Влияние фуллерена C60 на взаимодействие дифенил-N- (трихлорацетил) амидофосфата с ДНК in Silico и его цитотоксическая активность в отношении линии лейкозных клеток человека in vitro

Аннотация

Новый представитель карбациламидофосфатов - дифенил-N- (трихлорацетил) амидофосфат (HL), содержащий два феноксизаместителя рядом с фосфорильной группой, был синтезирован, идентифицирован элементным анализом, ИК- и ЯМР-спектроскопией и испытан как цитотоксический агент сам и в комбинация с C ₆₀ фуллерен.

Согласно результатам молекулярного моделирования, C ₆₀ фуллерен и HL могут взаимодействовать с ДНК и образовывать жесткий комплекс, стабилизированный стэкинг-взаимодействиями фенильных групп HL с C ₆₀ фуллерена и нуклеотида ДНК G, а также за счет взаимодействия HL CCl ₃ группа ион-π-связями с C ₆₀ молекулы и электростатическими связями с нуклеотидом ДНК G.

С использованием теста МТТ цитотоксическая активность HL против лейкозных клеток CCRF-CM человека с IC ₅₀ было показано значение, обнаруженное при концентрации 10 мкМ через 72 часа обработки клеток. При совместном действии 16 мкМ C ₆₀ фуллерен и HL, значение IC ₅₀ был обнаружен при более низкой концентрации HL 5 мкМ и в более ранний 48-часовой период инкубации, кроме того, цитотоксический эффект HL наблюдался при низкой концентрации 2,5 мкМ, при которой HL сам по себе не влиял на жизнеспособность клеток. Связывание C ₆₀ фуллерен и HL с малой бороздкой ДНК с образованием стабильного комплекса предполагается одной из возможных причин их синергетического ингибирования пролиферации клеток CCRF-CЕM.

Применение C ₆₀ Показано, что фуллерен в сочетании с 2,5 мкМ HL не оказывает вредного влияния на структурную стабильность мембраны эритроцитов крови. Таким образом, совместное действие C ₆₀ Фуллерен и HL в низкой концентрации усиливали цитотоксический эффект HL в отношении лейкозных клеток человека и не сопровождался гемолитическим эффектом.

Фон

Представитель углеродной наноструктуры C ₆₀ Показано, что фуллерен обладает уникальными физико-химическими свойствами и биологической активностью не только как антиоксидант или фотосенсибилизатор, но и как модификатор токсического действия противоопухолевых препаратов благодаря своей способности проникать внутрь клетки и действовать как переносчик лекарств [1,2,3,4 ]. С ₆₀ Молекула может взаимодействовать с химиотерапевтическими препаратами, такими как доксорубицин, цисплатин и паклитаксел, и может образовывать с ними комплексы, усиливая терапевтический эффект [5,6,7,8].

Карбациламидофосфаты (CAPh) - это органические молекулы, которые привлекли внимание благодаря своей особой структуре, биологической активности и перспективам биомедицинского применения [9,10,11,12]. Наличие пептидных и фосфорамидных групп, объединенных вместе во фрагменте C (O) N (H) P (O) молекулы, определяет его взаимодействие с биологическими молекулами и клеточными мембранами. Вариация заместителей у фосфорильных и карбонильных групп дает возможность модулировать стереохимические и фармакологические свойства CAPh. В частности, показано, что разные представители CAPh обладают противоопухолевой активностью [13, 14].

