Мезопористые силицевые наночастицы ко-доставляют ингибитор NQO1 и 5-фторурацил, усиливая антиопухолевую активность при челюстно-лицевой чешуйчатоклеточной карциноме

Аннотация

Челюстно-лицевые чешуйчатоклеточные карциномы (HNSCC) — одна из самых смертоносных форм рака, и 90% их происхождения от чешуйчатых клеток. NAD(P)H:хинон оксидоредуктаза 1 (NQO1), фермент, гиперекспрессированный в чешуйчатоклеточной карциноме, играет важную роль в пролиферации и хеморезистентности. Основными целями были изучение ингибиторного эффекта β-лапахона (ARQ761 в клинической форме) в HNSCC и изучение комбинационного эффекта 5-FU и β-лап в улучшении терапевтической эффективности в HNSCC. Липидным двуслойным собранные мезопористые силицевые наночастицы, загруженные 5-FU/β-лап, были приготовлены и изучены по их физико-химическим и биологическим свойствам. β-лап показал концентрационно-зависимую ингибицию активности фермента NQO1 в клетках Cal33. Особенно значимый ингибиторный эффект наблюдался при дозе 20–50 мкг/мл β-лап. Комбинация 5-FU+β-лап привела к более низкой жизнеспособности клеток; наиболее заметно, 5-FU/β-лап-загруженные мезопористые силицевые наночастицы (FNQ-MSN) продемонстрировали значительно более низкую жизнеспособность клеток по сравнению с любым из отдельных препаратов или их физических комбинаций. β-лап привел к уменьшению белковой полосы NQO1 по сравнению с контролем; однако наиболее заметное снижение уровня NQO1 наблюдалось в группе клеток, обработанных FNQ-MSN. FNQ-MSN привел к более чем 60% клеточной апоптоза (ранней и поздней) и преобладающей ядерной фрагментации раковых клеток, указывая на превосходный антиканцерогенный эффект комбинационной режима на основе носителя. Заметное уменьшение объема опухоли наблюдалось с физической смесью 5-FU+β-лап; однако комбинированное лечение носителем 5-FU и β-лап (FNQ-MSN) значительно задержало рост опухоли и продлило выживание ксеногенных мышей с опухолями. Эти выводы указывают на потенциал ингибитора NQO1 в усилении хемотерапевтического потенциала 5-FU в лечении HNSCC.

Введение

Челюстно-лицевые чешуйчатоклеточные карциномы (HNSCC) — одна из самых смертоносных форм рака, и 90% их происхождения от чешуйчатых клеток. HNSCC имеет высокую ангиогенность, и ее сосудистый ручеек экспрессирует различные цитокины, включая факторы роста фибробластов (FGF) и сосудистые эндотелиальные факторы роста (VEGF), которые связаны с более высокой метастазацией и плохим выживанием. Заболеваемость HNSCC в Китае занимает шестое место среди раковых смертей: примерно 250 000 новых случаев зарегистрировано в 2015 году и 77 500 случаев смерти. Общий 5-летний уровень выживания при HNSCC очень низок из-за таких факторов, как агрессивная природа, ранняя рецидив, высокая метастазационность и высокая смертность из-за плохой прогнозности. Основным вариантом лечения при HNSCC является хирургическое вмешательство, за которым следует лучевая или химиотерапия. Конкретно, химиотерапия, если используется эффективно на ранних стадиях или послеоперационно, будет противодействовать росту опухоли. Эффективное использование химиотерапии искоренит раковые клетки внутри опухолевых тканей и ингибирует рецидив опухоли. Однако длительная химиотерапия на основе единственного агента часто приводит к лекарственной резистентности и снижению терапевтической эффективности. Поэтому необходимо использовать инновационные стратегии для улучшения выживания и качества жизни пациентов с HNSCC.

