Инструменты для биоимиджинга на основе полиэлектролитных микрокапсул, кодированных флуоресцентными полупроводниковыми наночастицами:дизайн и характеристика флуоресцентных свойств

Результаты и обсуждение

Разработка микрокапсул на основе полиэлектролита с кодировкой QD

Мы использовали метод послойного осаждения для получения агентов биоимиджинга в виде флуоресцентных микрочастиц, кодируемых квантовыми точками, поскольку предлагаемый метод не требует органических растворителей, позволяет использовать биосовместимые полимеры [23, 24] и обеспечивает эффективную иммобилизацию КТ внутри полимерной оболочки [21]. Изготовление флуоресцентных полиэлектролитных микрокапсул, оптически кодированных водорастворимыми, поверхностно-модифицированными квантовыми точками, заключается в нанесении пяти противоположно заряженных слоев полиэлектролита на поверхность микрочастиц карбоната кальция, служащих в качестве матриц, на первом этапе, с последующим кодированием полиэлектролитной оболочки отрицательно заряженные КТ, покрытие слоя КТ защитными слоями из противоположно заряженных полиэлектролитов, растворение ядра матрицы микрочастицы и, наконец, модификация поверхности микрокапсулы БСА (рис. 1). Отрицательный поверхностный заряд микрочастиц карбоната кальция обеспечивает адсорбцию ПАУ за счет электростатического взаимодействия поликатиона с поверхностью микрочастиц. Положительный ζ-потенциал поверхности, возникающий в результате адсорбции ПАУ на частицы, позволяет последующее нанесение полианиона PSS, а также КТ, модифицированных HS-PEG ₁₂ -COOH, которые также имеют отрицательный поверхностный заряд из-за карбоксильной группы и, следовательно, могут адсорбироваться на поликатионном слое ПАУ. Встраивание квантовых точек в полимерную полиэлектролитную мембрану осуществляется путем нанесения дополнительных покрывающих слоев полиэлектролита (не менее четырех-шести из них), как показано на рис. 1а, б.

Конструкция и структура микрокапсул из полиэлектролита, закодированных квантовыми точками (КТ): a Принципиальная схема расположения слоев в мембране полимерной микрокапсулы. б Изменение ζ-потенциала поверхности микрочастиц карбоната кальция при наслоении полимерных электролитов и кодировании КТ. c Флуоресцентная микрофотография полиэлектролитных микрокапсул, кодированных квантовыми точками CdSe / ZnS, солюбилизированными HS-PEG ₁₂ -COOH. * Ζ-потенциалы поверхности микрокапсулы после удаления ядра; ** дополнительный этап изготовления микрокапсул полиэлектролита, кодируемых квантовыми точками, с поверхностью, модифицированной БСА

Полые микрокапсулы, содержащие иммобилизованные КТ в их полимерной мембране, получают растворением микрочастиц карбоната кальция с помощью 0,2 М ЭДТА (pH 6,5) и образования водорастворимого комплекса кальциевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, диффузия которой через полимерную мембрану приводит к образованию полости внутри микрокапсул. Для получения микрокапсул полиэлектролита с кодировкой QD с поверхностью, модифицированной BSA, полианион PAA наслаивают на 11-й слой поликатиона PAH. PAA используется из-за его значения константы диссоциации при взаимодействии с поверхностью микрокапсулы. Значение pKa PAA (pKa ≈ 4,7) ниже и, следовательно, более кислое по сравнению с PSS (pKa ≈ 7,5) [25, 26], что приводит к более высокому ζ-потенциалу поверхности микрокапсулы. Заряд модифицированной ПАК поверхности способствует пассивной адсорбции БСА из-за электростатического взаимодействия между БСА и ПАК. Однако сборка между ПАК и БСА приводит к уменьшению отрицательного поверхностного заряда микрокапсул (рис. 1b). После осаждения BSA на поверхность микрокапсулы происходит экранирование отрицательно заряженного слоя PAA электростатически положительными аминогруппами BSA, следовательно, ζ-потенциал микрокапсул, кодированных QD, покрытых BSA, вероятно, в первую очередь определяется электростатическим поведением BSA как внешнее покрытие микрокапсул [26].

