Противоопухолевый эффект меченных 131I наночастиц мезопористого диоксида кремния, меченных 131I, при анапластическом раке щитовидной железы

Фон

Анапластический рак щитовидной железы (АТС) составляет лишь около 2% всех случаев рака щитовидной железы; однако это местно-агрессивный тип опухоли с высоким уровнем отдаленных метастазов. Как правило, средняя выживаемость пациентов с ATC составляет около 6 месяцев, и только 20% пациентов выживают через 1 год после постановки диагноза из-за сосудистой катастрофы и коллапса дыхательных путей, вызванного агрессивным регионарным заболеванием, поражающим ткани шеи и лимфатические узлы и / или метастазы в легких [1 , 2]. Радиоактивный йод-131 ( ¹³¹ I) играет важную роль в диагностике и лечении метастазов дифференцированного рака щитовидной железы (DTC) [3,4,5]. Однако обычный ¹³¹ Метод лечения I не подходит для АТГ из-за его свойств, не способных концентрировать йод [6].

Ангиогенез является основным фактором, способствующим выживанию, росту, миграции и метастазированию раковых клеток. Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) является важным регуляторным цитокином в ангиогенезе и играет важную роль в развитии ATC. Хорошо известная роль VEGF в ангиогенезе означает, что радиоактивно меченые лиганды, такие как бевацизумаб, которые нацелены на рецептор VEGF (VEGFR), были успешно разработаны для раннего и чувствительного обнаружения поражений с использованием позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) и однофотонной эмиссионной компьютерной томографии ( ОФЭКТ) методы визуализации. VEGFR-2 выполняет большинство функций VEGF в эндотелиальных клетках кровеносных сосудов и отвечает за пролиферацию за счет активации пути митоген-активируемой протеинкиназы, миграции эндотелиальных сосудов и стимуляции ангиогенеза и роста сосудов [7, 8 ]. Экспрессия VEGF повышается в клетках ATC эпителиального происхождения по сравнению с нормальной тканью щитовидной железы [9,10,11]. Стратегии против VEGF были разработаны, чтобы подавить рост новых кровеносных сосудов и лишить опухоли необходимого кислорода и питательных веществ. В нескольких доклинических исследованиях были разработаны препараты, нацеленные на VEGFR2 при АТС с разной степенью успеха [12,13,14,15]. Однако одной из основных проблем, связанных с этими противораковыми препаратами, является их низкая биодоступность и неэффективная доставка к месту назначения. Многие противоопухолевые препараты гидрофобны и нуждаются в биосовместимых системах доставки лекарств, чтобы улучшить их биодоступность и облегчить внутривенное введение.

Наночастицы, включая наночастицы на основе металлов, полимеров и липидов, можно использовать для объединения терапевтического агента с агентом визуализации. Нацеливающие лиганды / фрагменты, такие как пептиды, антитела, радионуклиды или фрагменты антител, могут быть присоединены к наночастицам для повышения их терапевтической эффективности. Для лечения рака наночастицы могут накапливаться в области опухоли за счет повышенной проницаемости и удерживающего эффекта с возможностью доставки терапевтических агентов более локализованным образом. В течение многих лет в материаловедении и инженерии диоксид кремния считался универсальным и относительно безопасным материалом из-за множества доступных физических и химических модификаций, которые он предлагает, а также его хорошей биосовместимости [16]. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) считает кремнезем «в целом безопасным» [17, 18]. Среди различных материалов на основе диоксида кремния мезопористые наночастицы диоксида кремния (MSN) выделяются как класс наноматериалов со многими отличительными преимуществами, такими как их нетоксичная природа, хорошая поверхностная проницаемость, большая площадь поверхности, настраиваемые структуры пор, превосходная физико-химическая стабильность, и химически модифицируемые поверхности, которые делают их потенциальными хозяевами для различных химических агентов и / или терапевтических препаратов [19]. Аналогичным образом было продемонстрировано, что мезопористые углеродные наноматериалы являются отличными наноносителями при доставке лекарств [20,21,22]. В последние годы усилия в области MSN были сосредоточены на сочетании терапевтических возможностей и возможностей визуализации. Маркировка наночастиц с помощью зондов для визуализации - ценный инструмент, позволяющий отслеживать их in vitro и in vivo. В настоящее время целевые методы лечения представляют собой обнадеживающую стратегию лечения АТС [23, 24].

