Редокс-реактивные желатин/силика наногели, функционализированные аptaмером AS1411, для таргетной доставки siRNA

Аннотация

РНК-интерференция (РНКи) предлагает непревзойденную специфичность для генно-глушения, однако стабильность siRNA и точная тканевая доставка остаются ограничивающими факторами. Мы спроектировали двухреактивную систему, конъюгируя желатин-базированные наногели (GS) с нуклеолин-таргетным аptaмером AS1411 и дезоксинуклеотид-замещенным siRNA через дисульфидный линкер. Этот дизайн позволяет временное докинг siRNA и запускает его высвобождение в глутатион-богатой микросреде пухлины. В нуклеолин-положительных клетках A549 Apt-GS/siRNA наногели распадаются при внутриклеточном воздействии GSH, эффективно доставляя siRNA в цитозоль и достигая мощного нокаута люциферазы. Цитотоксичностные тесты подтвердили биосовместимость при терапевтически релевантных концентрациях. Эти редокс-реактивные, пухлино-таргетные наногели представляют перспективную платформу для siRNA-базированной раковой терапии.

Введение

РНКи использует последовательно-специфическое глушение генов, позиционируя себя как ведущий кандидат для лечения генетических расстройств, рака и инфекционных заболеваний благодаря своей точности и низкой токсичности. По сравнению с антисенс-олигонуклеотидами, малые интерферирующие РНК (siRNA) демонстрируют усиленную резистентность к нуклеазам. Химические модификации — такие как замещение рибонуклеотидов дезоксинуклеотидами — показано усиливают стабильность siRNA, сохраняя ~40% активности РНКи. Несмотря на эти достижения, эффективная ткане-специфическая доставка остается серьезным вызовом.

Наночастицы-носители могут защищать siRNA от деградации и облегчать таргетную доставку. Нуклеолин, гиперекспрессируемый на поверхности многих пролиферирующих раковых клеток, является привлекательной мишенью для пухлино-специфической интернализации. G-четвертичный ДНК-аptaмер AS1411 (AGRO100) связывает нуклеолин с высокой аффинностью и прошел фазу II клинических испытаний как антираковое средство. Предыдущие работы успешно конъюгировали AS1411 с различными наноматериалами, достигая селективной внутренней клеток пухлины. Желатин, биодеградируемый белок, использовался для инкапсуляции siRNA благодаря своей отличной биосовместимости и геляции. Наша группа ранее разработаласилоксан-сшитые желатин наногели (GS NG) с контролируемым размером и поверхностным зарядом, демонстрируя эффективную трансфекцию in vitro и in vivo.

Преодоление внутриклеточных барьеров — особенно эндосомального побега и высвобождения siRNA — критически важно. Стимуло-реактивные связи, такие как дисульфидные связи, расщепляемые в высокоглутатионовой (GSH) среде пухлины, привлекли значительный интерес. Дисульфид-сшитые носители могут запускать взрывное высвобождение терапевтических нагрузок специфически внутри злокачественных клеток.

Здесь мы представляем гибридную наногелевую систему, комбинирующую GS NG, таргетинг AS1411 аptaмером и дисульфидный линкер для редокс-триггеренного высвобождения siRNA. Мы оцениваем ее способность усилить клеточное поглощение, достичь пухлино-специфического глушения генов и поддерживать низкую цитотоксичность.

Методы

Материалы

Желатин (Bloom 240-270, pH 4,5-5,5) получен от BBI Company Inc. (США). SPDP, GPSM и APTMS приобретены у Sigma-Aldrich (США). MTT, DMEM, FBS, пенициллин и стрептомицин получены от Hyclone (США). AS1411, 5'-FAM-AS1411 и негативный контроль TDO синтезированы Sangon Biotech (Китай). Дезоксинуклеотид-замещенный Luc-siRNA (сенс-цепочка: 5'-SH-(CH2)6-CTTACGCTGAGTACTTCGATT-3'; антисенс-цепочка: 3'-TTGAAUGCGACUCAUGAAGCU-5'; FAM-маркированный антисенс) HPLC-очищен Gene Pharma (Китай). Lipofectamine 2000, плазмида люциферазы pGL3 и система анализа люциферазы от Promega (США). Клетки легкого аденокарциномы A549 и фибробласты NIH 3T3 предоставлены Центром биомедицинского инжиниринга Сиамэньского университета (Китай). Все реактивы аналитического чистоты; стеклотара тщательно очищена и промыта деионизированной водой.