Недавно мы подтвердили, что репрезентативный диметил-N- (бензоил) амидофосфат CAPh, используемый в миллимолярном диапазоне концентраций, снижает жизнеспособность лейкемических клеток L1210 и что его токсическому действию способствует C ₆₀ фуллерен [15]. Мы также показали, что введение дополнительных ароматических заместителей и электроотрицательного CCl ₃ в структуру CAPh, что привело к усилению его токсичности [16]. Таким образом, значительный токсический эффект диморфолидо-N-трихлорацетилфосфорамида был продемонстрирован в отношении лейкозных клеток человека различного происхождения, но его эффективная концентрация все еще оставалась высокой и не наблюдалось повышения токсичности после комбинированного действия с C ₆₀ фуллерен. В продолжение этих исследований мы синтезировали нового представителя CAPh дифенил-N- (трихлорацетил) амидофосфата (HL), который имеет два феноксизаместителя вместо морфолидогрупп рядом с фосфорильной группой (рис. 1).

Целью исследования было оценить биологическую активность дифенил-N- (трихлорацетил) амидофосфата (HL) отдельно или в сочетании с C ₆₀ фуллеренов с использованием in silico анализа их взаимодействия с ДНК и исследования цитотоксических эффектов против линии лейкозных клеток человека in vitro.

Методы / экспериментальные

Химические вещества

Жидкая среда RPMI 1640, фетальная бычья сыворотка (FBS), пенициллин / стрептомицин и L-глутамин (Biochrom, Германия), диметилсульфоксид (DMSO) (Carl Roth GmbH + Co, Германия), МТТ [3- (4,5-диметилтиазол- 2-ил) -2,5-дифенилтетразолий бромид] (Sigma-Aldrich Co, Ltd., США), HCl (Харьковреахим, Украина).

Характеристика химического соединения

Для увеличения растворимости мы получили натриевую соль дифенил-N- (трихлорацетил) амидофосфата (HL) в соответствии со следующими реакциями (рис. 2).

Раствор трихлорфосфазотрихлорацетила (0,035 М) в 200 мл хлороформа медленно добавляли к хорошо перемешиваемой суспензии фенолята натрия (0,106 М, 12,3 г) в 150 мл хлороформа (рис. 2; стадия 1). Температура смеси не превышала 40–50 ° С. Перемешивание продолжали около 1 ч, затем раствор нагревали до 70 ° C и перемешивали в течение 20 мин в этих условиях. Полученный продукт трифеноксифосфазотрихлорацетил упаривали. Затем добавляли 40 мл 1 М NaOH и кипятили с обратным холодильником в течение 90 мин (рис. 2; стадия 2). Полученную смесь упаривали. Твердый осадок HL натрия трижды промывали диэтиловым эфиром и перекристаллизовывали из i -пропанол в виде белого кристаллического порошка (выход 80%). Бесцветные кристаллы NaL · 3H ₂ O подходящих для рентгеноструктурного анализа были получены i -PrOH:H ₂ О (9:1 v / v ) медленное испарение раствора. Состав устойчив на воздухе, хорошо растворяется в воде и спиртах. M.p. 215 ° С.

HL идентифицировали с помощью элементного анализа, ИК- и ЯМР-спектроскопии:элементные анализы (C, H, N) проводили с использованием элементного анализатора EL III Universal CHNOS. ИК-спектральные измерения были выполнены для образцов в виде таблеток KBr на спектрометре Perkin – Elmer Spectrum BX FT-IR с разрешением 2 см ^{- 1} и накопления 8 сканирований, которые объединяются для усреднения случайных артефактов поглощения в спектральном диапазоне 4000–400 см ^{- 1} . ¹ Спектры ЯМР 1Н в растворах ДМСО-d6 записаны на ЯМР-спектрометре AVANCE 400Bruker при комнатной температуре.

HL:ИК (см ⁻¹ ):1639 vs, sh (νCO); 1353 с, ш (Амид II); 1194 с, ш (νPO); 941 с, ш (νPN).

¹ H ЯМР (ДМСО-d ₆ ):7,05 (т, 2H, γ-CH ₂ ); 7.205, 7.255 (дт, 8H, α- и β-CH ₂ ).

Для CCl ₃ C (O) N (Na) P (O) (OC ₆ H ₅ ) ₂ определен элементный состав,%:C 40,58, H 2,35, N 3,15; и вычислено,%:C 40,37, H 2,42, N 3,36.