Несколько противоопухолевых агентов, используемых при лечении HNSCC, включают цисплатин, 5-фторурацил (5-FU), паклитаксел или докетаксел. Среди всех, 5-фторурацил (5-FU) применяется как первая линия терапии при HNSCC и других чешуйчатоклеточных карциномах. 5-FU — пиримидиновый аналог, который действует необратимо ингибируя тимидилатсинтазу внутри раковых клеток, тем самым подавляя репликацию ДНК и приводя к гибели клеток. Как и все противоопухолевые препараты, 5-FU не лишен побочных эффектов в системном кровотоке и вызывает токсичность для нормальных тканей, в то время как сообщается, что комбинация 5-FU с вторым агентом потенциально может уменьшить побочные эффекты и улучшить общую терапевтическую эффективность при лечении рака.

NAD(P)H:хинон оксидоредуктаза 1 (NQO1) — флавопротеин, который повышен в опухолевых тканях в диапазоне 100-200 раз по сравнению с нормальными тканями. Двухэлектронный оксидоредуктаза — индуцируемая фаза II детоксикационный фермент, способный детоксицировать хиноны путем формирования стабильных гидрохинонов. NQO1 показана экспрессирующейся на низком базальном уровне в нормальных человеческих тканях, где она защищает клетки от редокс-циклирования и оксидативного стресса и стабилизирует супрессор p53. NQO1 конститутивно гиперекспрессирована в нескольких раках, включая рак молочной железы, поджелудочной железы и чешуйчатоклеточные карциномы. Гиперекспрессия NQO1 способствует прогрессированию раковой нагрузки и делает раковые клетки более резистентными к химиотерапевтическим препаратам, таким как 5-FU или цисплатин (индукторы оксидативного стресса), делая NQO1 потенциальной онкотаргетом для улучшения терапевтической эффективности. Сообщалось, что нокаут NQO1 с помощью siRNA усилил цитотоксический эффект множества препаратов, таких как гемцитабин или доксорубицин. Кроме того, сообщалось о нескольких синтетических и натуральных ингибиторах NQO1, таких как кумарины, куркумины или ES936. В этом исследовании мы использовали β-лапахон (β-лап, 3,4-дигидро-2,2-диметил-2H-нафто[1,2-b]пиран-5,6-дион) как ингибитор NQO1. β-лап действует через NQO1-зависимый механизм и создает значительное количество реактивных форм кислорода (РФК), которые приведут к повреждению цепей ДНК и вызовут гибель раковых клеток.

Использование наночастиц для системной доставки малых молекул становится перспективным подходом в лечении рака. Лекарственно-нагруженные наночастицы требуют меньшей дозы и показаны улучшающими антиканцерогенную эффективность и относительно снижающими побочные эффекты. Среди всех носителей мезопористые силицевые наночастицы (MSN) имеют значительный потенциал для эффективной доставки полезной нагрузки в опухолевые ткани. Микрометровые поры позволяют стабильную загрузку препаратов и предотвращают их высвобождение в системном кровотоке, позволяя преференциальное накопление в проницаемых раковых тканях с использованием эффекта усиленной проницаемости и удержания (EPR).

В целом, основная цель настоящего исследования — объединить терапевтические преимущества 5-FU и ингибитора NQO1 для усиления антиканцерогенного эффекта в HNSCC. Ин витро антиканцерогенный эффект анализировали с использованием различных техник, таких как жизнеспособность клеток, вестерн-блот анализ, цитометрический/на основе Hoechst апоптоз-тест и live/dead тест. Ин виво исследования проводили на ксеногенной модели с клетками опухоли Cal33.

Заключение

Подводя итог, мы успешно сформулировали 5-FU+β-лап-загруженные липидным двуслоем покрытые мезопористые силицевые наночастицы. Мы показали, что (i) антиопухолевой эффект β-лап в концентрационно-зависимом режиме в клетках опухоли HNSCC, (ii) комбинация 5-FU+β-лап приводит к значительной ингибиции белка NQO1 и белка Bcl-2, (iii) комбинационное FNQ-MSN продемонстрировало значительное снижение опухолевой нагрузки в ксеногенной модели HNSCC. Эти данные недвусмысленно указывают на то, что сублитальная доза ингибитора NQO1 (β-лап) может потенциально улучшить терапевтическую эффективность 5-FU в опухолях HNSCC и потенциально может быть расширена на клиническое лечение других злокачественностей.