ДНК последовательности, использованные:

• Аptaмер AS1411: 5'-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTTTTTTTTTTT-3'
• Контроль TDO: 5'-CACCGGGAGGATAGTTCGGTGGCTGTTTTTTTTTTTTT-3'

Подготовка и характеризация Apt-GS/siRNA комплексов

GS наногели синтезировали сол-гель процессом: GPSM (0,2 г) добавляли к 20 мл 0,75% желатина в HCl (pH 3) при 60 °C на 30 мин, затем APTMS (0,08 г) и 24-часовая инкубация. Полученные GS NG очищали центрифугированием (14 000 об/мин, 25 °C, 12 мин) трижды. Затем GS NG (0,5 мл, 5 г/л PBS) реагировали с SPDP (25 мкл, 20 мМ DMSO) 60 мин при комнатной температуре, затем инкубировали с тиолированным AS1411 (1 мг/мл) 12 ч. Apt-GS наногели выделяли центрифугированием и вымывали дионизированной водой трижды. SPDP-активированная Apt-GS NG суспензия (80 мл, 5 мг/мл) смешивали с сенс-цепочкой siRNA на ночь при 4 °C. После очистки антисенс-цепочка отжигали нагреванием до 94 °C на 5 мин и охлаждением до 47 °C на 20 мин, образуя Apt-GS/siRNA комплексы.

Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ, Hitachi S-4300) раскрыла сферические частицы. Динамическое рассеяние света (Malvern Zetasizer) измеряло гидродинамические диаметры и дзета-потенциалы. Эффективность конъюгации kvantифицировали флуоресценцией FAM-маркированной ДНК и ниндриновым тестом для поверхностных аминогрупп (≈0,642 ммоль/г).

Анализ гель-электрофореза

Электрофорез проводили при 100 В 20-30 мин на 2% агарозе в TBE буфере. Изображения захватывали системой документирования гелей. Для исследований высвобождения GS/siRNA и Apt-GS/siRNA комплексы инкубировали с 10 мМ GSH (PBS) 2 ч перед загрузкой.

In vitro цитотоксичность

MTT тесты проводили на клетках A549 (1×10⁴ клеток/колодец) в 96-колодчатых пластинках. После 24 ч для достижения 70% конфлюэнтности, клетки обрабатывали наногелями (100-600 мкг/мл) в сывороточнозе DMEM 24 ч, затем 4 ч инкубации с MTT (5 мг/мл). Добавляли DMSO, и абсорбцию считывали при 490 нм. Эксперименты триплицировали; живучесть (%) рассчитывали относительно необработанных контролов.

Клеточное поглощение

Клетки A549 и 3T3 инкубировали с 25 мкл FAM-маркированных Apt-GS или TDO-GS (2 мг/мл) 10 ч в сывороточнозе среде при 37 °C. Клетки фиксировали 4% параформальдегидом и образовывали конфокальной лазерной сканирующей микроскопией (CLSM). Для потоковой цитометрии клетки обрабатывали FAM-маркированными наногелями (2 мг/мл) 0,5-16 ч, затем вымывали, ресуспендировали в ледяном PBS и анализировали на потоковом цитометре EPICS XL. Ингибирование поглощения оценивали предварительной инкубацией клеток с свободным AS1411 (0,5, 5, 50 мкМ) 8 ч перед добавлением наногелей.

Глушение генов

Клетки A549 (2×10⁵ клеток/колодец) и NIH 3T3 (4×10⁵ клеток/колодец) трансфекции Apt-GS/siRNA комплексами (80 мкг/мл) 8 ч. Оценивались три режима лечения: (a) Apt-GS/siRNA в одиночку; (b) Apt-GS/siRNA затем липосомы (A-GS/si→Lip); (c) одновременные Apt-GS/siRNA и липосомы (A-GS/si+Lip). После дополнительных 40 ч активность люциферазы измеряли системой анализа люциферазы. Данные представлены как mean ± SEM (трипликаты).

Результаты и обсуждение

Синтез и характеризация GS-AS1411/siRNA комплексов

ТЭМ изображения (рис. 1) подтвердили, что как пустые GS, так и Apt-GS наногели формируют равномерные сферические частицы диаметром 170-200 нм. Флуоресцентная визуализация продемонстрировала успешную конъюгацию AS1411 и siRNA. Квантификация раскрыла ~0,65 мкмоль/г аptaмера на GS. Гидродинамические размеры увеличились с 162,3 нм (GS) до 216,5 нм (Apt-GS) и 234,9 нм (Apt-GS/siRNA), отражая поверхностную функционализацию. Дзета-потенциалы сместились с +40,1 мВ (GS) на +33,9 мВ (Apt-GS) и -24,9 мВ (Apt-GS/siRNA), указывая на снижение поверхностного заряда, ожидаемое для понижения неспецифического белкового связывания и цитотоксичности.

Загрузка и высвобождение siRNA

Гель-электрофорез показал эффективную загрузку siRNA на Apt-GS/siRNA комплексы, как видно по снижению подвижности (дорожки 10-11). При инкубации с 10 мМ GSH siRNA высвобождался в течение 2 ч (дорожки 6-7), подтверждая редокс-триггеренный распад. Загрузочная емкость оценивалась 3:1 до 2:1 пмоль siRNA на мкг наногеля. Физическая энкапсуляция (смешивание свободного siRNA с GS) демонстрировала более слабое удержание, подчеркивая преимущество ковалентного присоединения.