Синтез и характеристика C ₆₀ Фуллерен

Высокостабильный водный коллоидный раствор C ₆₀ фуллерен (200 мкМ, чистота> 99,5%, средний размер наночастиц до 50 нм) был синтезирован в Техническом университете Ильменау (Германия), как описано в [17, 18].

Культура общения

Эксперименты проводились на линии клеток CCRF-CM с острым Т-клеточным лейкозом человека. Клеточная линия была приобретена в Немецкой коллекции микроорганизмов и культур клеток DSMZ института Лейбница:CCRF-CM (ACC 240). Клетки культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% FBS, 1% пенициллина / стрептомицина и 2 мМ глутамина, используя 25 см ² колбы при 37 ° C с 5% CO ₂ в увлажненном инкубаторе.

Клетки в среде RPMI 1640 инкубировали с C ₆₀ фуллерен (16 мкМ) или HL (2,5, 5 и 10 мкМ) по отдельности и вместе в течение 24, 48 и 72 часов. Выживание клеток без добавления HL или C ₆₀ фуллерен был получен за 100% (контрольный образец содержал 0,05 М ДМСО).

Анализ жизнеспособности клеток (MTT)

Жизнеспособность клеток оценивали с помощью анализа восстановления МТТ [3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромид] [19]. В указанные моменты времени инкубации аликвоты по 100 мкл (0,5 × 10 ⁴ клеток) помещали в 96-луночные микропланшеты Sarstedt (Nümbrecht, Германия), в каждую лунку добавляли 10 мкл раствора МТТ (5 мг / мл в PBS) и планшеты инкубировали еще 2 ч при 37 ° C. Затем культуральную среду заменяли 100 мкл ДМСО; Образование диформазана определяли путем измерения поглощения при 570 нм с помощью микропланшетного ридера Tecan Infinite M200 Pro (Меннедорф, Швейцария).

Животные

Исследование проведено на белых крысах-самцах линии «Вистар» массой 170 ± 5 г. Животные содержались в стандартных условиях в виварии УНЦ «Институт биологии и медицины» Киевского национального университета имени Тараса Шевченко. Животные имели свободный доступ к пище и воде. Все эксперименты проводились в соответствии с международными принципами Европейской конвенции по защите позвоночных животных под контролем Комитета по биоэтике вышеупомянутого учреждения.

Оценка гемолиза эритроцитов

Эритроциты получали из гепаринизированной крови крысы линии «Вистар» и разводили в 0,85% растворе NaCl до 0,700 о.е. при 630 нм на спектрофотометре Scinco (Германия). Гемолиз эритроцитов вызывали 0,001 н. HCl. Кинетику гемолиза измеряли спектрофотометрически ( λ =630 нм) каждые 10 с в течение 2 мин. Процент гемолизированных эритроцитов рассчитывали по методике [20]. Эритроциты инкубировали в 0,85% растворе NaCl с C ₆₀. фуллерен (16 мкМ) или HL (2,5 и 10 мкМ) отдельно и вместе в течение 1 ч. Эритроциты без добавления HL или C ₆₀ фуллерен были получены за 100% (контрольный образец содержал 0,05 М ДМСО).

In Silico Study

Молекула ДНК с двойной спиралью была использована в качестве матрицы из базы PDB (Protein Data Bank). Взаимодействие молекулы ДНК с HL отдельно и в сочетании с C ₆₀ фуллерен. Мы принимали во внимание следующие структуры молекулы ДНК:2MIW (CCATCGCTACC - внедрение соединения в малую бороздку спирали ДНК), 1XRW (CCTCGTCC - интеркалирование соединения в малую бороздку спирали ДНК) и 2M2C (GCGCATGCTACGCG - связывание соединение с большими и маленькими бороздками спирали ДНК). Мы применили алгоритм систематической стыковки (SDOCK +), встроенный в пакет QXP (этот метод демонстрирует все возможные конформации исследуемых структур с минимальным значением среднеквадратичного отклонения (RMSD)) [21]. Мы сгенерировали 300 потенциально возможных комплексов с ДНК, десять лучших из которых были отобраны для следующего этапа, используя функцию оценки, встроенную в пакет QXP [22].

