Влияние углеродных нанотрубок и их производных на опухолевые клетки in vitro и биохимические параметры, состав клеточной крови in vivo

Фон

Одно из самых ярких и многообещающих применений углеродных нанотрубок - медицина. Углеродные нанотрубки (УНТ) характеризуются уникальными химическими и биологическими свойствами [1,2,3,4,5]. УНТ имеют большую площадь поверхности, что позволяет им прикреплять широкий спектр биологических веществ [6]. Кроме того, УНТ способны проникать через клеточные мембраны, капилляры и накапливаться в клетках и тканях [7,8,9]. УНТ легко абсорбируются клетками, что способствует способности УНТ достигать ядер клеток и предполагает возможность генной терапии [10]. Вот почему УНТ являются привлекательными транспортными средствами для транспорта белков, антигенов, векторов РНК / ДНК [11], вакцин и лекарств в клетки [12]. Особый интерес представляют перспективы использования УНТ в качестве персонализированного носителя с контролируемым высвобождением лекарств для противоопухолевой [13], антибактериальной [14] и иммунологической терапии [15]. Адресная доставка и контролируемое высвобождение - актуальная проблема современного использования лекарств, особенно с цитотоксическими свойствами. Точный механизм высвобождения лекарства обеспечивает эффективную концентрацию активного вещества в ткани-мишени с минимальной концентрацией в других. Это позволит снизить дозу препарата при сохранении его эффективности и уменьшении вреда от побочных эффектов. В настоящее время существуют различные способы целенаправленной доставки лекарств, такие как доставка с использованием липосом [16], полимерных мицелл и дендримеров [17], биоразлагаемых частиц [18] и других наночастиц [19]. Но недавние эксперименты продемонстрировали много преимуществ от использования УНТ для доставки лекарств по сравнению с другими наночастицами [20, 21]. Один из них - это УНТ с довольно большой и активной поверхностью, которые могут быть заполнены желаемым химическим веществом, от небольших молекул до белков, антител и РНК / ДНК. Открытые концы УНТ делают внутренний объем и поверхность доступными для функционализации. Таким образом, большая площадь поверхности УНТ обеспечивает множество сайтов связывания для различных типов функционализации. В то же время с перспективами УНТ существуют проблемы с низкой растворимостью УНТ, способностью к агрегации, гидрофильными свойствами, длительным периодом полураспада и влиянием на весь организм [22]. По данным литературы, введение УНТ в организм экспериментальных животных сопровождается накоплением УНТ и их производных в органах пищеварительного тракта, селезенке, почках [23], мышцах [24] и легочной ткани [25]. . На следующем этапе УНТ влияют на активность метаболических и воспалительных процессов [25, 26], состояние иммунной системы [27] и выживаемость экспериментальных животных [28]. Тем не менее, эти проблемы являются предметом активных исследований для дальнейшего продвижения использования углеродных нанотрубок. Преимущества УНТ как нано-векторов для доставки лекарств убедительно продемонстрированы в ряде исследований. Авторы [29, 30] сообщают, что определенные нанотрубки могут быть менее вредными, чем наноносители для лекарств. Также было показано, что простая функционализация (-OH, -COOH, -NH, PEG) [31] или инкапсуляция УНТ [22] увеличивает растворимость в воде, улучшает биодоступность и снижает токсичность УНТ. А введение УНТ мышам с трансплантированной опухолью может быть эффективным против целевых трансформированных тканей и привело к уменьшению объема опухоли и увеличению выживаемости животных [32].

На основании предыдущих исследований [33] мы предположили, что активное противоопухолевое вещество (доксорубицин) может быть иммобилизовано на поверхности пептидных связей углеродных нанотрубок. Полученное соединение, углеродные нанотрубки, функционализированные доксорубицином (CNT-Dox), могло снизить цитотоксические свойства CNT как доксорубицин (Dox). В то же время распад обработанной конструкции может позволить реализовать цитотоксические свойства CNT и Dox. Тем самым можно добиться повышения противоопухолевой активности обоих веществ. Таким образом, целью настоящего исследования было определение цитотоксического действия конструкции CNTs-Dox в присутствии протеазы (трипсина) in vitro. Мы проанализировали влияние УНТ и их производных на опухолевые клетки в 2D и 3D модели клеток in vitro. Другой целью было изучить влияние полученных соединений (CNT, CNTox и CNT-Dox) на активность ферментной системы печени, обмен белков и клеточный состав крови in vivo. Итак, авторами проведена комплексная оценка токсичности, биодоступности и эффективности использования УНТ и их производных против опухолей желудочно-кишечного тракта.

Методы

Клеточная линия аденокарциномы ободочной кишки II степени (HT29) использовалась в качестве экспериментальной клеточной модели в 2D (монослой) и 3D (сфероид) системах in vitro. Линия приобретена в Банке клеточных линий и тканей животных Института экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Кавецкого НАН Украины. Клетки обрабатывали в стандартных условиях культивирования клеток (влажность 95%, 5% CO ₂ в воздухе; 37 ° C) в полной среде DMEM с 10% FBS в условиях лабораторной изоляции уровня 2.

Синтез, окисление и функционализация УНТ

Исходные многослойные углеродные нанотрубки (MWCNT) были получены путем химического осаждения из паровой фазы (пропилен и водород с Mo / Fe / Al ₂ О ₃ в качестве катализатора). Синтезированные МУНТ имели 10–30 слоев, внутренний диаметр 5–15 нм, внешний диаметр 10–60 нм, длину 20–500 мкм, удельную поверхность 120 м ² / г и насыпная плотность 5–50 г / л [33].

Очистку МУНТ от металла / катализатора проводили обработкой HF. Удаление аморфного углерода из углеродных наноматериалов осуществлялось окислением на воздухе при 450–500 ° C. Неочищенный образец, содержащий MWCNT, прореагировал с кислородом из воздуха и образовал диоксид углерода или монооксид углерода. Некоторое количество углеродных отложений было получено после растворения HF (воды) носителя катализатора на воздухе при 450–500 ° C. Для этой процедуры использовали кварцевый трубчатый реактор с воздушным потоком в течение 130–150 мин. Мы проанализировали и описали физико-химические характеристики полученных МУНТ в предыдущей работе [33].