Материалы и методы

Приготовление 5-FU/β-лап-загруженных липидным двуслоем мезопористых силицевых наночастиц

Лекарственно-нагруженные MSN приготовили растворением цеттриметиламмония бромида (CTAB) (210 мг) в 180 мл воды и нагреванием до 80 °C, затем 5-FU и β-лап добавили 20% масс. от общего количества наночастиц, а затем аммоний фторид (NH4F) (30 мг) добавили и хорошо помешали 60 мин. Затем 1,6 мл тетраэтилортсиликата (TEOS) капально добавили 30 мин и продолжали помешивание 3 часа. Получились полупрозрачные белые коллоиды, которые собрали после центрифугирования (15 мин) при 10000 об/мин при 24 ± 1 °C. MSN взвесили в ультрачистой воде, и цикл центрифугирования повторяли 2 раза. Отдельно тонкопленочную мембрану приготовили с использованием DSPE-PEG2000 (2% от массы MSN) и гидратировали водой с взвешенными лекарственно-нагруженными MSN. Смесь немедленно зондировали зондом 5 мин при 50 Вт при комнатной температуре (25 °C). PEGилированный липидный двуслой, поддерживающий MSN, наконец промыли два раза и взвесили в ультрачистой воде.

Анализ размера частиц, дзета-потенциала и морфологии

Диаметр частиц, индекс полидисперсности (PDI) и дзета-потенциал оценивали с помощью Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK). Частицы анализировали механизмом динамического рассеяния света (DLS), и частицы хорошо разбавляли перед экспериментом. Все эксперименты проводили в триplicates при комнатной температуре. Морфологию наночастиц определяли передаточной электронной микроскопией (TEM) с использованием CM 200 UT, Philips, MA, USA) при 100 кВ. Кратко, разбавленную взвесь частиц капли помещали на сетку TEM 300 ячеек и давали осесть 10 мин. Частицы контрастировали 2% фосфовольфрамовой кислотой (PTA) как негативное окрашивание, сушили на воздухе и наблюдали под TEM микроскопом.

Загрузка препарата

Анализ загрузки препарата двумя способами проводили путем расчета не загруженного или несвязанного препарата в supernatанте и препарата, загруженного в наночастицу. Эффективность загрузки препарата выполняли методом HPLC. HPLC был оснащен насосом Shimadzu LC-20 AD PLC и детектором SPD-M20A PDA и программным обеспечением Shimadzu LC, содержащим обратно-фазную колонку C18 (Phenomenex C18, 150 4,6 мм, 5 мкм). Подвижная фаза для 5-FU состояла из смеси ацетонитрила и воды (10:90, v/v) и подавалась со скоростью 1 мл/мин. Длина волны детектирования установлена на 265 нм для 5-FU. Подвижная фаза для β-лап состояла из ацетонитрила/воды (31:69, v/v) и длина волны детектирования 254 нм при 35 °C. Грузоподъемность (LC) и эффективность загрузки (LE) 5-FU/β-лап рассчитывали с использованием соответствующих формул.

Исследование высвобождения препарата

Ин витро высвобождение 5-FU и β-лап из FNQ-MSN изучали в PBS (pH 7,4) и ABS (pH 5,0) при 37 °C методом диализа. Кратко, 1 мг эквивалент каждой лекарственно-нагруженной наночастицы загружали в диализационную мембрану в 1 мл соответствующего буфера и концы герметизировали. Герметизированная диализационная мембрана помещалась в 25 мл соответствующего ABS и PBS буфера и помещалась в вибрирующую водяную баню при 37 °C. Образцы собирали заранее определенные временные интервалы и заменяли равным объемом свежего буфера. Количество высвобожденного препарата в соответствующем буфере оценивали методом HPLC, как описано в предыдущем разделе.