Взаимодействие молекулы ДНК с HL отдельно и в сочетании с C ₆₀ фуллерен характеризовался следующими параметрами:(1) количество водородных связей, (2) площадь контактирующих поверхностей ДНК и соответствующей структуры, (3) расстояние между ДНК и стыкованной структурой, и (4) полная энергия структуры привязки.

Для оценки устойчивости комплексов химического соединения с C ₆₀ фуллерена, мы провели короткую молекулярную динамику (MD, 100 пс) с помощью программного инструмента Gromacs [23] в соответствии с алгоритмом Нозе-Пуанкаре-Андерсона (NPA) [24, 25] на основе силового поля OPLS-AA [26, 27] .

Расчеты проводились по следующим параметрам:температура (в Кельвинах) - 300; давление (в килопаскалях) - 100; связывание с участием атома водорода или лиганда ограничивалось алгоритмом [25].

Статистический анализ

Данные были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение более четырех независимых экспериментов. Среднее (M) и стандартное отклонение (SD) были рассчитаны для каждой группы. Статистический анализ проводился с использованием двухфакторного дисперсионного анализа с последующими тестами Бонферрони. Значение p <0,05 считалось статистически значимым. Обработка данных и построение графиков выполнялись на IBM PC с использованием специализированных приложений GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc., США).

Результаты и обсуждения

In Silico Study

Взаимодействие HL с ДНК

Было показано, что HL может интеркалировать в ДНК и образовывать стабильный комплекс при связывании в малой бороздке ДНК через нуклеотиды AGC-GCTA (рис. 3a). В этом случае стэкинг-взаимодействие между азотистым основанием нуклеотида A и фенильной группой HL, а также электростатическое взаимодействие между CCl ₃ группа и нуклеотид C. После моделирования методом МД значения RMSD для двойной спирали ДНК и HL оказались равными 3,3 и 1,62 Å соответственно. Нуклеотидное окружение HL (GCA-CTA) было частично изменено, и стэкинг-взаимодействие было потеряно, в то время как водородная связь образовалась между нуклеотидом G и группой CO HL.

Связывание HL с большой бороздкой ДНК происходило через нуклеотиды TCG-AT (рис. 3b). В этом случае образовывалась водородная связь между группой CO HL и азотистым основанием нуклеотида A, и происходило стэкинг-взаимодействие между фенилами HL и азотистыми основаниями нуклеотидов C и G. Кроме того, вероятность электростатической связи между HL CCl ₃ группы и азотистых оснований нуклеотидов АТ.

После МД моделирования изменений в нуклеотидном окружении HL не обнаружено. Значения RMSD для ДНК и HL составляли 2,77 и 1,58 Å соответственно. Благодаря этому исчезло стэкинг-взаимодействие между нуклеотидом C и фенильной группой.

В случае интеркаляции HL в ДНК его окружение состояло из нуклеотидов CG-CG (рис. 3в). Возникло стэкинг-взаимодействие с нуклеотидами CG:одна фенильная группа была зажата между азотистыми основаниями, а другая образовала стэкинг-взаимодействие с нуклеотидом C.

После моделирования методом МД значения RMSD для двойной спирали ДНК и HL составили 1,71 и 1,89 Å соответственно. Нуклеотидное окружение HL не изменилось. Одна из фенильных групп образует ион-π-взаимодействие с азотистым основанием нуклеотида G, которое, по-видимому, сдвинуто на 1,12 Å.

Полученные энергетические параметры свидетельствовали о том, что энергия стерических столкновений между ДНК и HL, а также внутри самого HL была незначительной (таблица 1).