Вдохновленные ключевой ролью таргетной терапии и молекулярной визуализации против VEGFR в исследованиях рака и преимуществами, предлагаемыми MSN, в этом исследовании мы разработали анти-VEGFR2, нацеленную на потенциально тераностическую наноплатформу, основанную на поверхностной инженерии MSN для одновременной неинвазивной визуализации SPECT и усиленный in vivo ¹³¹ Я терапевтический эффект. Мы стремились определить, действительно ли ¹³¹ Меченые I анти-VEGFR2 целевые MSN будут иметь противоопухолевую эффективность на модели голых мышей, несущих опухоль ATC, с последующими обширными исследованиями in vivo, in vitro и ex vivo.

Материалы и методы

Материалы

Среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM), 0,25% трипсин-ЭДТА и фетальная бычья сыворотка (FBS) были приобретены у Gibco (Калифорния, США). Антибиотики (пенициллин G, стрептомицин и нистатин) были приобретены у Dingguo Biotechnology Co. Ltd. (Пекин, Китай). Бромид гексадецилтриметиламмония (CTAB), тетраэтилортосиликат (TEOS), 3-аминопропилтриэтоксисилан (APTES), диметилсульфоксид (DMSO), 1- (3-диметиламинопропил) -3-этилкарбодиимид гидрохлорид (EDC) -гидроксисукцинимид (NHS) и флуоресцеинизотиоцианат (FITC) были приобретены у Sigma-Aldrich (Германия). Na ¹³¹ Был куплен в Atomic Hitech (Пекин, Китай). Антитела против VEGFR2 были приобретены у Abcam Co. Ltd. (Великобритания).

Характеристики

Наночастицы диспергировали в этаноле с образованием суспензии, наносили на медную сетку с углеродным покрытием и сушили не менее 24 часов. Морфологию наночастиц определяли с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) (JEOL-100CXII, Япония) при ускоряющем напряжении 200 кВ. Дзета-потенциалы и гидродинамические диаметры образцов измеряли с помощью динамического рассеяния света (DLS) с использованием Zetasizer (Nano ZS90, UK). Распределение пор по размерам и площади поверхности MSN были охарактеризованы анализами Брунауэра – Эммета – Теллера (БЭТ) и Барретта – Джойнера – Халенды (BJH) (ASAP2020M, США).

Культура клеток

Человеческую клеточную линию ATC FRO [25] (приобретенную в Центре клеточных ресурсов Института фундаментальных медицинских наук Пекинского медицинского колледжа Пекинского союза в Пекине, Китайская Народная Республика) культивировали при 37 ° C в увлажненном инкубаторе со смесью 5% CO ₂ и 95% воздуха с добавкой 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина. Среду заменяли через день, и клетки пассировали трипсином после достижения слияния. Клетки предварительно культивировали до достижения примерно 80% слияния перед каждым экспериментом.

Подготовка и модификация поверхности наночастиц кремнезема

Синтез MSN и аминирования

MSN были синтезированы, как сообщалось ранее [26]. Вкратце, 50 мг ЦТАБ добавляли к смеси 25 мл воды, 5 мл этанола и 100 мкл 2 М раствора NaOH в круглодонной колбе при непрерывном перемешивании при 70 ° C. Затем в смесь добавляли 200 мкл TEOS и оставляли реагировать в течение 1 часа. Затем реакционный раствор центрифугировали и пять раз промывали этанолом при 10000 об / мин. Затем продукты ресуспендировали в 10 мл этанола. После удаления шаблона CTAB продукт затем ресуспендировали в 5 мл ДМСО и 100 мкл APTES, которые добавляли по каплям в полученную смесь для модификации поверхности диоксида кремния путем аминирования. После перемешивания в течение ночи осадки отделяли центрифугированием, пять раз промывали этанолом, а затем MSNs-NH ₂ были получены.

Синтез BSA-MSNs-Anti-VEGFR2

В указанный выше продукт добавляли пять миллиграммов бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 50 мкл антител против VEGFR2 (MSNs-NH ₂ , 50 мг) и прореагировала при перемешивании в течение 2 часов. Смесь промывали водой пять раз, после чего к смеси добавляли 1,1 мг NHS и 1,6 мг EDC и перемешивали в течение ночи при комнатной температуре в 5 мл воды. Осадки отделяли центрифугированием, промывали водой пять раз, в результате чего успешно получали BSA-MSNs-anti-VEGFR2.

