Высокопроизводительные полиэлектролитные микрокапсулы с PEGилированными квантовыми точками для передовых биоизображений

Аннотация

Флуоресцентная визуализация является краеугольным камнем современной диагностики, обеспечивая визуализацию в реальном времени молекулярной, клеточной и тканевой динамики. Полупроводниковые нанокристаллы — квантовые точки (КТ) — сочетают размерно-настраиваемую люминесценцию, широкое поглощение и превосходную фотолабильность, делая их идеальными флюорофорами для маркировки биомолекул и кодирования микропartikel. В этом исследовании мы представляем упрощенный безрастворительный метод включения водорастворимых, PEG-функционализированных CdSe/ZnS КТ в многослойную мембрану полиэлектролитных микрокапсул методом слой-за-слоем. Полученные полые капсулы демонстрируют равномерный размер (средний 4,45 ± 0,65 мкм), надежный контроль поверхностного заряда и пик флуоресценции 590 нм, идентичный свободным КТ. Проточная цитометрия и флуоресцентная микроскопия подтверждают, что капсулы образуют гомогенную популяцию с высокой интенсивностью сигнала (~10⁴ единиц PE), позволяя прямое детектирование в стандартных лабораторных приборах. Эти PEGилированные КТ-кодированные микрокапсулы перспективны как яркие, фотолабильные агенты для биоизображений и тераностики, которые могут быть далее функционализированы для стимуло-реактивной доставки.

Введение

Адресная доставка терапевтиков и высокое разрешение визуализации требуют носителей, которые могут быть точно отслежены in vivo. Полиэлектролитные микрокапсулы, собираемые через электростатическое слой-за-слоем осаждение, предлагают универсальную платформу для включения функциональных агентов, включая магнитные, металлические и флуоресцентные наночастицы. Квантовые точки, с их узкими симметричными спектрами излучения, масштабирующимися с размером частицы, позволяют мультиплексное детектирование с использованием одной длины волны возбуждения. Их фотолабильность и квантовые выходы (~40%) соперничают с органическими красителями, в то время как их более крупные коэффициенты поглощения дают более высокую яркость на частицу.

Традиционная флуоресцентная маркировка микрокапсул обычно опирается на ковалентную конъюгацию или физическое смешивание красителей, которые могут страдать от выщелачивания и фотоблеккинга. Встраивание КТ в мембрану капсулы представляет более надежную стратегию оптического кодирования, при условии, что КТ остаются водорастворимыми и стабильно закрепленными. Здесь мы сообщаем о синтезе карбоксил-терминированных PEGилированных CdSe/ZnS КТ, их интеграции в многослойную полиэлектролитную оболочку и комплексной характеристике полученных флуоресцентных микрокапсул.

Методы

Цель, дизайн и условия исследования

Фабрикация КТ-кодированных полиэлектролитных микрокапсул

CdSe/ZnS ядро/оболочка КТ (пик 590 нм) синтезировались д-ром П. Самокхваловым (НИЯУ МИФИ, Москва) и очищались повторной хлороформной экстракцией и цистеиновым выпадением. КТ затем PEGилировались с использованием тиол-терминированного производного PEG12-COOH (массовое соотношение 1:4,6) и очищались гель-фильтрацией. Гидродинамический диаметр (18,7–23,3 нм) и ζ-потенциал (−26,7 ± 0,8 мВ) измерялись ДЛС и лазерным допплеровским микроэлектрофорезом (Zetasizer Nano ZS).

Слой-за-слоем осаждение выполнялось на частицах карбоната кальция (CaCO₃). Пять исходных полиэлектролитных слоев (PAH/PSS) собирались, за чем следовала адсорбация PEGилированных КТ на поверхность PAH. Дополнительные PAH/PSS слои закапсулировали КТ, и ядро CaCO₃ удалялось 0,2 М EDTA (pH 6,5). Полученные полые микрокапсулы поверхностно модифицировались бычьим сывороточным альбумином (BSA) инкубацией в 50 мМ фосфатном буфере (pH 7,4, 1% BSA) при 4 °C в течение 12 ч. Финальные суспензии промывались пять раз и хранились при 4 °C в темноте.

Оптическая и флуоресцентная микроскопия

Морфология и распределение размеров микрокапсул изучались на Axio Observer 3 (Zeiss) с объективом 40×/0,55. Флуоресцентная визуализация использовала HBO 100 ртутный иллюминатор, набор длинноволновых фильтров FITC и объектив 100×/1,30 масляной иммерсии (Immersol 518F). Секционированные образцы (150 нм) готовились эпоксидным встраиванием и ультромикротомией (Leica EM UC6). Флуоресценция сечений записывалась с набором фильтров TexasRed (возбуждение 560/40 нм, излучение 630/75 нм).

Флуоресцентная характеристика

Спектры излучения свободных и инкапсулированных КТ записывались на мультимодальном пластинчатом ридере Infinite 200 PRO (Tecan) с возбуждением 480 нм. Образцы центрифугировались (2630 × g, 20 мин) перед измерением.