Сканирующая электронная спектроскопия (СЭМ) MWCNTs (JEOL SL6060LA, Япония) была использована для определения структурных характеристик MWCNTs. После иммобилизации лигандов морфология не изменилась.

Окисление MWCNT

На следующем этапе очищенные углеродные нанотрубки (УНТ) окисляли в 70% HNO ₃ . при 99 ° C в течение 4 часов, а затем промыли дистиллированной водой и 10% NH ₄ Раствор ОН на 12 ч. В результате были синтезированы оксиды углеродных наноматериалов MWCNTox (CNTox). После этого УНТ трижды промывали dH ₂ . O до нейтрального pH. Кислотные центры на поверхности УНТ регенерировали 0,1 М раствором HCl. Полученные окисленные CNTs-ox были отделены центрифугированием, тщательно промыты и повторно суспендированы в dH ₂ О вода.

Подготовка частиц CNT-Dox

Задачей следующего шага было иммобилизовать гидрохлорид Докса (Dox, Teva Nederland B.V, Нидерланды) на поверхности частиц МУНТ. Чтобы функционализировать поверхности окисленных УНТ (200 мг) аминосодержащим моногидратом докс-лактозы, их инкубировали с бифункциональным связывающим агентом - N-циклогексил-N '- (2 морфолиноэтил) карбодиимид мет-пара-толуолсульфонатом (C 1011, Sigma Aldrich. , США) в течение 15 мин при комнатной температуре (рис. 1а). После этого к каждому наноуглеродному материалу добавляли 100 мг моногидрата DOX-лактозы в 10 мл 0,15 М фосфатного буфера pH 6,5. Смеси давали возможность прореагировать при 30 ° C в течение 24 часов. В таких условиях образовывались ковалентные связи между Dox и УНТ (рис. 1б). Композицию собирали центрифугированием при 10000 об / мин 15 мин и промывали dH ₂ . О, трижды. Супернатанты использовали для определения концентрации свободного DOX с помощью спектрофотометра. Иммобилизация ФИТС на поверхности УНТ осуществлялась по схеме, представленной на рис. 2а, б.

а Схема реакции УНТ с карбодиимидом. б Схема функционализации УНТ доксорубицином

а Схема реакции УНТ с мочевиной. б Схема функционализации УНТ по FITC

Подготовка стабильных суспензий MWCNT

Коллоидную суспензию МУНТ проводили в два этапа. На первом этапе углеродные наноматериалы были подвергнуты ультразвуковой обработке в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) с использованием ультразвукового диспергатора УЗДН-2Тл. Режимы обработки: I =10 мА, R =22 кГц, длительность - 30 мин. На втором этапе полученный гидрозоль диспергировали центрифугированием при комнатной температуре. Процесс включает несколько циклов центрифугирования. Таким образом, была выбрана фракция гидрофильных растворяющихся ОУНТ. Перед добавлением в суспензию культивируемых клеток растворы МУНТ стерилизовали кипячением в течение 30 мин. Производные CNT (CNT-Dox и CNT-FITC) стерилизовали 100-кратной концентрацией PSGA (пенициллин:стрептомицин:гентамицин:амфотерицин).

Дзета-потенциал подвешивания нанотрубок

Дзета-потенциал образцов измеряли с помощью электрофоретического рассеяния света (M3-PALS). Для измерений использовался анализатор Zetasizer Nano ZS производства Malvern Instruments (Малверн, Великобритания). Эксперименты проводили при 25 ° C в семи повторах. Для измерения образцов использовались универсальный погружной электрод (Universal Dip Cell) ZEN1002 и кюветы из полистирола (DTS001), источник света - лазер H-Ne 633 нм.

FTIR-спектроскопия

Химический состав полученных наноматериалов исследован методом инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье (FTIR). ИК спектры получены на ИК-Фурье-спектрометре FTS 7000e Varian. Образцы для анализа готовили измельчением в мельнице смеси ~ 1 мг УНТ и 150 мг спектрально чистого KBr. Образцы готовили на прессе с силой давления 3,0–3,5 × 10 ³ кг / см ² . Образцы обезвоживали нагреванием при температуре 600 ° C в течение 60 мин. Предварительно были получены спектры KBr перед выстрелом, после чего они были вычтены из спектров образцов. Все спектры анализировали согласно каталогу спектрометрической идентификации органических соединений [34]. Для сравнения использовали образцы окисленных MWCNT (CNT-O), MWCNT, функционализированных доксорубицином (CNT-D), и MWCNT, функционализированных флуоресцентной меткой (CNT-F). Все обработки и условия, образцы и концентрации были одинаковыми для трех материалов.

Колориметрический анализ высвобождения доксорубицина с поверхности УНТ

Для оценки количества свободного Dox после иммобилизации на CNM и эффективности высвобождения Dox использовали способность свободного Dox флуоресценции на длине волны 495 нм [35]. Активная концентрация докса в гидрохлориде докса составляла 16,7% масс. / w . Для построения калибровочных линий используйте Dox Teva 20 мг / мл с десятью разведениями до 8 × 10 ⁻³ Использовали мг / мл. Затем флуоресценцию свободного Dox измеряли в супернатанте комплексов DOX с УНТ с помощью спектрофотометрического планшет-ридера Multiscan (Labsystem, Финляндия).