¹³¹ I Радиоактивная маркировка наночастиц

Полученные наночастицы были помечены радиоактивным изотопом ¹³¹ . Я использую метод хлорамина-Т (обозначен как ¹³¹ I-BSA-MSN и ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 соответственно) [27]. Вкратце, примерно 100 мкг BSA-MSN или BSA-MSN-anti-VEGFR2 разбавляли 100 мкл фосфатного буфера (PB) и 74 МБк ¹³¹ Я был добавлен. Затем к смеси добавляли хлорамин-T (100 мкл; 5 мг / мл в PB). После 60 с встряхивания и инкубации реакцию останавливали добавлением 100 мкл метабисульфита натрия (5 мг / мл в PB). Центрифужную пробирку использовали для отделения меченых BSA-MSN и BSA-MSN-anti-VEGFR2 от низкомолекулярных соединений. Скорость маркировки и радиохимическая чистота ¹³¹ Меченые наночастицы определяли с помощью тонкослойной хроматографии.

Использование клеток in vitro:исследование с помощью конфокальной микроскопии

Во-первых, MSN-анти-VEGFR2 и MSN были помечены FITC [28]. Вкратце, MSNs-NH ₂ (100 мг) добавляли к 1 мл спиртового раствора FITC (1 мг / мл) с выдержкой в ​​течение 4 ч при перемешивании. Меченные FITC MSN (FITC-MSN) получали центрифугированием и сушили в вакууме. FITC-MSNs-anti-VEGFR2 также может быть получен с использованием того же метода.

Клетки FRO высевали в 6-луночные планшеты на ночь, а затем 5 × 10 ⁵ клетки на лунку инкубировали с FITC-MSN и FITC-MSN-anti-VEGFR2 в течение 1 и 6 часов при 37 ° C соответственно. Клетки промывали трижды фосфатным буферным солевым раствором (PBS), а затем фиксировали 70% этанолом в течение 20 минут. Кроме того, клетки трижды промывали PBS и ядра окрашивали 4,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) в течение 45 минут, а затем фиксировали параформальдегидом (4% в PBS). Изображения конфокальной микроскопии получали с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) (Zeiss LSM 510, США).

Зависимый от времени охват сотовой связи

Чтобы измерить зависящее от времени поглощение наночастицами йода-131 клеткой, 1 × 10 ⁵ клетки на лунку культивировали с 3,7 МБк / мл свободного Na ¹³¹ Я, ¹³¹ I-BSA-MSN или ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 соответственно. Затем клетки промывали как можно быстрее 1 мл буферного раствора сбалансированного солевого раствора (HBSS), отделяли трипсином и ресуспендировали в 1 мл HBSS в течение 1, 2, 3, 5, 7 и 9 часов. Радиоактивность измеряли с помощью гамма-счетчика (LKB gamma 1261, Австралия). Все эксперименты проводились трижды для получения точных данных.

Модель животного

Голых мышей Balb / c (самки, возраст примерно 4 недели, вес 15–20 г) были приобретены в Пекинском исследовательском центре экспериментальных животных при Пекинском союзном медицинском колледже и содержались в определенных условиях, свободных от патогенов, при относительной влажности (30–70). %) и контролируемая температура (20–24 ° C) среда в Центре лабораторных животных Тяньцзиньского медицинского университета, Китай. Все процедуры обращения с животными проводились в соответствии с протоколом, утвержденным Комитетом по этике больницы общего профиля Тяньцзиньского медицинского университета. Ксенотрансплантаты опухоли FRO индуцировали подкожной инъекцией 5 × 10 ⁶ Клетки FRO в 50 мкл PBS в правое плечо мышей.

In Vivo Imaging

Когда голых мышей с опухолью кормили в течение 1-2 недель и объем опухоли достигал примерно 10 мм в диаметре, мышей случайным образом делили на три группы (Na ¹³¹ Я, ¹³¹ I-BSA-MSN и ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2). Каждая группа получила 7,4 МБк ¹³¹ Я путем внутриопухолевой инъекции, чтобы оценить локализацию в органе ¹³¹ I-меченые наночастицы. Сцинтиграфическое изображение было выполнено через 1, 2, 3, 7, 14 и 21 день после инъекции соответствующего лекарства. Голых мышей анестезировали 4% хлоралгидратом (150 мкл) перед каждым сканированием, помещали в положение лежа и затем визуализировали с помощью сканера SPECT / CT (Discovery NM / CT 670, США). Чтобы избежать воздействия на ткань щитовидной железы нежелательного излучения и изображений, перхлорат натрия (0,05 мг / мл) добавляли в питьевую воду для всех мышей за 1 день до эксперимента и поддерживали в течение 1 недели.