Цитотоксичность и таргетинг нуклеолина

MTT тесты (рис. 4) раскрыли >80% живучести для GS, Apt-GS и Apt-GS/siRNA по диапазону 100-600 мкг/мл, демонстрируя отличную биосовместимость. Небольшое снижение живучести с Apt-GS приписывалось AS1411-индуцированному NF-κB ингибированию и органелльной деструкции. Флуоресцентная микроскопия и потоковая цитометрия (рис. 5 и 6) подтвердили селективное поглощение: Apt-GS показывал 96% интернализации в клетках A549 против 52% в 3T3 фибробластах. Конкуренция с свободным AS1411 снижала поглощение на 50% (флуоресценция) и 30% (процент положительных клеток), подтверждая нуклеолин-мединированную эндоцитоз.

РНК-интерференция

Тесты нокаута люциферазы (рис. 7a) продемонстрировали 4,6-кратное снижение в клетках A549 с Apt-GS/siRNA, по сравнению с лишь 6% в NIH 3T3 клетках, подчеркивая пухлино-специфичность. Добавление липосом (A-GS/si→Lip) не значимо усиливало глушение (30,4%) относительно Apt-GS/siRNA в одиночку, тогда как одновременное лечение липосомами (A-GS/si+Lip) увеличивало нокаут до 41,6%. Высшее глушение (~2,7-кратное над 3T3) достигалось при 80 мкг/мл, с сниженной эффективностью при 120 мкг/мл, вероятно, из-за повышенной цитотоксичности.

Заключение

Мы спроектировали редокс-реактивную, нуклеолин-таргетную наногелевую платформу, защищающую дезоксинуклеотид-модифицированный siRNA и высвобождающую его специфически в GSH-богатом пухлином цитозоле. ~200 нм, положительно заряженные Apt-GS/siRNA наногели достигают мощного, пухлино-селективного глушения генов (~5-кратное улучшение в клетках A549) сохраняя низкую цитотоксичность. Эти выводы валидируют стратегию комбинирования дисульфид-линкер химии с аptaмер-таргетингом для эффективной siRNA доставки и представляют перспективный шаг к клиническим РНКи терапевтикам.

Доступность данных и материалов

Наборы данных, поддерживающие выводы этой статьи, включены в статью.

Аббревиатуры

APTMS

3-Амипропил-триметоксисилан

DMEM

Модифицированное среднее Дюльбекко

DMSO

Диметилсульфоксид

FAM

Флуоресцеин амидит

GE

Гель-электрофорез

GPSM

3-Глицидоксипропил-триметоксисилан

GS NGs

Силоксан-сшитые желатин наногели

MTT

3-(4,5-Диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид

RNAi

РНК-интерференция

siRNAs

Малые интерферирующие РНК

SPDP

N-Сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио)пропионат

TDO

Негативный ДНК олигонуклеотид

Редокс-реактивные и пухлино-таргетные Apt-GS наногели разработаны для siRNA доставки с дисульфидной конъюгацией и аptaмером AS1411.

Изображения Apt-GS (a, c) и Apt-GS/siRNA наногелей (b, d). a, b ТЭМ изображения. Масштаб: 0,5 мкм. c, d Флуоресцентные изображения. Масштаб: 5 мкм.

Гидродинамические размеры и дзета-потенциалы GS, Apt-GS и Apt-GS/siRNA наногелей.

АГЭ анализ обратимого связывания siRNA с Apt-GS наногелями. Дорожки 1-5: свободный siRNA (50-10 пмоль). Дорожки 6-7: GS/siRNA и Apt-GS/siRNA с 10 мМ GSH (2 ч). Дорожка 8: свободный siRNA смешанный с Apt-GS NG. Дорожки 10-11: GS/siRNA и Apt-GS/siRNA без GSH.

Живучесть клеток A549 с GS, Apt-GS и Apt-GS/siRNA наногелями при различных концентрациях (MTT тест).

a-c Клеточное поглощение FAM-siRNA, доставленного Apt-GS и TDO-GS наногелями. Изображения CLSM. Зеленый сигнал: FAM. Масштаб: 10 мкм.

Потоковая цитометрия анализа клеточного поглощения FAM-маркированных Apt-GS и TDO-GS наногелей. Внутри: FACS профили. a, b кривые: время инкубации (0,5-16 ч). c кривая: концентрация AS1411 (0-16 мкМ).

In vitro глушение эффект анти-люциферазы siRNA, сформулированного в Apt-GS наногелях с разными лечениями (a) и концентрацией Apt-GS/siRNA комплексов (b) на глушение генов.