Концентрация функциональных групп в частицах CNT-DOX, CNT-FITC

Для иммобилизации Dox:1 г MWCNT в 1 мл dH ₂ O использовалось. Количество Dox-TEVA составляло 100 мг (16,7 мг активного Dox) в 1 мл dH ₂ О. Количество свободного Dox в супернатанте после реакции составляло 0,37 мг или 2,2% от активных веществ. Таким образом, мы сделали вывод, что 16,23 мг DOX иммобилизовано на 1 г CNTox. Для FITC процент иммобилизации был низким. Затем 8,35 мг FITC иммобилизовали на 1 г CNTox в 1 мл dH ₂ . О. Эффективность функционализации составила 1,62% w / w для CNT-DOX и 0,84% w / w для CNT-FITC. Дальнейший расчет концентраций CNT-Dox и CNT-FITC основывается на этих данных.

Цитотоксический анализ производных CNT на двух- и трехмерной модели клеток

Цитотоксичность Dox, CNT, CNT-FITC и CNT-Dox оценивали в отношении опухолевых клеток HT29 с использованием анализа МТТ. МТТ-тест, основанный на превращении солей 3- [4,5-диметилтиазол-2] -2,5-дифенилтетратетразолия в кристаллы формазана под действием НАД (Ф) Н-зависимых митохондриальных оксидоредуктазных ферментов в живых клетках. Протокол описан Т. Мосманном [36]. Вкратце, 1 × 10 ⁴ HT29 высевали в 96-луночные планшеты и культивировали в полной культуральной среде в течение 12 часов. Затем текущая культуральная среда была заменена культуральной средой, содержащей CNTox (образец №1), MWCNT (образец №2), CNT-Dox (образец №3), Dox (образец №4) и CNT-FITC (образец №5). . Концентрации образцов № 1, 2, 3, 5 составляли 12,5–25–50–100–200 мкг / мл, исходная концентрация образца № 4 составляла 20 мкг / мл, конечная концентрация от 1 до 10 мкг / мл. Клетки культивировали в полной среде и использовали в качестве контроля. Через 24 ч инкубации клетки анализировали с помощью МТТ колориметрическим анализом. К 100 мкл суспензии клеток добавляли 20 мкл раствора МТТ (5 мг / мл PBS, Sigma). После этого клетки инкубировали с МТТ в течение 4 ч в стандартных условиях. Затем образцы центрифугировали при 1500 g в течение 5 мин и экстрагировали супернатант. Всего в лунки добавляли 10 мкл ДМСО (Sigma) для разведения кристаллов МТТ и 20 мкл 25 мМ глицина. Оптическую плотность прореагировавшего раствора измеряли при 540 нм на спектрофотометрическом планшет-ридере Multiscan (Labsystem, Финляндия).

Создание сфероидов многоклеточной опухоли

Клетки HT29 многоклеточного опухолевого сфероида (MTS) (3D-культура) в качестве модельной системы микрометастазов опухоли культивировали хорошо зарекомендовавшим себя способом, описанным ранее [33]. Вкратце, суспензию клеток подсчитывали с использованием трипанового синего и высаживали равное количество клеток (5 × 10 ⁴ клеток / мл). 3D-культуру клеток поддерживали в среде DMEM (Sigma, США) с 10% FBS (Sigma, США) в стандартных условиях (влажность 95%, 5% CO ₂ на воздухе, 37 ° C). Генерация МТС производилась по технологии, разработанной в нашей лаборатории. Культивирование опухолевых клеток поддерживали в течение 24 ч в 24-луночных планшетах, покрытых 1% агаром в культуральной среде с 0,24% карбоксиметилцеллюлозы. Для исследования зависимости размера и количества MTS от концентрации и типа УНТ, MTS генерировали в присутствии различных концентраций УНТ. Перед генерированием MTS в культурах клеток раствор CNT в PBS добавляли в культуру до конечной концентрации, как описано ранее для анализа MTT. Дальнейшее культивирование проводили в течение 48 ч при постоянном вращении пластин на орбитальном шейкере (80 об / мин). На следующем этапе были получены микрофотографии методом «темного поля». Всего было сделано более 120 изображений. Затем с помощью программы Axio Vision Rel 4.7, Zeiss рассчитывалась громкость всех MTS, которые были в файлах. Мы использовали формулу Рольфа Бьерквига: V =0,4 ∙ а ∙ б ² , где геометрические размеры сфероидов ( b < а ) [37]. Визуализация результатов проводилась на микроскопе Stemy 2000C, Zeiss.

Анализ влияния CNT на печеночную ферментную систему, обмен белков и состав клеточной крови in vivo

Процедуры, касающиеся животных и ухода за ними, соответствовали Европейской директиве 2010/63 ЕС, одобренной местными комитетами по этике экспериментов на животных (Протокол №1 от 21.10.2016). Для анализа влияния полученных веществ на общее состояние гомеостаза организма была проведена серия экспериментов in vivo. Для исследований in vivo использовали мышей линии Balb / 2a. Самцы и самки мышей были равны в группах в возрасте 6–8 недель, по десять на каждую группу. Мышей содержали в клетках с крышками из стальной проволоки и подстилкой из кукурузных початков и содержали в контролируемой атмосфере с циклом 12/12 темнота / свет, температурой 22 ° C ± 3 ° C и влажностью 50–70% при свободном доступе. к пище и пресной воде. Таким образом, было сформировано четыре группы мышей. Группа 1:интактным животным вводили 200 мкл PBS, контроль. Группа 2:мыши получали CNTox в дозе 1,5 мг / кг. Группа 3:мыши получали CNT-DOX в дозе 1,5 мг / кг. А в группе 4 мышей лечили доксорубицином в дозе 20 мг / кг. Мышам вводили УНТ парентерально в 200 мкл PBS каждые 3 дня в течение 4 недель. Доксорубицин вводили внутрибрюшинно один раз в 3 дня в концентрации 20 мг / кг массы тела.

Биохимический анализ сыворотки

Через месяц мышей сняли с эксперимента. Образцы сердечной крови были немедленно собраны у мертвых животных. Кровь брали у животных в одно и то же время с 10 до 11 часов утра. Для плазмы кровь инкубировали 40 мин при 37 ° C, а затем центрифугировали (20 мин, 2000 об / мин). Затем с помощью диагностических наборов (Cormay, Варшава, Польша) определяли биохимические параметры, общий белок, альбумин, аспартатаминотрансферазу (AST) и аланинаминотрансферазу (ALT), щелочную фосфатазу (ALP) в плазме. Опыты проводили по унифицированным лабораторным протоколам на полуавтоматическом биохимическом анализаторе FP-901M (Labsystems, Финляндия). Клеточный состав крови определяли на гематологическом анализаторе Mindray BC-3000 Plus, Китай.