Водорастворимые ПЭГилированные КТ характеризуются узким распределением по размерам, отсутствием агрегатов в дисперсии и высокой коллоидной стабильностью. Это, вероятно, обеспечит гомогенную адсорбцию квантовых точек на поверхности микрогранул и облегчит эффективное кодирование и, следовательно, получение ярких флуоресцентных микрокапсул (рис. 1c).

Использование белков, таких как BSA, для модификации поверхности делает полимерные микрокапсулы более биосовместимыми и более устойчивыми к адгезии друг с другом. Это также обеспечивает временную пассивацию поверхности микрокапсул, что важно для последующего изучения микрокапсул, образованных интерполимерными комплексами ПАУ-ПСС или ПАУ-ПАК, с точки зрения взаимодействия с клетками in vitro и поведения in vivo [27,28,29] .

Полученные микрокапсулы с кодировкой QD имеют сферическую форму (рис. 1в) и характеризуются узким распределением по размерам (рис. 2) со средним размером 4,45 ± 0,65 мкм. Этот размер сопоставим с размерами эритроцитов, будучи даже меньше его [30]. Кроме того, как было показано ранее, полимерная мембрана микрокапсул представляет собой гибкую структуру, склонную к деформации. При внутривенном введении микрокапсулы такого размера не могут проникать через барьеры кровь-ткань, что позволяет проследить транспорт и распределение оптически закодированных микрокапсул в организме [31, 32]. Однако в локализациях с повышенной проницаемостью стенки кровеносных сосудов, например, в областях воспаления и роста опухоли, микрокапсулы могут проникать во внесосудистое пространство, что, как ожидается, обеспечит визуализацию и мониторинг целевой доставки [33,34,35 , 36].

Распределение размеров полиэлектролитных микрокапсул, оптически кодированных квантовыми точками, при этом количество проанализированных микрокапсул составляло 600

Флуоресценция и структурные характеристики микрокапсул на основе полиэлектролита, кодируемого квантовыми точками

Изготовленные микрокапсулы характеризуются пиком флуоресценции на длине волны 590 нм, который соответствует пику исходных водорастворимых КТ, используемых для оптического кодирования микрокапсул. Это указывает на то, что полимерные полиэлектролиты, составляющие мембрану микрокапсул, не влияют на флуоресцентные свойства, особенно на максимум флуоресценции, квантовых точек в микрогранулах и микрокапсулах, приготовленных из них (рис. 3).

Влияние включения квантовой точки (QD) в полимерную мембрану микрогранул (MCB) и микрокапсул (MCC) на их характеристики флуоресценции:показан спектр флуоресценции раствора QD, содержащего 2,241 мг QD; это соответствует количеству QD, используемых для оптического кодирования MCB

На рисунке 4 показаны гистограммы распределения интенсивности сигналов от популяций микрокапсул, кодируемых QD, а также микрокапсул плацебо, в канале флуоресценции PE (575/25 нм) и FSC-A и SSC-A (488/10 нм). ) каналов проточного цитометра. Данные указывают на эффективную дифференциацию между плацебо и оптически кодируемыми микрокапсулами в канале PE (575/25 нм) (рис. 4a, b). Интенсивность сигнала флуоресценции от микрокапсул в канале PE (575/25 нм) составляет ~ 10 ⁴ , что демонстрирует высокую флуоресцентную способность микрокапсул, кодируемых квантовыми точками. В каналах FSC-A и SSC-A (488/10 нм) распределения для двух популяций микрокапсул перекрываются, что указывает на аналогичные относительные размеры и параметры гранулярности плацебо и кодированных микрокапсул (рис. 4c, d) и, следовательно, , однородность популяций. По-видимому, это связано с тем, что мембраны микрокапсул состоят из равного количества полимерных слоев, а мембрана кодируемых микрокапсул содержит только один слой КТ. Таким образом, полученные микрокапсулы характеризуются однородным распределением по размерам и оптимальными флуоресцентными характеристиками, обеспечивающими их обнаружение в соответствующих каналах проточного цитометра.