Клеточная культура и анализ активности NAD(P)H:Хинон оксидоредуктазы 1 (NQO1)

Клетки HNSCC Cal33 культивировали в модифицированной среде Дюльбекко для орла (DMEM) с добавлением 10% FBS и 1% антибиотиковой смеси. Клетки содержали в нормальных условиях в инкубаторе. Для анализа активности NQO1 клетки Cal33 посеяли в 96-колбовые пластинки при плотности посева 8 × 10³ клеток на колбо и инкубировали на ночь. Клетки обрабатывали разными концентрациями β-лап и инкубировали 24 часа. 0,8% дигитонина (50 мкл 2 нМ EDTA) использовали для лизиса клеток, и анализ выполняли с использованиемменадион и MTT (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиевый бромид) в качестве субстратной сопряженной реакции, и активность измеряли при 620 нм. Анализ проводили в триplicates.

Ин витро тест жизнеспособности клеток

Тест жизнеспособности клеток β-лап в возрастающей концентрации и тест жизнеспособности отдельного и комбинационного режимов тестировали с помощью 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2H-тетразолия (MTS) анализа. Кратко, клетки Cal33 посеяли в 96-колбовые пластинки при плотности посева 1 × 10⁴ клеток на колбо и инкубировали на ночь. На следующий день клетки обрабатывали возрастающей концентрацией β-лап, отдельно; клетки обрабатывали отдельным и комбинационным режимом 5-FU и β-лап при базовой концентрации 5, 10 и 20 мкг/мл и инкубировали 24 часа. Клетки промывали дважды и обрабатывали раствором MTS согласно инструкции производителя. Жизнеспособность клеток рассчитывали относительно необработанных клеток, и микропластинковый фототметр использовали для абсорбции при 460 нм.

Вестерн-блот анализ

Посеянные клетки в 6-колбовые пластинки обрабатывали возрастающей концентрацией β-лап, отдельно; клетки обрабатывали отдельным (5-FU или β-лап) и комбинационным режимом 5-FU и β-лап (FNQ-MSN) и инкубировали 24 часа. Клетки собирали, лизировали (M-пер буфер) и центрифугировали, и supernatант, содержащий белок, собирали. Белковая концентрация в лизате клеток оценивали методом бинхониновой кислоты (BCA). 10% гель бис-трис полиакриламида использовали для разделения белков и немедленно переносили на поливинилиденфторидную (PVDF) мембрану. Мембрану блокировали 5% обезжиренным молоком, приготовленным в n Tris-буферном растворе (TBS) с Твеен 20 (TBST, pH 7,2). Первичные антитела кроличьего поликлонального NQO1 (1:1000), мышиного мононального Bcl-2 (1:1000) и мышиного мононального GAPDH (1:1000) инкубировали на мембране на ночь при 4 °C. Мембрану промывали TBST, затем инкубировали со вторичными антителами (антимышиные или антикислные IgG) при разбавлении 1:10000. Мембрану снова промывали TBST и блоты экспонировали раствору субстрата ECL, а плотности белковых полос оценивали с помощью фотодевелопера.

Апоптоз и Hoechst анализ

Клетки Cal33 посеяли в 6-колбовые пластинки при плотности посева 2 × 10⁵ клеток на колбо и инкубировали на ночь. Клетки затем обрабатывали отдельным (5-FU или β-лап) и комбинационным режимом 5-FU и β-лап (FNQ-MSN) и инкубировали 24 часа. Клетки собирали, промывали, центрифугировали и осаждали. Клетки обрабатывали 2,5 мкл аннексина V и 2,5 мкл PI и инкубировали 15 мин в темных условиях. Клетки затем доводили до 1 мл и оценивали с помощью флуоресцентно-активированного клеткового сортирования (FACS, BD, FACSverse). Всего анализировали 10 000 клеток. Подобная процедура посева клеток и лечения препаратами следовала, затем окрашивали красителем Hoechst 33342 (10 мкг/мл) и инкубировали 10 мин. Клетки промывали и фиксировали 4% параформальдегидом (PFA) и снова промывали. Морфологию клеток наблюдали под флуоресцентным микроскопом (Nikon A1, Япония).