Статистический анализ

Для статистического анализа 3D-культуры все клеточные агрегаты были разделены на группы по размеру от 1 × 10 ⁻⁴ мм ³ до 1 × 10 ⁻² мм ³ с шагом 1 × 10 ⁻³ мм ³ . Затем было оценено количество МТС в каждой группе и медиана объема МТС для каждой группы. Все измерения повторяли трижды. Для микростатистического анализа случайных величин с нормальным распределением мы использовали коэффициент Стьюдента для небольшой популяции. Указанный p значение было * р ≤ 0,05 или ** р ≤ 0,01.

Результаты и обсуждение

Сканирующая электронная микроскопия MWCNT

Согласно протоколу [38], средний диаметр УНТ составлял 10–20 нм, а удельная поверхность, определенная десорбцией аргона, составляла 200–400 м ² . /г. Насыпная плотность в пределах 20–40 г / дм ³ . В частности, агломераты в виде перепутанных трубок размером 20–500 мкм получаются при промышленном производстве УНТ методом CVD (рис. 3).

СЭМ-изображения УНТ, 1) масштаб 0,5 мкм; 2) масштаб 5 мкм

Дзета-потенциал подвешивания нанотрубок

CNTox и CNT указывают на значительную устойчивость к агрегации, которая напрямую зависит от значения дзета-потенциала. CNT-DOX имеет меньший дзета-потенциал, чем CNTox и CNT, и высокую воспроизводимость измерений, что указывает на однородность частиц (таблица 1). Небольшое значение дзета-потенциала CNT-FITC может указывать на значительные размеры частиц или их небольшие концентрации, на что указывает высокий коэффициент шума при измерении.

ИК-Фурье спектроскопия CNT, CNT-Dox и CNT-FITC

Связывание CNTox с доксорубицином (DOX) и флуоресцеином (FITC) оценивали на основе данных инфракрасного спектра, как показано на рис. 4.

Инфракрасные спектры CNTox (CNT-O), CNT-DOX (CNT-D), CNT-FITC (CNT-F)

Наличие сильной полосы на υ =3311 см ⁻¹ (CNT-O) и υ =3451 см ⁻¹ (CNT-D), приписываемые флуктуациям связи CON-H, а также наличию сильной полосы при υ =1634 см ⁻¹ (CNT-O) и υ =1631 см ⁻¹ (CNT-D), приписываемые колебаниям связи O-CNH, что четко указывает на тип амидной связи между CNT и Dox. Кроме того, ИК-спектр показал поглощение связей C-H, которое находится при 2969–2834 см ^-1 . и широкая полоса 1460–1407 см ⁻¹ из фрагмента C-O-H. Таким образом, мы можем сделать вывод, что в результате химических реакций УНТ были функционализированы противоопухолевым препаратом (доксорубицином) и флуоресцентной меткой (FITC).

Цитотоксичность УНТ на разных стадиях функционализации в моделях роста клеток монослоя и сфероидов

Следующим шагом было определение цитотоксичности окисленных УНТ (CNTox), УНТ, функционализированных доксорубицином (CNT-Dox) и флуоресцентной метки (CNT-FITC). Результаты теста МТТ на монослойной культуре HT29 показаны на рис. 5.

Жизнеспособность опухолевых клеток HT29 в монослойной культуре после инкубации в течение 48 ч с УНТ и их производными (CNT-Dox и CNT-FITC). Статистическая значимость:* р ≤ 0,05 или ** р ≤ 0,01

В результате было продемонстрировано, что CNTox, CNT-Dox и CNT-FITC обладают умеренным цитотоксическим действием при концентрациях 12,5 мкг / мл (81%). Повышение концентрации CNTox с 25 до 50 и 100 мкг / мл приводило к дозозависимому снижению жизнеспособности опухолевых клеток до 71,8–69,6–62,5% соответственно по сравнению с контролем. При концентрации CNTox до 200 мкг / мл жизнеспособность HT29 снижалась до 39,2%. В то время CNT-Dox в низких концентрациях (12,5–50 мкг / мл) не проявлял статистически значимой цитотоксичности по сравнению с CNTox. При высоких концентрациях (200 мкг / мл) CTN-Dox обладал даже меньшей цитотоксичностью, чем CNTox (50%). В то же время УНТ, функционализированные флуоресцеином, обладали относительно более высоким цитотоксическим действием на опухолевые клетки. После инкубации с CNT-FITC в концентрации 25 мкг / мл выживаемость клеток HT29 снизилась до 55%, а при 100–200 мкг / мл до 23 и 7% соответственно. Таким образом, в этом случае УНТ играли роль достаточно инертного клеточного субстрата. Более того, CNT иммобилизовали Dox и уменьшили цитотоксичность Dox. В предыдущих исследованиях [33] мы продемонстрировали, что первичные нанотрубки обладают гидрофобными качествами, умеренным цитотоксическим действием и стимулируют образование большого количества клеточных агрегатов. Согласно литературным данным [39], заряд поверхности УНТ изменяется в процессе окисления. УНТ становятся более гидрофильными, что приводит к образованию более мелких агрегатов и усилению цитотоксического действия УНТ. Данные, полученные в предыдущем исследовании, подтверждают эту тенденцию. CNTox снижал выживаемость опухолевых клеток по крайней мере на 60% по сравнению с контролем, CNT-Dox на 45% и CNT-FITC на 97% (при 200 мкг / мл). Объяснение полученных данных может заключаться в сообщениях других авторов о том, что функциональные лиганды в большинстве случаев изменяют поверхностный дзета-потенциал УНТ, стимулируют растворимость УНТ и увеличивают проникновение УНТ в клетки [40]. Способность УНТ образовывать агрегаты после окисления и функционализации снижается, в то время как проницаемость через клеточную мембрану увеличивается, а реакционная способность клеточных органелл возрастает. Более того, CNT-Dox в высоких концентрациях имеет более низкий цитотоксический эффект, чем CNTox. В то же время, согласно полученным данным, можно предположить, что пептидная связь удерживает доксорубицин на поверхности УНТ. Пептидная связь между УНТ и Dox достаточно стабильна в условиях культивирования клеток. Он не расщепляется и принимает доксорубицин в неактивной форме. В то же время флюоресцеин-натриевая молекулярная (C ₂₀ H ₁₂ О ₅ ), лиганд размером 332,311 г / моль, довольно легко диссоциирует с поверхности УНТ и проникает в клетки. В результате происходят необратимые нарушения структур ДНК, ядер и митохондрий [41].

