сигналы флуоресценции наблюдались в группе CCM / SLI / miR495, что в 1,58 раза больше, чем в группе SLI / miR495 в момент времени 6 часов. Чтобы проверить, происходило ли поглощение CCM / SLI / miR495 посредством CCM-опосредованного эндоцитоза, клетки инкубировали с избытком CCM перед добавлением наноносителей. Было замечено, что интенсивность флуоресценции в группе CCM / SLI / miR495 продолжала снижаться, в то время как интенсивность флуоресценции в группе SLI / miR495 оставалась почти на том же уровне. Эти результаты продемонстрировали, что CCM / SLI / miR495 поглощается клетками посредством связанного с CCM эндоцитоза.

а Количественный анализ внутриклеточного зависящего от времени поглощения различных составов в клетках A549 / DOX (предварительно обработанных с / без CCM). б Средняя интенсивность флуоресценции рассеченных опухолей и основных органов мышей, получавших SLI / R-A и CCM / SLI / R-A, через 48 часов после инъекции. Данные были выражены как среднее ± стандартное отклонение ( n =3). ^** P <0,01

Ожидалось, что CCM из A549 / DOX повысит способность CCM / SLI / R-D к изогенным клеткам A549 / DOX нацеливаться на опухоль, чтобы увеличить накопление наноносителей в опухоли. Чтобы проверить нашу концепцию, распространение SLI / R-D и CCM / SLI / R-D контролировалось системой визуализации в реальном времени. Как показано на фиг. 7b, как и ожидалось, CCM / SLI / R-D продемонстрировал большее накопление в опухоли по сравнению с SLI / R-D. Кроме того, был сделан вывод, что SLI / R-D был распределен почти во всех органах (кроме сердца) с фокусом в печени и селезенке, что могло быть связано с их плохой способностью самонаведения опухоли. Напротив, модификация CCM может значительно облегчить захват печени, чтобы способствовать лучшему перемещению загруженного груза к ткани опухоли.

Противоопухолевая эффективность in vivo

Проверяли противоопухолевую эффективность CCM / SLI / R-D in vivo. После обработки DOX или SLI / DOX рост опухоли у мышей замедлился. Однако CCM / SLI / R-D продемонстрировал наилучшую противоопухолевую эффективность и привел к очевидному уменьшению объема опухоли на 303 ± 25 мм ³ . Более того, результат изменения массы тела мышей в разных группах также показал интересные результаты (рис. 8). Он показал, что не было очевидного снижения массы тела у мышей, получавших CCM / SLI / R-D, предполагая, что способность CCM / SLI / R-D нацеливаться на опухоль могла повысить противоопухолевую эффективность при уменьшении побочных эффектов. Напротив, нецелевое распределение свободного DOX вызывало систематическую токсичность для мышей, что отражалось в постепенном снижении массы тела как функции времени. Таким образом, CCM / SLI / R-D был превосходным DDS для лечения опухолей легкого.

The tumor volume (a ) and body weight (b ) of tumor tissue analysis of A549/DOX tumor-bearing Balb/c nude mice after intratumoral administration of different formulations. Data were expressed as mean ± SD (n =6). ^** P <0,01

Заключение

In summary, we successfully constructed a CCM-coated SLI nanoparticle as a DDS to co-delivery miR495 and DOX (CCM/SLI/R-D). The characterization demonstrated that CCM/SLI/R-D showed well distribution with a diameter of 120 nm, which showed high stability as well as pH-responsive drug release. Cellular experiments revealed that CCM/SLI/R-D could realize preferable miR495 delivery which achieved the significant downregulation of P-gp, which finally overcome the MDR in A549/DOX by increasing the intracellular DOX accumulation compared to untreated cells. The CCM/SLI/R-D showed promising tumor-homing capability. Most importantly, the synergetic effect of miR495 and DOX achieved much more potent anticancer effect to mono-delivery DDS or free DOX both in vitro and in vivo.

Доступность данных и материалов

Данные и анализ в текущей работе доступны у соответствующих авторов по разумному запросу.

Сокращения

AEAPS:

N -(2-Aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane

CCM:

Cancer cell membrane

DDS:

Drug delivery systems

DLC:

Drug loading content

DOX:

Doxorubicin

ВЭЖХ:

Высокоэффективная жидкостная хроматография

MCTS:

Multicellular tumor spheroid

MDR:

Multidrug resistance

miRNA:

MicroRNAs

MTT:

Methyl thiazolyl tetrazolium

P-gp:

P-glycoprotein

SLI:

Silica

TEOS:

Tetraethyl orthosilicate