Проточная цитометрия

Образцы (10⁶ частиц/мл) анализировались на FACSCanto II (BD) с лазером 488 нм. Прямой (FSC), боковой рассеяние (SSC) и PE (585/42 нм) сигналы записывались. Данные обрабатывались в FACSDiva.

Материалы

Карбоксилированный PEG12-SH (Thermo Fisher), PAH (Mw ≈ 15 кДа, Sigma-Aldrich), PSS (Mw ≈ 70 кДа, Sigma-Aldrich), PAA (Mw ≈ 15 кДа, Sigma-Aldrich), CaCl₂, Na₂CO₃, EDTA, BSA и все реагенты приобретались у Sigma-Aldrich. Растворы готовились на воде MilliQ (18,2 МОм·см).

Статистический анализ

Данные анализировались в MS Excel 2007 и Origin Pro 2015; результаты представлены как среднее ± SD от трех независимых экспериментов.

Результаты и обсуждение

Разработка КТ-кодированных полиэлектролитных микрокапсул

Стратегия слой-за-слоем предлагает безрастворительный, биосовместимый маршрут инкапсуляции КТ в управляемой полиэлектролитной оболочке. Частицы карбоната кальция сначала получают слой PAH, за чем следуют чередующиеся PSS и PAH слои для построения 10-слойной оболочки. PEGилированные КТ, несущие отрицательный поверхностный заряд, затем адсорбируются на терминальный PAH слой и запечатываются дополнительными полиэлектролитными слоями. Удаление ядра CaCO₃ EDTA дает полую капсулу; финальное BSA покрытие придает биосовместимость и уменьшает неспецифическую агрегацию.

Рисунок 1 иллюстрирует последовательность слоев, эволюцию ζ-потенциала и представительный флуоресцентный микрографию финальных капсул.

Дизайн и структура полиэлектролитных микрокапсул, кодированных квантовыми точками (КТ): a Схема расположения слоев. b Изменения ζ-потенциала при сборке и включении КТ. c Флуоресцентное микрофотография PEGилированных КТ-кодированных микрокапсул. * ζ-потенциалы после удаления ядра; ** после BSA покрытия.

Сканирующая электронная микроскопия поперечных сечений подтверждает полую архитектуру и равномерное распределение КТ внутри мембраны (Рисунок 5).

Микрофотографии сечений КТ-кодированных микрокапсул. Стрелки в (a) указывают на области, увеличенные в (b) и (c).

Динамическое рассеяние света показывает узкое распределение размеров со средним диаметром 4,45 ± 0,65 мкм (Рисунок 2), сравнимым с эритроцитами и подходящим для внутривенной доставки без нарушения гемато-тиссулярного барьера. В областях повышенной проницаемости (например, опухоли) эти капсулы могут экстравазировать, обеспечивая адресную визуализацию.

Распределение размеров полиэлектролитных микрокапсул, оптически кодированных квантовыми точками (n = 600).

Флуоресцентные и структурные характеристики

Спектры излучения инкапсулированных капсул сохраняют пик 590 нм свободных КТ (Рисунок 3), указывая, что полиэлектролитная матрица не гасит флуоресценцию. Проточная цитометрия раскрывает четкое разделение между КТ-кодированными (оранжевыми) и плацебо (серыми) капсулами в PE канале, с интенсивностью флуоресценции ~10⁴ единиц PE, в то время как FSC/SSC распределения перекрываются, подтверждая идентичный размер и гранулярность (Рисунок 4).

Детектируемость КТ-кодированных микрокапсул проточной цитометрией: a Точечный график (SSC-PE). b PE гистограмма. c Точечный график (SSC-FSC). d FSC гистограмма. 2500 событий на образец.

Высокая фотолабильность КТ, сочетаемая с квантовым выходом ~40%, дает яркость, соответствующую или превосходящую конвенциональные органические красители, избегая фотоблеккинга. Способность кодировать множество цветов настройкой размера предлагает практически неограниченную спектральную мультиплексизацию.

Заключение

Мы продемонстрировали воспроизводимый безрастворительный маршрут фабрикации PEGилированных КТ-кодированных полиэлектролитных микрокапсул с равномерным размером, стабильным поверхностным зарядом и яркой флуоресценцией. Капсулы легко детектируются стандартными проточными цитометрами и конфокальными микроскопами, делая их сильными кандидатами для in vitro и in vivo биоизображений. Будущая работа будет изучать стимуло-реактивную функционализацию и интеграцию в тераностические платформы.

Аббревиатуры

BSA:

Бычий сывороточный альбумин

EDTA:

Диодий этилендиаминтетраацетат

PAA:

Полиакриловая кислота

PAH:

Поликатион поли(аллиламин гидрохлорид)

PEG:

Полиэтиленгликоль

PSS:

Полианион поли(натрий 4-стиролсульфонат)

QD:

Квантовая точка

TOPO:

Триоктилфосфиновый оксид