Для проверки цитотоксичности УНТ и их производных и влияния на адгезивные свойства опухолевых клеток была проанализирована площадь 2D-колоний клеток HT29. Результаты представлены на рис. 6. Было продемонстрировано, что УНТ и их производные влияют на адгезионную способность опухолевых клеток и образование колоний опухолевых клеток в монослойной культуре. Инкубация опухолевых клеток с CNTox (образец № 1) в концентрациях 12,5, 50,0 и 200 мкг / мл приводила к дозозависимому уменьшению колоний 2D-клеток на 55,2%, 57,8% и 78,3% соответственно по сравнению с контролем. В то же время образец CNT-Dox (образец №3) в тех же концентрациях не вызывал такого эффекта. Площадь 2D-колоний уменьшилась на 34,8%, 61,6% и 82,4% соответственно. CNT-FITC (образец № 5) продемонстрировал наибольшее влияние на опухолевые клетки в монослойной культуре. Площадь 2D-колоний после инкубации с CNT-FITC уменьшилась на 59,8%, 85,2% и 89,8% соответственно. Следует отметить, что полученные результаты имеют ту же тенденцию, что и МТТ-анализ. Но результаты МТТ-анализа не показали столь значительного цитотоксического эффекта. Возникающие расхождения могут быть результатом нецитотоксического действия УНТ на колонию клеток и, частично, антиадгезионного воздействия. Ранее мы продемонстрировали, что УНТ обладают меньшей цитотоксической способностью, чем антиадгезионные. По нашим данным, УНТ стимулируют миграцию опухолевых клеток во фракцию суспензии и образование многоклеточных опухолевых сфероидов (МТС). Чувствительность клеток к противоопухолевым агентам в монослойных и сфероидных культурах различна. Поэтому на следующем этапе мы исследовали образование MTS опухолевыми клетками HT29 в присутствии CNTox, CNT-Dox и CNT-FITC. Концентрации УНТ были такими же, как и в предыдущих экспериментах. На рис. 7 было продемонстрировано, что CNTox (образец № 1) способны стимулировать образование MTS. Повышение концентрации CNTox сопровождается дозозависимым увеличением медианного объема MTS. При концентрации CNTox от 12,5, 50, 200 мкг / мл средний объем MTS увеличивается с 1,79 до 2,18 и 10,98 мм ³ ; это почти в десять раз. Производные УНТ не оказывают такого воздействия на опухолевые клетки. CNT-Dox (образец №3) стимулирует образование МТС в 2,83 раза. В то же время инкубация трехмерной культуры опухолевых клеток с CNT-FITC (образец № 5) приводит к уменьшению объема MTS в 2,4 раза.

Площадь колоний опухолевых клеток HT29 в монослойной культуре, которую инкубировали с CNTox (# 1), CNT-Dox (# 3), CNT-FITC (# 5). Статистическая значимость:* р ≤ 0,05 или ** р ≤ 0,01

Медиана объема сфероидов многоклеточной опухоли. MTS были созданы в присутствии CNTox (образец № 1), CNT-Dox (образец № 3), CNT-FITC (образец № 5). Статистическая значимость:* р ≤ 0,05 или ** р ≤ 0,01

Примечательно, что в большинстве экспериментов CNT-Dox не оказывает такого цитотоксического воздействия на опухолевые клетки как в 2D, так и в 3D-культуре, которое можно было бы сравнить с эффектом одного доксорубицина. The mechanism of cytotoxic action of doxorubicin is based on penetration into the cell nucleus and intercalation between nucleotide pairs, violation of replication and DNA repair, protein synthesis and, as a result, cell death. The cause of the reduction of cytotoxic effect of the CNT-Dox may be the binding of the doxorubicin with CNT surface through peptide bonds. It prevents Dox dissociation from CNT surface and Dox penetration into the cell and cellular organelles. This fact may let to deliver the compound to certain tissues without causing a negative effect on “non-target” objects.