Распространение тканей

Через 24 и 72 часа после внутриопухолевой инъекции 7,4 МБк ¹³¹ I-меченые наночастицы, мыши в каждой группе ( n =3 / группа) были принесены в жертву вывихом шейки матки, и сердце, селезенка, почки, печень, кишечник, легкие и опухолевые ткани были удалены и взвешены. Радиоактивность в различных органах измеряли с помощью счетчика γ (LKB gamma 1261, Австралия), и радиоактивность выражали как процент введенной дозы на грамм ткани (% ID / г).

In Vivo ¹³¹ I терапия

Как и при визуализации in vivo, мышам трех групп внутриопухолево вводили дозу 74 МБк (50 мкл) ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2, ¹³¹ I-BSA-MSN и Na ¹³¹ I, соответственно, когда объем опухоли достигал примерно 10 мм в диаметре. Такой же объем физиологического раствора вводили в качестве контрольной группы. Объем опухоли оценивался по следующей формуле:объем =4π / 3 (1/2 длины × 1/2 ширины × 1/2 высоты) [15, 29]. Объем опухоли и массу тела животного измеряли каждые 3 дня. Мышей умерщвляли, если они теряли более 20% массы тела или умирали.

Гистологическое исследование

По окончании эксперимента мышей умерщвляли и выделяли опухоль и нормальные ткани четырех групп, включая сердце, печень, селезенку, почки и легкие, для изучения их гистопатологии. Вкратце, парафиновые срезы толщиной 5 мм депарафинизировали, используя две инкубации с ксилолом (в течение 30 мин каждая при 56 ° C), а затем регидратировали в этаноле. Затем срезы замачивали на ночь в 10% сахарозе в дистиллированной воде. После этого срезы промывали 0,1 М PBS, pH 7,4, инкубировали в 1,2% перекиси водорода в метаноле в течение 30 минут и промывали в 0,1 M PBS, pH 7,4, в течение 15 минут. Затем слайды с опухолями инкубировали во влажной камере в течение ночи при комнатной температуре с разведением антител против VEGFR2 1:100. После трехкратной промывки PBS слайды инкубировали с системой обнаружения DAKO-REAL ™ En-Vision ™ в течение 60 мин, затем визуализировали с использованием диаминобензидина и окрашивали гематоксилином Майера. Все изображения были получены с помощью микроскопа Olympus.

Статистический анализ

Все данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение (SD), и статистический анализ был выполнен с использованием SPSS (Статистический пакет для социальных наук) 12.0 для окон (SPSS, Чикаго, Иллинойс, США). Анализ данных проводился с использованием кривых Каплана – Мейера и лог-рангового критерия. Все статистические тесты были двусторонними, и P значение <0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

Характеристики наночастиц

Характеристики наночастиц были проанализированы и определены методами ПЭМ и ДРС (рис. 1а – в). Изображение ПЭМ продемонстрировало, что MSN имели однородную сферическую морфологию, а изображение DLS показало, что MSN были однородными с размером 108 ± 5,9 нм. Модификация BSA и / или нацеливание против VEGFR2 не изменяли морфологию наночастиц и приводили только к небольшой тенденции к агрегации в растворе по сравнению с немодифицированными MSN, что могло быть вызвано увеличенной площадью поверхности нанокомплексов. Диаметр BSA-MSNs-anti-VEGFR2 немного увеличился до 163 ± 4,6 нм, а средний дзета-потенциал MSN составил -23,91 мВ, который изменился до 28,45 мВ для BSA-MSNs-anti-VEGFR2. Изменение дзета-потенциала и увеличение размера после модификации поверхности свидетельствует об успешном добавлении BSA и анти-VEGFR2 на поверхность MSN на каждом этапе (таблица 1). Текстурные характеристики MSN были дополнительно подтверждены изотермой адсорбции-десорбции азота. МСН имеют четко выраженную мезопористую структуру с площадью поверхности 630,2 м ² . / г, и средний диаметр пор 2,8 нм (рис. 1г). Стабильность наночастиц BSA-MSNs-anti-VEGFR2 контролировали в течение нескольких недель, и не наблюдалось явной агрегации. Доля ¹³¹ У меня маркировка составляла примерно 50–75%.