Проведен сравнительный анализ энергетических параметров связывания HL с малой и большой бороздками ДНК или его интеркаляции в малую бороздку ДНК. Показано, что значения выпуклости составили 6,2 кДж / моль в случае интеркаляции HL в ДНК и 2,5 кДж / моль в случае его связывания с малыми и большими бороздками ДНК (таблица 1). Значения Int составили 8,7 кДж / моль в случае интеркаляции HL в ДНК, 6,3 кДж / моль в случае его связывания с большой бороздкой ДНК и 3,6 кДж / моль в случае его связывания с малой бороздкой ДНК. Эти данные показали, что связывание HL с малой бороздкой ДНК было наиболее стабильным.

Совместное взаимодействие HL и C ₆₀ Фуллерен с ДНК

Ранее с использованием компьютерного моделирования мы продемонстрировали, что C ₆₀ молекула может взаимодействовать с ДНК и образовывать стабильный C ₆₀ + ДНК-комплекс при связывании с малой бороздкой ДНК [15]. Как показано на рис. 4, C ₆₀ фуллерен может также образовывать ионные π-связи с CCl ₃ группы молекулы HL.

Мы использовали две версии молекулярного моделирования HL, C ₆₀ взаимодействие фуллерена и ДНК, которые были предложены в [16] и оказались полезными для интерпретации результатов МД-моделирования. Мы использовали структуру 1XRW PDB молекулы ДНК в версии, когда сначала HL, а затем C ₆₀ молекула интеркалирует в ДНК (HL + C ₆₀ ) и 2MIW PDB структура молекулы ДНК - в варианте, когда изначально C ₆₀ молекула, а затем HL интеркалируется в ДНК (C ₆₀ + HL).

Связывание с малой бороздкой ДНК в случае HL + C ₆₀ версия произошла через нуклеотиды GCTA-GCAT (рис. 4а). Фенильные группы заполнили малую бороздку и вступили в стэкинг-взаимодействия:одна группа с C ₆₀ фуллерен, а другой - с азотистым основанием нуклеотида G. Электростатические взаимодействия возникли между CCl ₃ группа HL и азотистое основание нуклеотида G и C ₆₀ фуллерен.

Согласно результатам МД моделирования, двойная спираль ДНК в этом случае характеризовалась значительной подвижностью (значение RMSD составляет 3,08 Å), значение RMSD для HL составляло 2,04 Å, а C ₆₀ фуллерен оставался практически неподвижным. В результате нуклеотидное окружение HL + C ₆₀ структура была изменена ТГК-ГКАТГ. Кроме того, водородная связь между аминогруппой HL и ДНК и стэкинг-взаимодействия между нуклеотидами азотистых оснований GC и C ₆₀ появился фуллерен.

Связывание HL + C ₆₀ с большой бороздкой ДНК происходит через нуклеотиды C-ATCC (рис. 4b). Водородные связи образовывались между группой HL CO и азотистым основанием нуклеотида A. Фенильные группы заполнили основную бороздку ДНК и вступили в стэкинг-взаимодействие с C ₆₀ фуллерен.

Согласно результатам МД-моделирования, нуклеотидное окружение HL + C ₆₀ структура не изменилась:значения RMSD для ДНК и HL составили 3,14 и 2,24 Å соответственно, C ₆₀ фуллерен оставался практически неподвижным. В этом случае все взаимодействия между HL и C ₆₀ фуллерен исчез, и HL стерически взаимодействовал только с ДНК. Предполагается, что в результате C ₆₀ фуллерен, как и HL, будут вытеснены из основной бороздки ДНК.