Антиопухолевая эффективность FNQ-MSN в ксеногенной модели опухоли HNSCC

Самцы мышей BALB/c весом 18–22 г, возрастом 4–5 недель, закупили в Центре животноводства Чжэнчжоуского университета легкой промышленности, Хэнань. Животных содержали в кондиционированной комнате с 12-часовым циклом темноты-света и давали свободный доступ к еде и воде. Все протоколы животных одобрены Этическим комитетом Чжэнчжоуского университета легкой промышленности, Хэнань. Для установления ксеногенной модели 1 × 10⁷ клеток Cal33 в 150 мкл среды культивирования инокулировали в правый бедро мыши подкожно. Когда средний размер опухоли достигает 80–100 мм³, мышей случайно разделили на 5 групп для контроля, 5-FU, β-лап, 5-FU+β-лап и FNQ-MSN соответственно по 8 мышей в каждой группе. 5-FU вводили при фиксированной дозе 5 мг/кг, а β-лап — при фиксированной дозе 25 мг/кг и вводили 3 раза с промежутком 3 дня для каждой внутривенной инъекции. Вес мыши и объем опухоли регулярно контролировали 18 дней. Объем опухоли рассчитывали по формуле:

$$ V\ \left({\mathrm{mm}}^3\right)={\mathrm{Width}}^2\ \left({\mathrm{mm}}^2\right)\times \mathrm{Length}\ \left(\mathrm{mm}\right)/2 $$

Настоящее исследование не наблюдало никакой смерти мышей из-за загрузки клеток опухоли, и все животные эвтаназировали CO₂, а затем принесли в жертву шейным смещением к концу исследования.

Статистический анализ

Множественные группы сравнивали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Уровень значимости p < 0,05 считался значимым, и все данные представлены как среднее ± стандартное отклонение, если не указано иное в соответствующих экспериментах.

Результаты и обсуждение

Приготовление 5-FU/β-лап-загруженных липидным двуслоем поддерживаемых мезопористых силицевых наночастиц

В этом исследовании мы настроили мезопористую силицевую наночастицу, стабилизированную PEGилированным липидным двуслоем. 5-FU/β-лап-загруженные MSN приготовили методом эмульсионно-звуковой обработки, а затем лекарственно-нагруженные MSN вводили в колбу, содержащую тонкую липидную пленку, состоящую из DSPE-PEG2000. Смесь зондировали и получили липид-покрытые MSN, содержащие 5-FU/β-лап (FNQ-MSN) (Рис. 1a). Эффективность загрузки (LE) 5-FU и β-лап составляла 91,5 ± 1,65% и 92,9 ± 1,24% соответственно. FNQ-MSN продемонстрировал 8,1 ± 1,12 мас.% 5-FU и 7,6 ± 0,95 мас.% β-лап, указывая на высокую грузоподъемность (LC) носителя MSN. Наличие липидного двуслоя предотвратит его нежелательное высвобождение в системном кровотоке и тем самым предотвратит токсичность. Средний размер частиц лекарственно-нагруженных MSN составлял 92,1 ± 0,85 нм (PDI ~ 0,089), в то время как сборка липидного двуслоя на поверхности MSN (FNQ-MSN) увеличила средний размер частиц до 128,4 ± 1,24 нм (PDI ~ 0,115), указывая на твердое наличие липидных материалов на поверхности MSN (Рис. 1b). Дзета-потенциал изменился от −18,2 ± 1,22 до −26,4 ± мВ. Малый размер частиц FNQ-MSN позволит преференциальное накопление лекарственно-нагруженного носителя в проницаемых опухолевых тканях благодаря эффекту EPR. Кроме того, поверхностная PEGилированность обеспечит отличную стабильность и продленное время кровообращения, что еще больше увеличит шансы FNQ-MSN в опухолевых тканях. TEM изображение показало морфологическое сходство с липосомой и представило идеальную сферическую форму, равномерно распределенную на сетке. TEM изображение четко показало серый внешний слой и более темное ядро, указывая на наличие липидной сборки на поверхности MSN (Рис. 1c). Размер, наблюдаемый на TEM, подтверждает размер частиц DLS от зетасайзера. MSN обладают хорошо упорядоченными каналами для гомогенного распределения молекул препарата. Свойство поверхности пор — один из важных факторов стабильной загрузки малых молекул. Различные физические силы, участвующие в хост-гостевом взаимодействии, в основном включают гидрофобные силы и силы Ван-дер-Ваальса. Высокая грузоподъемность обеспечит более высокую внутриклеточную концентрацию и более высокую эффективность уничтожения в опухолевых локализациях. FNQ-MSN продемонстрировал отличную стабильность в среде PBS, и размер частиц оставался неизменным на протяжении всего периода исследования до 30 дней. Такая улучшенная стабильность носительской системы и высокая грузоподъемность носительской системы улучшат биодистрибуцию и эффективность в лечении опухолей.