In this case, the next step of the study was controlled release of doxorubicin. For peptide bonds breaking, we used the commonly known peptidase trypsin as the release agent. The effect of trypsin on the Dox release from the surface of the CNT was investigated by spectral analysis. Since the free doxorubicin has a fluorescence peak at 495 nm, bounded doxorubicin has no such ability. It was analyzed how the increasing of trypsin concentration affected on concentration of free doxorubicin. The results are shown in our previous work [42]. Shortly, it was demonstrated that increasing the concentration of 0.05% trypsin from 11 to 20% in culture medium contributed to an increasing the concentration of free doxorubicin from 3.13 to 6.55 μg/ml. A further increasing the concentration of trypsin to 60% did not lead to increasing in free doxorubicin. However, the concentration of trypsin by about 66% stimulated release again and led to increasing the concentration of doxorubicin in two times, to 11.38 μg/ml. Thus, it was concluded that 0.05% trypsin has several effective concentrations. Under these conditions, peptide bonds between doxorubicin and CNT were broken and doxorubicin was released. Therefore, to analyze how CNT-Dox influence the tumor cells after Dox release, we incubated tumor cells in the w/o fetal bovine serum (FBS) nutrient medium with trypsin and in the presence of CNT-Dox. The survival of tumor cells was determined using the MTT test. The ratio of the nutrient medium, trypsin, concentration of CNT-Dox, and doxorubicin are given in Table 2. The results of incubation HT29 during 48 h are demonstrated on Fig. 8. Cell viability in the presence of trypsin—blue columns, alone doxorubicin—orange columns, and CNT-Dox with trypsin—pink columns. In results, it has been found that the simultaneous use of trypsin and CNT-Dox significantly increased the cytotoxic effect of CNT and doxorubicin compared to the separately use of these substances. So doxorubicin alone at concentrations from 0.05 to 1.0 μg/ml causes a dose-dependent decreasing the percentage of living HT29 cells from 7.18 to 45.7% relative to control (Fig. 8, orange columns). Incubation of CNT-Dox at concentrations of 20.0 to 1.25 μg/ml with trypsin at concentration from 0 t0 70% led to a dose-dependent decreasing in the percentage of living cells from 80.9 and 99.8% respectively (Fig. 8, pink columns). At the same time, incubation with trypsin alone leads to decreasing percentage of living cells only by 34.0–42.0% (Fig. 8, blue columns). Thus, we can conclude that we observe the synergistic effect of CNT-DOX and trypsin. Each individual component has a small cytotoxic effect on cells, and together the cytotoxic potential of substances increases several times.

Percentage of alive cells HT29 after 48 h of incubation in the presence of trypsin, doxorubicin, CNT-Dox. Statistical significance:*р  ≤ 0.05 or **р  ≤ 0.01

As functional groups (Dox) were attached to CNTs surface by peptide bonds as, in vivo Dox release will be realized in organs of the gastrointestinal tract with an increased content of proteases, peptidases. In organism, proteases are used for various metabolic processes. Acid proteases secreted into the stomach (such as pepsin) and serine proteases present in duodenum (trypsin and chymotrypsin) enable us to digest the protein in food [43]. Other proteases are present in leukocytes (elastase, cathepsin G) and play several different roles in metabolic control. This is one of the fastest “switching on” and “switching off” regulatory mechanisms in the physiology of an organism. By complex cooperative action, the proteases may proceed as cascade reactions, which result in rapid and efficient amplification of an organism’s response to a physiological signal. Therefore, the authors suggest that CNT-Dox construction will be the most effective in the case of stomach, pancreas, liver, and small intestine cancer localization in case of parenteral administration of drug.

Influence of CNTs and Their Derivatives on Cell Blood Composition, Hepatic Enzyme System, and Proteins Turnover In Vivo

To determine the impact of the CNTox and CNT-Dox on the protein metabolism and the state of the hepatic enzyme system, the level of albumin (Al), total protein (Tp), alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), and alkaline phosphatase (ALP) was determined. Data are given in Fig. 9a, b. As a result, it was noted that CNT-Dox and Dox have influence on the hepatic enzymes activity, namely on the AST and ALP. AST level increased in mice serum from 1 group for 21.6%, 2 group for 93.9%, and 3 group for 126.4% compared with control. At the same time, the activity of ALP increased in mice serum from 1 group for 23.5%, 2 group for 119.1%, and 3 group for 147.8%. CNTox administration did not show statistically significant changes in AST, ALT, and ALP levels. In addition, it should be noted that CNTox, Doxorubicin, and CNT-Dox slightly increased the level of total protein in the blood of experimental animals. So, we found that systematic introduction of CNTox have not influence on mice serum enzyme profile. And opposite, administration of CNT-Dox and Dox had toxicity influence and induced a chronic hepatic damage. Notably, symptoms of hepatitis had more manifestation after Dox treatment than CNT-Dox. To determine possible inflammatory processes and systemic effects of CNTox, CNT-Dox on the state of blood cells composition, it was analyzed the blood cell formula of the experimental animals. The results are shown in Table 3. Obtained data are in good agreement with the well-known manifestations of doxorubicin’s hematological toxicity:anemia (decreased red blood cells, hemoglobin, hematocrit), thrombopenia (platelet count), neutropenia (decrease in the number of granulocytes). Interestingly, that it was demonstrated the same direction of the changes of practically all hematological parameters in the 1 (CNTox), 2 (CNT-Dox), and 3 (Dox) groups of animals. However, the change in the 2 and 3 groups of animals was statistically significant accordingly to control and 1 group. In the 2 group (CNT-Dox), it was found pronounced decreasing of the monocyte content related to the system of phagocyte mononuclear cells and cell’s immune response (9.5% and 0.12 × 10 ⁹ /l in control, 4.6% and 0.06 × 10 ⁹ /l in 2 group, and 4.55 and 0.05 × 10 ⁹ /l in 3 group). Animals of 2 and 3 groups demonstrated reducing the content of granulocytes (neutrophils) (12.6 and 0.16 × 10 ⁹ /l in control and 8.5% and 0.2 × 10 ⁹ /l in 2 group and 8.05 and 0.16 × 10 ⁹ /l in 3 group). The number of lymphocytes, both in percentage and absolute, increased in 2 and 3 groups (77.9% and 0.97 × 10 ⁹ /l in control and 86.9% and 2.0 × 10 ⁹ /l in 2 group and 87.8% and 2.3 × 10 ⁹ /l in 3 group). The main function of the lymphocytes is recognition of the antigen and participation in the adequate immunological response of the body. T lymphocytes perform regulatory and effectors functions. B lymphocytes take part in humoral immunity, providing immunoglobulins in response to stimulation of other people’s antigens. So, it can be assumed that an increase in the index of lymphocyte content in experimental 1, 2, and 3 groups can be associated with the introduction of foreign antibodies (CNTs) and/or tissue distraction [44]. Some decrease in the absolute number of leukocytes in 2 (1.2 × 10 ⁹ /l) and 3 (0.85 × 10 ⁹ /l) groups compared with the 1 group of animals (2.0 × 10 ⁹ /l) can be regarded as the result of a gradual accumulation of the reversal of toxic effects of Dox. It is described the reaction of WBC in experimental animal groups as well-known toxic hematologic impact from doxorubicin in the development of leucopenia. The analysis of indicators reflecting the number and state of RBC (erythrocytes and hemoglobin) also showed the same trend of misbalance in the 2 and 3 groups of animals. Statistically significant thrombocytopenia and anemia are more indicative in animals of 2 and 3 groups:the number of erythrocytes (5.54 × 10 ¹² /l in control, 3.97 × 10 ¹² /l in 2 group, and 3.12 × 10 ¹² /l in 3 group), the amount of hemoglobin (78 g/dl for intact animals, 55.5 g/dl for 2 group, and 46.2 g/dl for 3 group), hemoglobin (25.25% for intact animals and 16.75% for 2 group and 15.12% for 3 group). The amount of erythrocytes decreased but the average content of hemoglobin in one erythrocyte did not decrease. And, as a result, concentration of hemoglobin per one erythrocyte increased. Analysis of the RBW counts let us suggest that in 2 and 3 group of animals, there are several processes:decreasing the formation of erythrocytes in the bone marrow, the acceleration of erythrocyte destruction, the violation of the structure of membranes of red blood cells, and molecular defects (oxidation) of hemoglobin. Thrombocytopenia (27 × 10 ⁹ /l in intact animals, 14.0 × 10 ⁹ /l in 2 group, and 12.05 × 10 ⁹ /l in 3 group), a dose-dependent reversible myelosuppression, leucopenia and granulocytopenia (neutropenia) are the predominant manifestations of doxorubicin hematologic toxicity and is the most common acute dose-limiting toxicity of this drug. The direction of changes in the platelet content in the blood of experimental animals treated with CNTox and CNT-Dox is the same; however, significantly more pronounced in the group of animals receiving free Dox.