Обнаружение микрокапсул полиэлектролита, кодируемых QD, методом проточной цитометрии: a точечный профиль микрокапсул в каналах SSC-PE; б гистограмма распределения микрокапсул в PE канале; c точечный профиль микрокапсул в каналах SSC-FSC; г гистограмма распределения микрокапсул в канале FSC. Микрокапсулы без QD (плацебо) использовались в качестве контроля и показаны серым цветом, тогда как микрокапсулы, кодированные квантовыми точками CdSe / ZnS (максимум излучения флуоресценции при 590 нм), показаны оранжевым. Количество проанализированных событий равнялось 2500. Точечные диаграммы и оси гистограммы показаны как SSC-A, FSC-A, PE-A, где A означает, что данные представлены областью сигнала

Микрофотографии срезов микрокапсул полиэлектролита, кодируемых квантовыми точками, показанные на рис. 5, демонстрируют, что микрокапсулы являются полыми, а обнаруженный яркий флуоресцентный сигнал испускается полимерными мембранами, содержащими квантовые точки. Эти данные подтверждают эффективность процедуры, использованной для растворения ядра, и демонстрируют яркий сигнал флуоресценции изготовленных микрокапсул, который может быть обнаружен с помощью соответствующих фильтров Texas Red и PE в случаях флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии соответственно. Приготовленные полиэлектролитные микрокапсулы, содержащие КТ в своей полимерной оболочке, обладают более высокими флуоресцентными свойствами по сравнению с полиэлектролитными микрокапсулами, меченными традиционными красителями, такими как флуоресцеинизотиоцианат (FITC) или аминофлуоресцеин [14, 37]. В противном случае микрокапсулы, закодированные с помощью квантовых точек с использованием послойного подхода, имеют яркость, сравнимую или даже ниже, чем у микрогранул, закодированных с помощью органических красителей с использованием метода набухания. Яркость определяется произведением коэффициента экстинкции и квантового выхода. Квантовые выходы водорастворимых КТ при комнатной температуре составляют около 40%, что сопоставимо с таковым для органических красителей [22, 38, 39], тогда как экстинкции КТ почти в 100 раз больше, чем для органических красителей. В противном случае из-за большого размера КТ их количество в оболочке микрокапсулы не может быть сопоставимо с количеством молекул органических красителей. Таким образом, количество кодирующих молекул органического красителя может быть намного больше, чем количество КТ, что обеспечивает сопоставимую яркость. С другой стороны, кодирование микрокапсул КТ дает такое важное сравнительное преимущество, как полное отсутствие фотообесцвечивания. Кроме того, квантовые точки разных цветов (размеров) можно возбуждать возбуждением с одинаковой длиной волны. Таким образом, использование КТ разных цветов для кодирования микрокапсул может обеспечить практически неограниченное количество спектрально разрешенных оптических кодов [21].

Микрофотографии срезов полиэлектролитных микрокапсул, закодированных квантовыми точками. Стрелки в ( a ) укажите области, указанные в ( b , c ) при большем увеличении

Выводы

Разработанная методика получения полиэлектролитных микрокапсул с кодировкой QD обеспечивает эффективное оптическое кодирование. Изготовленные полимерные микрокапсулы характеризуются оптимальным распределением по размерам и высокой интенсивностью флуоресценции, что позволяет использовать их для их эффективного обнаружения с помощью коммерческих проточных цитометров и конфокальных микроскопов. Таким образом, разработанные микрокапсулы являются потенциальными флуоресцентными агентами для биовизуализации in vitro и in vivo. Дальнейшая разработка универсальной платформы на основе микрокапсул будет направлена ​​на предложение новых инструментов биоимиджинга и тераностики, основанных на флуоресцентных микрочастицах, закодированных с помощью квантовых точек, которые реагируют на различные внешние физические или химические стимулы наряду с фотовозбуждением.

Сокращения

BSA:

Бычий сывороточный альбумин

EDTA:

Этилендиаминтетраацетат динатрия

PAA:

Полиакриловая кислота

PAH:

Поликатион поли (аллиламин гидрохлорид)

PEG:

Полиэтиленгликоль

PSS:

Полианион поли (4-стиролсульфонат натрия)

QD:

Квантовая точка

TOPO:

Оксид триоктилфосфина