Характеристики наночастиц. Характеристики MSN ( a ), BSA-MSN ( b ), BSA-MSNs-anti-VEGFR2 ( c ), изотерма адсорбции-десорбции азота и кривые распределения пор по размерам Барретта – Джойнера – Халенды (BJH) для MSN ( d ). Изображения просвечивающей электронной микроскопии показывают, что все они имели правильную (однородную сферическую) морфологию. Изображения динамического рассеяния света показывают, что все они были однородными со средними размерами 108 нм, 139 нм и 163 нм соответственно. Анализы BET и BJH продемонстрировали типичные изотермы типа IV, соответствующие мезопористой структуре

Использование искусственных наночастиц

Связывание BSA-MSN и BSA-MSN-anti-VEGFR2 с целевыми клетками FRO клеточной линии ATC человека исследовали с помощью конфокальной микроскопии (фиг. 2). Иммунофлуоресценция показала, что как нацеленные, так и нецелевые MSN могут эффективно связываться с клетками FRO. После 1 часа инкубации с BSA-MSN или BSA-MSNs-anti-VEGFR2 в клетках присутствовала видимая флуоресценция, которая сохранялась и усиливалась после 6 часов инкубации. По сравнению с BSA-MSNs-anti-VEGFR2, BSA-MSNs также могли связываться с клетками, но мы обнаружили, что удерживание опухолевых клеток было минимальным, а сигнал зеленой флуоресценции был слабым. Этот результат свидетельствует о том, что способность наночастиц к нацеливанию была усилена за счет модификации антителом против VEGFR2.

Поглощение сконструированных наночастиц. Изображения, полученные с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа, показали клеточную интернализацию различных составов через 1 и 6 ч для BSA-MSN и BSA-MSN-anti-VEGFR2. Флуоресцентный сигнал через 1 час увеличился через 6 часов для обеих групп. Кроме того, связывающая зеленая флуоресценция в группе-мишени против VEGFR2 была сильнее, чем в группе, не являющейся мишенью, в оба момента времени

Зависимый от времени охват сотовой связи

Для определения поглощения радиоактивного йода Na ¹³¹ Я, ¹³¹ I-BSA-MSN и ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 с течением времени, ¹³¹ Измерения активности с синхронизацией по времени были получены в клетках FRO. Как показано на рис. 3a, ¹³¹ Поглощение в этой клеточной линии достигло максимального уровня после 3 часов инкубации с ¹³¹ I-BSA-MSN и через 5 часов с ¹³¹ I-BSA-MSNs-анти-VEGFR2. Кроме того, потребление радиоактивного йода ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 был выше, чем у ¹³¹ I-BSA-MSN.

Зависящее от времени клеточное поглощение и тканевое распределение. а Данные о захвате клетками в зависимости от времени представлены как среднее значение ± стандартное отклонение для трех групп. б Сравнение данных по биораспределению ¹³¹ I в опухоли и основных органах мышей, несущих опухоль ATC, через 24 и 72 часа после внутриопухолевой инъекции Na ¹³¹ Я, ¹³¹ I-BSA-MSN и ¹³¹ I-BSA-MSNs-анти-VEGFR2. Радиоактивность опухолевой ткани целевой группы анти-VEGFR2 через 24 и 72 часа после внутриопухолевой инъекции (32,2 ± 2,8% ID / г и 23,0 ± 1,8% ID / г, соответственно) была значительно выше, чем у нецелевой группы (26,1 ± 2,5% ID / г и 12,3 ± 1,2% ID / г, соответственно) (все P <0,05). Данные также представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение для трех групп

Распространение тканей

Распределение ¹³¹ в тканях I у голых мышей измеряли с помощью γ счетчик через 24 и 72 ч после внутриопухолевого введения соответствующих препаратов (рис. 3б). Результаты показали, что в трех группах наблюдалось аналогичное накопление радиации в нормальных тканях через 24 и 72 часа. Радиоактивность для всех групп со временем постепенно снижалась и в основном накапливалась в опухоли. Кроме того, накопление в опухолевой ткани через 24 и 72 часа после инъекции в двух группах с ¹³¹ Количество наночастиц, меченных I, было намного больше, чем в Na ¹³¹ I группа, которая составила 11,6 ± 0,9% ID / г через 24 часа и резко снизилась до 2,1 ± 0,08% ID / г через 72 часа. Однако концентрация в опухоли целевой группы анти-VEGFR2 через 24 и 72 часа после инъекции составляла 32,2 ± 2,8% ID / г и 23,0 ± 1,8% ID / г, соответственно, что было значительно выше, чем у неинфекционных препаратов. целевая группа (26,1 ± 2,5% ID / г и 12,3 ± 1,2% ID / г, соответственно, все P <0,05).

