Целевые силицевые наночастицы ко-доставляют miR-495 и доксорубицин для преодоления множественной лекарственной устойчивости в раке легких

Аннотация

Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) и неспецифическое распределение ограничивают эффективность традиционной химиотерапии. Мы спроектировали силицевую (SLI) наночастицу, покрытую мембраной раковой клетки (CCM), способную ко-загружать miR-495 и доксорубицин (DOX) для решения обоих вызовов. CCM, полученная от МЛУ линии рака легких A549/DOX, придает свойства гомминга к опухоли, в то время как miR-495 подавляет эффлюкс-насос P-гликопротеина (P-gp), усиливая внутриклеточное удержание препарата. In vitro и in vivo исследования показали, что CCM/SLI/R-D значительно превосходил свободный DOX, CCM/SLI/DOX и CCM/SLI/miR-495 в отдельности, достигая превосходной регрессии опухоли и минимальной системной токсичности. Эта многофункциональная платформа предлагает перспективную стратегию для терапии МЛУ-рака легких.

Введение

< p>Множественная лекарственная устойчивость, в основном посредствованная АТФ-связывающими кассетными транспортерами, такими как P-гликопротеин (P-gp), остается главным препятствием в эффективной химиотерапии [1,2,3]. P-gp активно выкачивает химиотерапевтики, снижая внутриклеточные концентрации и клинические результаты [4,5]. Таргетирование P-gp, следовательно, представляет рациональный подход к ресенсибилизации устойчивых опухолей.

МикроРНК (miRNA) регулируют геновую экспрессию пост-транскрипционно и возникли как мощные модуляторы чувствительности к препаратам. miR-495, в частности, показано, что понижает экспрессию P-gp в яичниках и желудочном раке [8] и теперь исследуется в контексте МЛУ рака легких.

Наночастицевые системы доставки препаратов (СДП) трансформировали онкотерапию, улучшая биодоступность и снижая офф-таргет эффекты [9-12]. Силицевые наночастицы (SLI) предлагают высокую загрузку препарата, настраиваемую поверхностную химию и отличную биосовместимость [17,18]. Однако большинство СДП полагаются на конъюгацию лигандов для таргетинга, что может вызывать иммуногенность и цитотоксичность. В отличие от этого, декорирование наночастиц гомологичными мембранами раковых клеток (CCM) обеспечивает врожденные свойства гомминга к опухоли при сохранении биосовместимости [24,25].

Здесь мы объединяем CCM-медированный таргетинг с miR-495-индуцированным подавлением P-gp в единой силицевой наночастичной платформе (CCM/SLI/R-D) для достижения синергистического обращения МЛУ и усиленной химиотерапевтической эффективности в раке легких.

Материалы и методы

Материалы

Все реактивы, включая MTT, AEAPS, TEOS, DOX, Triton X-100 и miR-495, получены от Sigma-Aldrich или Cell Biolabs. Клеточные линии (A549, A549/DOX, NIH3T3) культивировались в DMEM с 10% ФБС, пенициллином и стрептомицином. A549/DOX генерировалась инкрементальным воздействием DOX как описано ранее [26].

Фабрикация наночастиц

Амино-функционализированные силицевые (SLI) наночастицы синтезировались через водно-в-масле микроэмульсию. DOX инкапсулировался во время гидролиза TEOS и AEAPS. Последующая загрузка miR-495 при оптимальных весовых соотношениях давала бинарные комплексы SLI/R-D, которые в конечном итоге обволакивались CCM, извлеченной из клеток A549/DOX, формируя финальную формуляцию CCM/SLI/R-D.

Характеризация

Динамическое рассеяние света (DLS) и передающее электронное микроскопирование (TEM) подтвердили равномерный диаметр ~120 нм и ядро-оболочку морфологию. Зета-потенциал показал сдвиг заряда с +26 мВ (SLI/R-D) на −28 мВ после CCM-покрытия, указывая на успешное декорирование мембраной. Гель-ретардационные анализы продемонстрировали полную связь miR-495 при соотношении 20:1 SLI:miR-495 по весу. Загрузка препаратов составляла 17,96% для DOX (HPLC) и 1,64% для miR-495 (УФ).

Стабильность и высвобождение

CCM/SLI/R-D оставался стабильным в ФСБ (pH 7,4) и мышьей плазме более 48 ч, с <33% высвобождения препарата внеклеточно. Кислые условия (pH 5,5) ускоряли высвобождение до ~76%, имитируя микросреду опухоли.

In vitro исследования

Трансфекция A549/DOX с CCM/SLI/miR-495 снижала экспрессию P-gp доза-зависимым образом (вестерн-блот). Следовательно, внутриклеточное накопление DOX увеличивалось до 1,85-кратно по сравнению с контролями. Цитотоксичность (MTT) показала, что CCM/SLI/R-D достигает 38,5% жизнеспособности при 50 мкМ DOX, превосходя свободный DOX (72,6%) и одноагентные формуляции (~60%). Индекс комбинации (CI) 0,84 указывал на сильную синергию. Маркеры апоптоза (срезанная каспаза-3, цитохром C, низкий Bcl-2) подтвердили усиленную митохондриально-медиаторную смерть клеток.

Мультицеллюлярный сфероид опухоли (MCTS) анализ

В 3D культурах CCM/SLI/R-D ингибировал рост сфероидов до отрицательного изменения объема за пять дней, в то время как свободный DOX способствовал продолжению экспансии, подчеркивая эффективность платформы против устойчивых опухолевых масс.

In vivo оценка

Балб/с голые мыши с ксеногравтами A549/DOX получали внутриопухолевые инъекции CCM/SLI/R-D (5 мг/кг DOX, 0,25 мг/кг miR-495) семь раз за 14 дней. Объемы опухолей уменьшались до 303 ± 25 мм³, наименьшие среди всех групп. Масса тела оставалась стабильной, указывая на сниженную системную токсичность по сравнению с свободным DOX, вызывавшим прогрессивную потерю веса.

Эффективность таргетинга

Флуоресцентно-маркированные CCM/SLI/R-D демонстрировали превосходное накопление в опухоли in vivo (24 ч пост-инъекции) и заметно более высокое клеточное поглощение в клетках A549/DOX, чем необволаченные SLI/R-D. Предварительная инкубация с избытком CCM конкурентивно ингибировала поглощение, подтверждая мембрано-медиаторную эндоцитоз.

Заключение

Мы успешно изготовили CCM-покрытую силицевую наночастицу, ко-доставляющую miR-495 и DOX, достигающую гомминга к опухоли, обращения МЛУ и синергистической цитотоксичности в моделях рака легких. Платформа с надежной стабильностью, pH-реагирующим высвобождением и минимальной токсичностью является перспективным кандидатом для клинической трансляции в МЛУ-опухоли.