Monitoring of clinical parameters following CNTox (1 group), CNT-DOX (2 group), free DOX (3 group) administration in Balb/2a mice. Mice were treated by CNTox, CNT-DOX, DOX every 3 days during 4 weeks, in concentrations:CNT—1.5 g/kg and Dox—20 mg/kg of weight. Each experiment was done in triplicate. Statistical significance:*р  ≤ 0.05 or **р  ≤ 0.01. ALT alanine transferase, AST aspartate transferase, AP alkaline phosphatase

Thus, according to our results from in vivo experiments, it was demonstrated that systematic introduction of CNTox have not influence on mice serum enzyme profile and protein turnover. And opposite, administration of CNT-Dox and Dox had toxicity influence and induced a chronic hepatic damage. More than that, dose-dependent reversible myelosuppression, leucopenia, and granulocytopenia (neutropenia) was shown for the group of animals receiving free Dox. This predominant manifestation of hematologic toxicity was less pronounced in the group of animals receiving free CNT-Dox and CNTs. So, we can assume that, in the case of parenteral administration of CNT-Dox under action of gastric juice peptidases, CNT-Dox particles breaks up into free CNT and Doxorubicin. After that, Doxorubicin enters to the stomach cells and partly in the bloodstream. That also causes the specified effect on blood cells composition. For modeling Dox release in vivo, trypsin were used in vitro.

One of the goals of this investigation was to minimize the side effects of carbon vehicle on the body. Previously, the authors demonstrated that CNTs may be a potential threat to tumor development due to its ability to stimulate cell migration and support cells in suspension fraction [33]. In this case, CNTs themselves play a role of artificial extra cellular matrix. Another way CNTs can stimulate suspension cells to aggregation. If this process will be coincident with antitumor drug accumulation on CNTs surface, CNTs will attract substrate-independent cells and kill them. Simultaneously, it was found that pure CNTs did not have statistically significant cytotoxicity to tumor cells. So, CNTs alone are not dangerous as cytotoxic agents and can act as carrier for antitumor drugs to target cells. Then, studies were conducted to the functionalization of the CNTs by antitumor antibodies. It was demonstrated that CNTs are able to carry on the surface not only the Dox but also specific tumor antibodies—anti EGFr [42]. Under the action of trypsin, Dox was released and realized strong cytotoxic effect on tumor cells. Recent studies have shown the synergy cytotoxic effect of CNTs and Doxorubicin after release from CNT-Dox construct in the presence of trypsin. Such effect was not demonstrated by CNTs and Dox separately. Therefore, the benefits from the use of CNTs seems in the usage CNTs as vehicle for antitumor antibody and drug. On the other hand, the negative effects of Doxorubicin, like many other early antitumor drugs, are totally cytotoxic effects. Binding of the Dox to the CNTs partially blocks it. This effect allows ensuring local accumulation of the Dox in the focus of tumor activity with subsequent release and action. Thus, greater efficacy can be achieved with a smaller dose of administration. This effect can be achieved only if there are tumor-specific antibodies on the surface of the CNTs. The possibility of creating such construct was demonstrated by the authors in previous work. Undoubtedly, that CNTs dissemination, accumulation, and Dox effective should be tested on mixed culture in vitro and on a tumor model in vivo. For this purpose, synthesized CNT-FITC was created and conducted. The ability of the CNTs to act as an extra-cellular matrix and the significance of this process for the “tumor-body” system should be tested on the animal model. The effectiveness of the drug will be investigated on the model of Ehrlich carcinoma and colon rectal carcinoma [44]. The distribution of CNTs in the tissues of the body will be investigated using the construct created by the CST-FITC, as was mentioned in this work. The accumulation of CNTs in the tissues of the organs of the gastrointestinal system, namely the stomach, liver, and intestines, will be analyzed by histological assay. These studies are already conducted by the authors.