Ин витро высвобождение препарата

Ин витро высвобождение 5-FU и β-лап из FNQ-MSN изучали в PBS и ABS (Рис. 2). Как показано, наблюдались две разные тенденции высвобождения при pH 7,4 и pH 5,0. Например, 25% 5-FU высвободилось за 24 ч при pH 7,4 по сравнению с ~40% высвобождения препарата при pH 5,0 за 24 ч. Аналогично, 20% и 30% β-лап высвободилось при pH 7,4 и pH 5,0 соответственно. Кинетика высвобождения была идентичной на протяжении всего периода исследования с 50% высвобождения 5-FU в щелочном буфере и 80% высвобождения препарата при pH 5,0 после 72 часов периода исследования. pH-зависимое высвобождение препарата в кислых условиях преимущественно для лечения рака. Феномен взрывного высвобождения не наблюдался в обоих pH условиях, в основном из-за наличия слоя DSPE-PEG, который контролировал высвобождение препарата из FNQ-MSN на протяжении всего периода исследования. Значительная разница в высвобождении препарата наблюдалась между условиями pH 7,4 и pH 5,0. При условиях pH 7,4 PEG-b-DSPE демонстрирует высокое стелс-свойство слоя, тем самым предотвращая высвобождение инкапсулированного соединения. Настоящий результат показал, что высвобождение препарата ускорялось при pH 5,0, указывая на распад защитной оболочки вокруг поверхности MSN. pH-чувствительная скорость высвобождения препарата, обеспечивающая максимальное высвобождение внутри раковых клеток, может улучшить антиопухолевую эффективность и снизить нежелательную токсичность для нормальных тканей. Возможно, что в присутствии pH-реагирующего элемента FNQ-MSN может привести к сбрасыванию липидного двуслоя на MSN, что приведет к усиленному высвобождению в условиях более низкого pH.

Чувствительность NQO1 к β-лап

Поскольку регуляция вверх NQO1 во многих раковых клетках, включая HNSCC, ассоциируется с плохой прогнозом и плохим терапевтическим исходом, препараты, таргетирующие NQO1, могут быть потенциальной стратегией к лечению рака. NQO1 гиперекспрессирована на уровне от 100- до 200-кратном в чешуйчатоклеточной карциноме по сравнению с нормальными тканями. Поэтому влияние β-лап на активность фермента NQO1 изучали в клетках Cal33. Как показано, β-лап показал концентрационно-зависимую ингибицию активности фермента NQO1 в клетках Cal33 (Рис. 3a). Особенно значимый ингибиторный эффект наблюдался при дозе 20–50 мкг/мл β-лап. Кроме того, ингибиторный потенциал β-лап на белок NQO1 дополнительно изучали вестерн-блот анализом (Рис. 3b). Результаты четко выявили значительное снижение белка NQO1 в раковых клетках с увеличением концентрации β-лап. Приблизительно 80% ингибиции NQO1 наблюдалось при 100 мкг/мл β-лап. NQO1-биоактивируемый препарат, такой как β-лап, метаболизируется NQO1 и образует нестабильное гидрохиноновое соединение, которое немедленно конвертируется обратно в исходный компонент, оставляя 2 одноэлектронных окисления и потребляя 2 O²⁻. Это создает бесплодный редокс-цикл, в котором 1 молекула β-лап генерирует 130 моль супероксида за счет потребления 60–70 моль NAD(P)H6. Образующиеся супероксидные (O2.−) радикалы конвертируются в перекись водорода (H2O2−) и вызывают клеточную апоптоз и гибель клеток.