Когда HL + C ₆₀ были интеркалированы в малую бороздку ДНК (рис. 4в), происходило связывание с нуклеотидами CGT-GAG. С ₆₀ фуллерен оказался встроенным в малую бороздку ДНК и стерически с ней взаимодействовал. Фенильные группы HL образуют стэкинг-взаимодействия с азотистыми основаниями нуклеотидов CG-CG. Согласно моделированию MD, значения RMSD для ДНК и HL составили 2,29 и 2,13 Å соответственно, C ₆₀ фуллерен оставался практически неподвижным, а CC1 ₃ группа HL вступила в электростатическое взаимодействие с азотистым основанием нуклеотида G.

В случае C ₆₀ + HL, связывание с малой бороздкой ДНК (рис. 4г) происходило через нуклеотиды CGC-GCC. Одна из фенильных групп HL образовывала стопку с C ₆₀ фуллерен, а другой - с нуклеотидом G. CC1 ₃ группа HL, по-видимому, образует электростатическую связь с азотистым основанием нуклеотида C. Согласно МД-анализу, значения RMSD для ДНК и HL в этом случае составили 2,35 и 2,75 Å соответственно, C ₆₀ фуллерен оставался неподвижным, а нуклеотидное окружение C ₆₀ + Структура HL была изменена с помощью CGCT-GC. Кроме того, C ₆₀ Молекула проникла глубже в ДНК и образовала стэкинг-взаимодействие с азотистым основанием нуклеотида C.

Согласно рассчитанным энергетическим параметрам, комплекс, образующийся в случае C ₆₀ + Интеркаляция HL в малую бороздку ДНК была наиболее жесткой (значение Bump 20,0 кДж / моль) (таблица 1). В отличие от HL + C ₆₀ взаимодействия с ДНК этот параметр составлял всего 6,2 кДж / моль при HL + C ₆₀ был интеркалирован в малую бороздку ДНК, 7,8 кДж / моль, когда он был связан с малой бороздкой ДНК, и 8,8 кДж / моль, когда он был связан с большой бороздкой ДНК. Кроме того, энергетические параметры показали, что образование прочных водородных связей внутри HL + C ₆₀ + ДНК-комплекс был возможен только в случае связывания с большой бороздкой ДНК, когда значение Hbnd составляло –2,3 кДж / моль, при других типах взаимодействия оно было равно нулю или –1,0 кДж / моль (таблица 1). Более того, по результатам МД в этом случае как C ₆₀ фуллерен и HL оказались смещенными из основной бороздки ДНК.

Следовательно, C ₆₀ + Предполагается, что связывание HL с малой бороздкой ДНК является наиболее вероятной версией C ₆₀ совместное взаимодействие фуллерена, HL и ДНК.

Исследование биологических эффектов HL in vitro

Жизнеспособность ячеек CCRF-CЕM

В экспериментах in vitro с помощью МТТ-теста оценивали долговременное влияние дифенил-N (трихлорацетил) амидофосфата (HL) в диапазоне 2,5–10 мкМ на жизнеспособность лейкозных клеток CCRF-CЕM человека. Клетки инкубировали в течение 24, 48 и 72 часов в среде RPMI 1640 либо с 16 мкМ C ₆₀. фуллерен или HL по отдельности или их комбинация. Жизнеспособность клеток, инкубированных без C ₆₀ или HL считалось 100%.

Через 24 ч инкубации влияния HL на жизнеспособность клеток CCRF-CЕM не наблюдалось (рис. 5). Тем не менее при более продолжительной инкубации цитотоксическая активность HL в концентрациях 5 и 10 мкМ стала очевидной, жизнеспособность клеток через 48 часов ингибировалась на 25 и 33% соответственно и продолжала падать через 72 часа.

Следует отметить снижение жизнеспособности клеток CCRF-CЕM на 50% (IC ₅₀ ) был обнаружен через 72 ч под действием ГЛ в концентрации 10 мкМ (рис. 5). Недавно мы показали, что другой представитель CAPh диморфолидо-N-трихлорацетилфосфориламид вызывал 50% снижение жизнеспособности клеток CCRF-CЕM через 72 часа в концентрации 1 мМ [16]. Сравнительный анализ этих данных показывает, что введение фенокси вместо морфолидогрупп в структуру производного CAPh позволило на два порядка снизить его эффективную токсическую концентрацию в отношении лейкозных клеток. Мы предполагаем, что конформационная гибкость –P (O) (OC ₆ H ₅ ) core обеспечивало более эффективное взаимодействие этого соединения с ДНК.