In Vivo Imaging

Чтобы определить ¹³¹ Я поглощаю и распределяю наночастицы и наблюдаю время пребывания ¹³¹ I в опухолевой ткани in vivo репрезентативные изображения SPECT / CT мышей с опухолью FRO были получены в различные моменты времени после внутриопухолевой инъекции соответствующих лекарств (фиг. 4a). Результаты показали, что радиоактивное накопление в Na ¹³¹ Группа I быстро выводилась из опухоли через 2 дня после инъекции и не наблюдалась через 3 дня после инъекции. Напротив, две группы с ¹³¹ Меченые I наночастицы имели более медленный клиренс из крови и более высокое накопление в опухолевой ткани даже через 2 недели после инъекции, особенно в целевой группе против VEGFR2. Примечательно, что через 3 недели после инъекции радиоактивность в целевой группе была явно выше, чем в нецелевой группе.

Визуализация in vivo, in vivo ¹³¹ I терапия и анализ выживаемости. а Объединенные ОФЭКТ / КТ и трехмерные изображения мышей с опухолью ATC, полученные в разные моменты времени после внутриопухолевой инъекции соответствующих препаратов. Радиоактивное накопление в Na ¹³¹ Группа I не наблюдалась через 3 дня после инъекции, но была очевидна даже через 3 недели после инъекции в целевой группе против VEGFR2. Объем опухоли ( b ), масса тела ( c ) изменяется, а кривые выживаемости Каплана – Мейера ( d ) в моделях ксенотрансплантатов FRO ATC ( n =6 / группа). Рост опухоли и потеря массы тела в целевой группе были значительно подавлены по сравнению с таковыми в нецелевой группе, Na ¹³¹ I или физиологический раствор соответственно. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение для трех групп, и все они были P < 0,05. Кроме того, среднее время выживания в целевой группе (41 день) было значительно увеличено по сравнению с таковой в нецелевой (34 дня) или Na ¹³¹ I (25 дней) группа (все P < 0,01)

In Vivo ¹³¹ I терапия

На рисунке 4b показан средний объем опухоли во времени в четырех группах. Объем опухоли перед инъекцией использовался в качестве исходного стандарта. За исключением ¹³¹ В группе I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 опухоли постепенно росли во всех группах, особенно в группе Na ¹³¹ I и физиологические группы. На 24 день средний объем опухоли в Na ¹³¹ I и физиологический раствор составляли 296,6 ± 24,2% и 278,3 ± 19,3% соответственно по сравнению с 198,7 ± 13,2% в группе ¹³¹ . Группа I-BSA-MSN на 30-й день. Интересно, что мы наблюдали, что объем в целевой группе анти-VEGFR2 медленно снижался после 9-го дня после инъекции и почти упал до исходного уровня в конце наблюдения.

На рис. 4в показаны изменения массы тела в четырех группах. Масса тела у Na ¹³¹ постепенно снижалась. I и физиологические группы в период наблюдения. Однако две другие группы потеряли вес только в первую неделю, который был восстановлен в более поздние моменты времени, особенно для целевой группы против VEGFR2.

Анализ выживаемости

В этом исследовании мы использовали вероятность выживания в качестве еще одного показателя для оценки терапевтического эффекта ¹³¹ I-меченые наночастицы. На рисунке 4d показаны кривые выживаемости Каплана – Мейера после обработки физиологическим раствором Na ¹³¹ . Я, ¹³¹ I-BSA-MSN или ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 в модели телесных мышей, несущих опухоль ATC. Опухоли быстро прогрессировали в физиологическом растворе и Na ¹³¹ . I группы, а среднее время выживания составляло 27 и 25 дней соответственно. Анализ с помощью лог-рангового теста показал, что среднее время выживания в ¹³¹ Группа I-BSA-MSN (34 дня) была значительно продлена по сравнению с группой, получавшей Na ¹³¹ I группа ( P < 0,001). Кроме того, мы обнаружили, что лечение в целевой группе анти-VEGFR2 (среднее время выживания, 41 день) привело к значительно лучшим результатам выживания, чем лечение в нецелевой группе ( P <0,01).