Ин витро антиканцерогенный эффект FNQ-MSN в клетках HNSCC

Ин витро антиканцерогенный эффект β-лап в клетках Cal33 изучали MTT-тестом. Результаты выявили, что β-лап демонстрировал типичное концентрационно-зависимое снижение жизнеспособности клеток (Рис. 4a). Особенно значительное снижение жизнеспособности клеток наблюдалось при концентрации 50 мкг/мл. Для дальнейших экспериментов выбрали 20 мкг/мл (ниже IC50 значения β-лап). Далее, потенцирующий эффект β-лап на 5-FU изучали при 3 разных концентрациях (5, 10 и 20 мкг/мл). Как показано, комбинация 5-FU+β-лап привела к более низкой жизнеспособности клеток; наиболее заметно, FNQ-MSN продемонстрировал значительно более низкую жизнеспособность клеток по сравнению с любым из отдельных препаратов или физических комбинаций (Рис. 4b). Например, 5-FU и β-лап показывали жизнеспособность клеток 35,7% и 70,2%, в то время как 5-FU+β-лап показывали 26,5%, а FNQ-MSN — 13,1% соответственно. Результаты четко показали, что цитотоксический эффект 5-FU значительно увеличивался при комбинации с β-лап. Стоит отметить, что FNQ-MSN был более эффективен по сравнению с 5-FU+β-лап, что приписывается лучшей интернализации и контролируемому высвобождению загруженных терапевтиков из носительской системы. Результаты четко раскрывают ингибиторный эффект β-лап на энзимную активность и уровни белка NQO1 и потенцируют антиканцерогенный эффект 5-FU, приводя к улучшенному терапевтическому исходу в лечении HNSCC.

Роль FNQ-MSN в сигнальных путях: Вестерн-блот анализ

Механизм цитотоксического эффекта, мединированного β-лап, дополнительно исследовали вестерн-блот анализом. Как показано, β-лап привел к снижению белковой полосы NQO1 по сравнению с контролем; однако наиболее заметное снижение уровня NQO1 наблюдалось в группе клеток, обработанных FNQ-MSN (Рис. 4c). β-лап-индуцированное усиление хемосенситивности Cal33 путем усиления клеточной апоптозы оценивали через уровень белка Bcl-2. Семейство Bcl-2 играет важную роль в регуляции клеточной гомеостаза и контроле пролиферации и гибели раковых клеток. Процесс снижения Bcl-2 и увеличения Bax приводит к высвобождению цитохрома C в цитозоле, что инициирует весь каскад каспаз, приводящий к гибели клеток. Результаты четко подчеркнули, что комбинация 5-FU и β-лап (FNQ-MSN) значительно регулировала вниз Bcl-2, указывая на усиленный антиканцерогенный эффект в клетках рака Cal33.

Анализ апоптоза HNSCC

После анализа жизнеспособности клеток, эффект апоптоза отдельного и комбинированного препарата на клетки Cal33 оценивали цитометром после окрашивания аннексином V/PI (Рис. 5). Эффект апоптоза отдельного 5-FU (10 мкг/мл) или β-лап (30 мкг/мл) не приводил к какому-либо значимому апоптозу раковых клеток; однако 5-FU+β-лап привел к драматическому увеличению пропорции апоптоза раковых клеток. Важно, FNQ-MSN привел к более чем 60% клеточного апоптоза (раннего и позднего), означая превосходный терапевтический эффект комбинационного режима на основе носителя. Эффект апоптоза дополнительно подтверждали окрашиванием Hoechst 33342. Как показано, клетки, обработанные FNQ-MSN, приводят к большему количеству клеток, проходящих апоптоз, ядерной конденсации и фрагментации по сравнению с либо 5-FU, либо β-лап в одиночку (Рис. 6). В процессе апоптоза клетки сокращаются без повреждения внешней клеточной мембраны и приводят к хроматиновой конденсации с увеличенным формированием апоптотических тел.