Нет влияния C ₆₀ Был обнаружен фуллерен, использованный отдельно для определения жизнеспособности клеток во время инкубационного периода (данные не представлены). В то же время результаты, представленные на рис. 6, демонстрируют, что C ₆₀ фуллерен усиливал цитотоксическую активность HL в отношении клеток CCRF-CЕM. При совместном действии C ₆₀ фуллерена и HL, снижение жизнеспособности клеток на 50% наблюдалось при более низкой концентрации HL (5 мкМ) и в более ранний период (48 ч) инкубации, чем под действием самого HL. Более того, через 72 часа комбинированного действия C ₆₀ фуллерена и HL, цитотоксический эффект HL был обнаружен при низкой концентрации 2,5 мкМ, при которой сам по себе HL не влиял на жизнеспособность клеток (рис. 6).

Таким образом, C ₆₀ Было показано, что фуллерен усиливает цитотоксические эффекты HL и значительно увеличивает чувствительность лейкемических клеток к его действию в низких концентрациях. Учитывая, что C ₆₀ фуллерен способен накапливаться внутри лейкозных клеток в течение 24 часов [28] и локализоваться во внутриклеточных компартментах [29,30,31], особенно в ядре [32, 33], его взаимодействие с ядерной ДНК активно пролиферирующих раковых клеток не должно происходить. быть исключенным.

Таким образом, данные, полученные in vitro, соответствуют результатам исследования in silico и демонстрируют, что первоначальное связывание C ₆₀ молекула, а затем HL с малой бороздкой ДНК с образованием стабильного комплекса может быть одной из возможных причин их синергетического ингибирования пролиферации клеток CCRF-CЕM.

Устойчивость эритроцитов к гемолизу

Об оценке противоопухолевого потенциала HL и C ₆₀ комбинации фуллерена, важно учитывать его возможное воздействие на доброкачественные клетки, в частности на клетки крови.

Изучение устойчивости эритроцитов к кислотному гемолизу позволяет выяснить влияние фармакологического агента на мембранном уровне. Динамика гемолиза отражает динамику разрушения плазматической мембраны эритроцита и, следовательно, стабильность его структурной организации. На рис. 7 представлена зависимость процента гемолиза эритроциты инкубировали в течение 1 ч в растворе NaCl без добавок (контроль) и с HL или C ₆₀ фуллерен по отдельности или в комбинации. Нет влияния 16 мкМ C ₆₀ фуллерен на гемолизе эритроцитов обнаружен (не показан). HL в концентрации 2,5 мкМ отдельно или в комбинации с C ₆₀ влияет на устойчивость эритроцитов к гемолизу (рис. 7). Между тем, под действием ГЛ в концентрации 10 мкМ обнаружено ускорение гемолиза с максимумом через 20 с. Комбинированное действие 10 мкМ HL и C ₆₀ фуллерена сопровождалась дальнейшим усилением гемолиза с 60% гемолизированных эритроцитов через 20 с.

Полученные данные показали, что применение C ₆₀ фуллерен в сочетании с 2,5 мкМ HL не оказывал вредного воздействия на структурную стабильность мембраны эритроцитов крови и в то же время позволял значительно повысить цитотоксическую активность HL в этой низкой концентрации против лейкемических клеток. Несмотря на синергетический цитотоксический эффект C ₆₀ фуллерен и HL в концентрации 10 мкМ против лейкозных клеток, применение их комбинации оказалось ограниченным усилением гемолитического эффекта.