Гистопатологический анализ

Чтобы оценить противоопухолевый эффект ¹³¹ I-меченные наночастицы и испытания потенциальной токсичности MSN у мышей, основных органов и опухолей были собраны на предмет окрашивания гематоксилином и эозином после лучевой терапии. После лечения ¹³¹ у мышей с опухолью не наблюдалось значительных патологических изменений в жизненно важных органах. I-меченые наночастицы (рис. 5а). Это указывало на отсутствие явной системной токсичности в течение периода наблюдения. Кроме того, опухоли, обработанные ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 показал дегенерацию и массивный некроз опухолевых клеток, что было более очевидным, чем у ¹³¹ Группа I-BSA-MSNs. Однако опухоль, обработанная Na ¹³¹ Группа I или физиологического раствора была заполнена жизнеспособными опухолевыми клетками. Иммуногистохимический анализ опухоли выявил видимую экспрессию VEGFR (рис. 5b).

Гистопатологический анализ. а Гистопатологический анализ основных органов мышей с опухолью FRO ATC после обработки ¹³¹ I-меченые наночастицы. Существенных патологических изменений со стороны сердца, печени, легких и почек не наблюдалось. б Патологические исследования (окрашивание H &E) и иммуногистохимический анализ опухолей у мышей. Большие фрагменты дегенерации и некроза опухолевых клеток в целевой группе против VEGFR2 и небольшие фрагменты некроза низкой плотности в ¹³¹ Отображается группа I-BSA-MSN. Напротив, в Na ¹³¹ наблюдались только жизнеспособные опухолевые клетки. I и физиологические группы. Микрофотография иммуногистохимического анализа показала видимую экспрессию VEGFR. Бар =200 мкм

Обсуждение

Прогноз АТХ остается плохим, и пока нет эффективных вариантов лечения [1, 2, 6]. Таргетная молекулярная терапия, как новая терапия, снизила заболеваемость и смертность от многих видов рака [23, 24]. VEGFR is crucial to microvascular formation, which facilitates the growth of most malignancies, and allows continued tumor expansion [9, 10]. In this study, we evaluated the efficacies of Na ¹³¹ I, ¹³¹ I-BSA-MSNs, and ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 for the treatment of ATC in tumor-bearing nude mouse models. The results demonstrated that both anti-VEGFR2 targeted and non-targeted nanoparticles labeled with ¹³¹ I were effective in delaying the tumor growth of ATC and that the ¹³¹ I-labeling anti-VEGFR2 targeted MSNs was the most effective agent to inhibit the tumor growth in nude mice and prolonging median survival. This treatment modality might represent a novel therapeutic option for ATC.

VEGFR targeting with nanoparticles is rarely reported in the literature. Goel S et al. [19] confirmed that VEGFR targeting using VEGF₁₂₁ conjugated, anti-VEGFR therapeutics-loaded MSNs represented a major advance for angiogenesis imaging and inhibition in human glioblastoma. A study performed by Gule indicated that inhibition of epidermal growth factor receptor (EGFR) and VEGFR2 in ATC using vandetanib causes significant tumor growth inhibition in vivo in an orthotopic xenograft model [15]. In the present study, using confocal microscopy, we found that both targeted and non-targeted nanoparticles could efficiently bind to the cytoplasm and cytoplast of FRO cells, and further confirmed that the targeting ability of the nanoparticles was enhanced via modification with the anti-VEGFR2 antibody, which result was consistent with that of the time-dependent cellular uptake experiment. Additionally, after intratumoral injection with the respective drugs, we compared data on the tissue distribution of ¹³¹ I in the tumor-bearing nude mice at 24 and 72 h for the different groups. The radioactivity for all groups was mostly accumulated in the tumor and gradually decreased with time. Moreover, we found that the radioactivity in anti-VEGFR2 targeted group could be retained for longer time in the tumor in comparison with non-targeted group, which was also consistent with the results observed by confocal microscopy.

SPECT/CT is a powerful tool to provide both structural and functional imaging information for diseases, and can monitor the metabolism of radioactive drugs at different times post injection [30,31,32]. In the present study, we compared data on the tissue distribution of ¹³¹ I using SPECT/CT. The results showed that radioactive accumulation in the Na ¹³¹ I group was not seen at 3 day post-injection. However, higher accumulation in the tumor tissue was observed at 2 weeks post-injection for the two groups with ¹³¹ I-labeled nanoparticles, and at 3 weeks the radioactive signal in the anti-VEGFR2 targeted group was apparently stronger than that in the non-targeted group. We hypothesized that the passive tumor targeting of MSNs, which relies on unpredictable tumor extravasation and enhanced permeability retention effect, and positive targeting linked with anti-VEGFR-2, associated with VEGFR2 overexpression in ATC, played a key role in enhancing the retention of the nanoparticles in the tumors. This finding revealed that anti-VEGFR2 modification prolonged the retention time of ¹³¹ I in the tumor tissue compared with that of free Na ¹³¹ I and ¹³¹ I-BSA-MSN, which was also similar to the tissue biodistribution of ¹³¹ I measured by γ counter.