According to Shang-Lin Wang [4] and our data, free doxorubicin causes similar side effects, but more pronounced than CNT-Dox. Other authors reported that toxicity effect of CNTs depends on way of administration, dose, and time of exposure and varies according to the size and type of the cells [45,46,47,48,49]. Settling of CNTs in the tissues of the liver, kidneys, and stomach with prolonged exposure can cause oxidative stress, DNA damages, compromise cell proliferation, necrosis of tissues, and chronic inflammation [50]. According to Manna [51], CNTs can cause oxidative stress and compromise cell proliferation. In the case of in vitro studies, the cytotoxicity of CNT highly depends on the degree of CNTs purification, functionalization, size, and surface charge [52,53,54,55]. According to our results and previous data, the obtained CNTs did not demonstrate a significant cytotoxic effect [33]. More than that, our data let us suggest that there is a combined cytotoxic effect of CNTs and DOX that occurs as in vitro. That is why we assumed that obtained CNTs can be used against tumor cells, in case of the target accumulation of CNTs/CNT-Dox in tumor tissue. However, mechanisms of the cytotoxic effect of CNTs are not completely clear. Some authors suggested that CNT particles activate NF-kappaB pathway depending on the dose and that the mechanism of activation was due to activation of stress-related kinases [51]. Other authors reported that CNTs have a direct pro-apoptotic effect in vitro in different cancer cell lines and tumor cells obtained from surgical specimens [56], CNTs able to modify fatty acids in cell membranes [57] or erythrocyte membrane damage [58]. For further investigation of accumulation CNTs in cells and tissue, we plan to use CNT-FITC composite.

Other unclear questions are as follows:what is the prolonged impact of CNTs/CNT-Dox on organism level and how does it stimulate accumulation CNTs/CNT-Dox in tumor tissue? To investigate the influence of chronical introduction of CNTs/CNT-Dox, long-time studies on model of transplanted or initiated tumors of various localizations will be realized. Other authors analyzed the distribution of nanotubes throughout the body of mice after pulmonary exposure [59]. In results, accumulation of MWCNTs was documented in several organs, including notably the white pulp of the spleen and the bone marrow. The CNTs usually deposit in the liver, spleen, or lungs after they have served their purpose from where they are expelled gradually out of the body through the renal excretion route [60]. Zhao and Liu reported that accumulation of CNTs in the body can lead to granulomatous inflammation or alveolar septal thickening. Zhuang Liu et al. reported that SWNT-PTX affords higher efficacy in suppressing tumor growth than clinical Taxol® in a murine 4T1 breast-cancer model, owing to prolonged blood circulation and tenfold higher tumor paclitaxel (PTX) uptake by SWNT delivery likely through enhanced permeability and retention [61]. Accumulation of CNTs in the target tissue can be enhanced by placing on the CNTs surface specific antibodies which over expressed by tumor cells. The possibility of using antibodies for the targeted delivery of nanostructured preparations has been described by many authors [62, 63].

Conclusion

In 2D culture CNTox concentration from 25 to 50 and 100 μg/ml led to dose-dependent decreasing the viability of tumor cells to 71.8–69.6–62.5% accordingly compared with control. At concentration of CNTox up to 200 μg/ml, the viability of HT29 decreased to 39.2%. At that time, CNT-Dox at concentrations 12.5–25–50 μg/ml did not show statistically significant cytotoxicity, compared with CNTox. At high concentrations (200 μg/ml), CTN-Dox had even less cytotoxicity than CNTox (50%). After incubation with CNT-FITC in concentration of 25 μg/ml, HT29 cell survival reduced to 55% and at 100–200 μg/ml to 23 and 7% respectively. In 3D culture, increasing of CNTox concentration is accompanied with dose-dependent increasing of median volume of MTS. At concentration CNTox from 12.5, 50, 200 μg/ml median volume of MTS increases from 1.79 to 2.18 and 10.98 mm ³ . CNTs-Dox and CNT-FITC did not cause such effect on tumor cells. Doxorubicin alone at concentrations from 0.05 to 1.0 μg/ml causes a dose-dependent decrease in the percentage of living HT29 cells from 7.18 to 45.7% relative to control. Incubation CNT-Dox at concentrations of 20.0 to 1.25 μg/ml with trypsin at concentration from 0 to 70% led to a dose-dependent decreasing the percentage of living cells from 80.9 and 99.8% respectively. At the same time, incubation with trypsin alone leads to decreasing percentage of living cells only by 34.0–42.0%. So, the synergistic effect of CNT-DOX and trypsin was observed. Each individual component has a small cytotoxic effect on cells, and together the cytotoxic potential of substances increases several times. In vivo, systematic introduction of CNTox have not influence on mice serum enzyme profile. And opposite, administration of CNT-Dox and Dox had toxicity influence and induced a chronic hepatic damage, thrombocytopenia, a dose-dependent reversible myelosuppression, leucopenia, and granulocytopenia (neutropenia). Notably, symptoms of hepatitis had more manifestation after Dox treatment than CNT-Dox.

So, the possibility of targeted delivery and controlled release of any highly toxic drug with the use of CNT depends on strategies of reducing toxicity of CNTs and realizing potential of CNTs and anti-tumor drugs “in right place in right time.” According to the data obtained by authors and literature, it is possible. Our data support the assumption that this approach allows to reduce toxicity of the doxorubicin on the general biochemical indicators of blood and violations in the blood cells composition. At the same time, doxorubicin releasing is realized under certain conditions. And combined effect of CNTs and doxorubicin let us achieve greater efficacy in suppressing tumor cell growth in vitro.

Сокращения

Al:

Albumin

ALP:

Alkaline phosphatase

ALT:

Alanine aminotransferase

AST:

Aspartate aminotransferase

CNT-Dox:

Carbon nanotubes which were functionalized by doxorubicin

CNT-FITC:

Carbon nanotubes which were functionalized by fluorescein

CNTox:

Oxidized carbon nanotubes

CNTs:

Carbon nanotubes

Dox:

Доксорубицин

FTIR:

Fourier-transform infrared spectroscopy

MTS:

Multi-cellular tumor spheroid

MWCNTs:

Multi-walled carbon nanotubes

PTX:

Paclitaxel

Tp:

Total protein