Live/Dead анализ

Антиканцерогенный эффект отдельного и комбинированного препарата дополнительно оценивали Live/Dead анализом. Обработанные клетки подвергали окрашиванию Calcein AM и этидиевым бромидом в качестве соответствующих маркеров живых и мертвых клеток (Рис. 7). Как показано, необработанные клетки окрашены 100% зеленой флуоресценцией. Отдельные препараты, 5-FU (10 мкг/мл) или β-лап (30 мкг/мл), хотя показывали слегка красную флуоресценцию окрашенных клеток; однако преобладающие клетки демонстрировали зеленую флуоресценцию, указывая на ограниченную гибель клеток. Заметная гибель клеток наблюдалась в раковых клетках, обработанных FNQ-MSN, как показано преобладающей красной флуоресценцией и меньшим количеством зеленых флуоресцентных окрашенных клеток. Более высокий антиканцерогенный эффект FNQ-MSN приписывался синергистической активности 5-FU и β-лап в раковых клетках и способности β-лап увеличивать хемосенситивность 5-FU.

Ин виво антиопухолевая эффективность FNQ-MSN против ксеногенной модели HNSCC

Для дальнейшей оценки эффективности комбинационного режима в животной модели, ксеногенную HNSCC подготовили и администрировали 5 мг/кг 5-FU и 10 мг/кг β-лап соответственно. Фармацевтический градус β-лап — ARQ761, который в настоящее время на фазе I клинических испытаний для лечения метастатических злокачественностей. β-лап установил предел максимально допустимой дозы у людей согласно доклиническим исследованиям. Учитывая это, мы оптимально выбрали дозу 10 мг/кг β-лап для ин виво исследований. Как показано, никакого значимого снижения объема опухоли не наблюдалось при индивидуально администрированных 5-FU и β-лап по сравнению с необработанным контролем (Рис. 8a). Заметное снижение объема опухоли наблюдалось с физической смесью 5-FU+β-лап; однако комбинированное лечение носителем 5-FU и β-лап (FNQ-MSN) значительно задержало рост опухоли и продлило выживание ксеногенных мышей с опухолями. График объема опухоли FNQ-MSN можно разделить на две части; незначительный рост объема опухоли наблюдался до 9 дня, в то время как опухоль значительно увеличивалась после 9 дня до 18 дня, тем не менее, общий объем опухоли был многоразово меньше по сравнению с контролем или другими группами. Токсикологическая проблема отдельного и комбинационного режимов оценивали в терминах массы тела (Рис. 8b). Как показано, физическая смесь 5-FU+β-лап привела к серьезной токсичности, представленной более чем 10% потере массы тела, в то время как 5-FU привела к 5% потере массы тела. Как ожидалось, FNQ-MSN не привел к потере массы тела, указывая на уникальное преимущество липид-MSN-базированной носительской системы. Усиленный антиопухолевой эффект FNQ-MSN приписывался ингибиторному эффекту β-лап по отношению к ферменту и белку NQO1, который в свою очередь увеличил хемосенситивность 5-FU и привел к синергистическому антиканцерогенному эффекту в человеческих опухолях Cal33, вторым, липидным двуслоем покрытые MSN защищали препарат во время системного кровообращения и могли высвобождать контролируемым образом в опухолевой ткани, третьим, PEGилирование наноносителя могло продлить время кровообращения, позволяя преференциальное накопление в опухолевых тканях благодаря эффекту EPR. PEGилированные MSN в основном застревали в RES печени, селезенки и легких, учитывая более 80% администрированной дозы. PEG модификация MSN очевидно снизила скорость очистки MSN в органах, демонстрируя, что PEGилированные NP были труднее удалены из органов RES независимо от формы частицы. В целом, ин виво исследование на модели HNSCC предлагает «доказательство концепции», что эффективная комбинация 5-FU+β-лап в стабильном наноносителе может улучшить терапевтическую эффективность в опухоли, облегчая ассоциированный токсический эффект.