In the present study, we monitored the body weight change of nude mice after intratumoral injection with a single dose of 2 mCi ¹³¹ I, which showed that the body weight in the ¹³¹ I-labeled nanoparticle groups gradually increased at 1 week post-injection, especially for the anti-VEGFR2 targeted group. Similarly, we also observed the changes in tumor volume and found that the tumors in the Na ¹³¹ I or saline group grew rapidly, while the volume in ¹³¹ I-BSA-MSNs group increased slowly. Interestingly, the tumors in anti-VEGFR2 targeted group gradually decreased after 1 week post-injection, which was contrary to the body weight change. These results indicated that the anti-VEGFR2 modification could effectively inhibit the increase in tumor volume and thereby enhanced the efficiency of ¹³¹ I therapy. We considered that the tumor necrosis was caused by the beta rays emitted from ¹³¹ I, which resulted in tumor shrinkage and indirectly led to an increase in body weight. This effect, we speculated, began to appear mainly 1 week after injection of ¹³¹ I.

Our findings indicated that the treatment mediated by intratumorally injected ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 resulted in significant tumor growth delay, which was confirmed increased structural damage and massive necrosis in tumor tissue compared with that in the ¹³¹ I-BSA-MSNs group. Significantly, this higher antitumor activity was achieved without causing apparent systemic toxic effects, as indicated by the lack of significant pathological changes in the vital organs observed in tumor-bearing nude mice. Although further studies are needed to document both the acute and chronic toxicological effects, ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 exhibited several properties that made them a promising candidate for minimally invasive therapy for ATC.

In our pre-experiment, injection into the tail vein was performed and the results showed that the radioactivity was mainly distributed in the phagocytosis system. Intratumoral injection was used in some studies [29, 33, 34], and the operation is more convenient. Therefore, we used intratumoral injection as the injection method and also achieved better results. MSNs offer a promising approach to overcome the insolubility issue and deliver large payloads of hydrophobic small molecule drugs. Currently, we are investigating the potential for loading targeted anti-cancer drugs using MSNs. We will provide the results in the future publication.

Conclusions

In the present study, we successfully synthesized BSA-MSNs-anti-VEGFR2, with uniform spherical morphology, and which were radiolabeled with ¹³¹ I using the Chloramine-T method. The results showed that both targeted and non-targeted MSNs could efficiently bind to the cytoplasm and cytoplast of FRO cells. The radioactivity in ATC tumor-bearing nude mouse model was mostly accumulated in the tumor and could be retained a longer time in the ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 group. Additionally, the tissue distribution of ¹³¹ I could be also imaged and validated using SPECT/CT. Moreover, tumor growth in the ATC tumor-bearing nude mouse model was significantly inhibited by the anti-VEGFR2 targeted MSNs compared with that achieved using non-targeted MSNs and the ¹³¹ I treatment with anti-VEGFR2 targeting MSNs significantly prolonged the survival of ATC tumor-bearing mice. Our data supported the view that such an approach may represent a more effective means to treat ATC.

Сокращения

APTES:

Aminopropyltriethoxysilane

ATC:

anaplastic thyroid cancer

BSA:

Бычий сывороточный альбумин

CLSM:

Confocal laser scanning microscopy

CTAB:

Hexadecyltrimethylammonium bromide

DAPI:

4,6-Diamidino-2-phenylindole

DLS:

Динамическое рассеяние света

DMEM:

Среда Игла, модифицированная Дульбекко

DMSO:

Диметилсульфоксид

EDC:

1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride

FBS:

Фетальная бычья сыворотка

FITC:

Fluorescein isothiocyanate

HBSS:

Hanks’ balanced salt solution

MSNs:

Mesoporous silica nanoparticles

NHS:

N -hydroxysuccinimide

PBS:

Фосфатный буферный раствор

ТЕМ:

Просвечивающий электронный микроскоп

TEOS:

Тетраэтилортосиликат

VEGFR:

Vascular endothelial growth factor receptor