Наконец, в контексте вышеупомянутого исследования in vitro важно подчеркнуть, что граница раздела вода / твердое тело имеет ограниченную воду, которая также может влиять как на транспортные, термодинамические свойства наноструктур [34, 35], так и на их взаимодействие с клеточными мембранами. [36].

В литературе есть данные о внутриклеточной локализации производных карбациламидофосфатов, в частности о проникновении фосфорамидатов в клетки. Таким образом, производные фосфорамидата могут проникать через мембрану клеточных линий рака молочной железы и легкого (H460, H383 и H2009) MDA-231 [37]. Было показано, что нитробензилфосфорамидный иприт проникает через клеточные мембраны и локализуется в митохондриях NTR ⁺ клетки млекопитающих [10]. Не исключено, что C ₆₀ фуллерен, способный проникать через мембрану раковой клетки за счет пассивной диффузии или эндоцитоза [28, 30, 32] с накоплением в ядре и митохондриях [30, 32, 33], может быть переносчиком небольших противоопухолевых молекул [ 38,39,40].

Выводы

Новый представитель производных карбациламидофосфатов, которые имеют два феноксизаместителя возле дифенил-N- (трихлорацетил) амидофосфата (HL) с фосфорильной группой, был синтезирован и испытан как сам цитотоксический агент и в комбинации с C ₆₀ фуллерен. Согласно результатам молекулярного моделирования, когда C ₆₀ фуллерен, а затем HL были связаны с малой бороздкой ДНК, образовался жесткий комплекс, стабилизированный стэкинг-взаимодействиями фенильных групп HL с C ₆₀ фуллерена и нуклеотида ДНК G, а также за счет взаимодействия HL CCl ₃ группа ион-π-связями с C ₆₀ молекулы и электростатическими связями с нуклеотидом ДНК G.

С помощью теста МТТ мы показали цитотоксическую активность HL против лейкозных клеток CCRF-CM человека с IC ₅₀ значение, обнаруженное при концентрации 10 мкМ через 72 часа обработки клеток. Цитотоксическому эффекту HL способствовал C ₆₀ фуллерен. При совместном действии 16 мкМ C ₆₀ фуллерен и HL, значение IC ₅₀ был обнаружен при более низкой концентрации HL 5 мкМ и в более ранний 48-часовой период инкубации, и, кроме того, цитотоксический эффект HL наблюдался при низкой концентрации 2,5 мкМ, при которой HL сам по себе не влиял на жизнеспособность клеток.

Ранее мы показали значительный токсический эффект диморфолидо-N-трихлорацетилфосфорамида в отношении лейкозных клеток человека различного происхождения, но его эффективная концентрация была высокой и не усиливала токсичность после комбинированного действия с C ₆₀ фуллерен [16]. Мы предполагаем, что введение гибкости –P (O) (OC ₆ H ₅ ) групп вместо морфолидогрупп в производное CAPh способствовали снижению его токсической концентрации против лейкозных клеток человека, обеспечивая его эффективное взаимодействие с C ₆₀ молекула и ДНК. Связывание C ₆₀ фуллерен и HL с малой бороздкой ДНК с образованием стабильного комплекса предполагается одной из возможных причин их синергетического ингибирования пролиферации клеток CCRF-CЕM.

Мы обнаружили, что применение C ₆₀ фуллерен в сочетании с 2,5 мкМ HL не оказывал вредного воздействия на структурную стабильность мембраны эритроцитов крови, в то время как комбинация C ₆₀ фуллерен с 10 мкМ HL оказался ограниченным усилением гемолитического эффекта.

Таким образом, C ₆₀ Было показано, что фуллерен усиливает цитотоксический эффект HL и значительно увеличивает чувствительность лейкозных клеток человека к его действию в низкой концентрации. Комбинация C ₆₀ фуллерен с HL в низкой концентрации 2,5 мкМ может быть многообещающим для дальнейших биомедицинских исследований.