Высокобиосовместимые наночастицы Au Nanocage@PEG: новый контрастный агент для КТ с улучшенной ин виво визуализацией

Аннотация

В последние годы контрастные вещества широко применяются в технологиях визуализации для повышения качества изображений. Наночастицы обладают лучшей способностью к детектированию в живом организме, чем традиционные молекулярные контрастные агенты. В данном исследовании синтезирован новый тип наночастиц Au наноклеток@PEG (AuNC@PEG) с высоким коэффициентом поглощения рентгеновского излучения для использования в качестве контрастного агента при компьютерной томографии (КТ). Результаты показали, что AuNC@PEG обладают хорошей водной дисперсией, низкой цитотоксичностью и сильной способностью поглощать рентгеновское излучение. Более того, ин виво исследования продемонстрировали, что синтезированные AuNC@PEG обеспечивают явное усиление контраста, длительное циркуляционное время в крови и пренебрежимо малой токсичностью в живом организме. Следовательно, функционализированные AuNC@PEG, полученные в этом исследовании, имеют большой потенциал для клинического применения в КТ-визуализации.

Введение

В последние годы компьютерная томография (КТ) стала наиболее распространенным методом диагностической визуализации в клинической практике и широко применяется для изучения различных тканей человека. Благодаря высокой проникающей способности, отличному контрасту и относительно простой обработке изображений, КТ считается самым мощным неинвазивным методом диагностической визуализации в современной медицине [1, 2]. Однако при визуализации часто отсутствует естественный контраст между поражением и окружающими структурами. Поэтому необходимо использовать контрастное вещество — субстанцию с относительно более высокой или низкой плотностью — для различиения целевых структур, тканей и органов. Это вещество имеет разную поглощающую способность в разных тканях и может быть обнаружено при рентгеновском облучении мягких тканей. Применение различных молекул и микропartikelлярных контрастных агентов в КТ-визуализации оценивалось [3,4,5].

На данный момент наиболее часто используемым контрастным агентом для КТ является органическая молекула, содержащая йод. Йодсодержащие молекулы, такие как йодид-ион или неионные препараты, широко применяются в клинике. Хотя они обеспечивают хорошее контрастирование, у них быстрая почечная клиренс, короткое время циркуляции в организме и аллергенные свойства, что значительно ограничивает их дальнейшее применение [6, 7]. Из-за быстрого выведения йодсодержащего препарата серьезно ограничивается эффективное временное окно для визуализации кровеносного русла, и получить высококонтрастное изображение затруднительно. Кроме того, быстрая элиминация больших доз может иметь потенциальные побочные эффекты на почки [8, 9].

За последнее десятилетие применение наночастиц в биомедицине, особенно в диагностической визуализации, привлекло значительное внимание [10]. По сравнению с йодсодержащими контрастными агентами, наночастицы обладают нагрузкой контрастных характеристик, которых не имеют малые молекулы, а также специфическими размером, формой и поверхностью [11, 12]. Обычно наночастицы с большим атомным номером, такие как золото, серебро и другие металлические наночастицы, имеют отличный коэффициент поглощения рентгеновского излучения и, следовательно, замечательную способность к усилению контраста [13, 14]. Среди них золотые наночастицы быстро развиваются в биомедицине и рассматриваются как замена йодсодержащим агентам благодаря своей значительной биологической инертности и легкости синтеза и поверхностной модификации [15,16,17]. Золотые наночастицы имеют более длительное время циркуляции в крови, более низкий риск нефротоксичности и более высокий коэффициент поглощения рентгеновского излучения, чем йодсодержащие соединения. Поэтому можно применять меньшие дозы, а риск побочных эффектов снижен [18]. Различные золотые наночастицы, включая наносферы, наножилы и нанозвезды, широко использовались как контрастные агенты для КТ с перспективными результатами [19, 20]. Среди различных золотых наноструктур Au наноклетки имеют полую внутреннюю структуру и тонкие пористые стенки, что обеспечивает большую поверхностную площадь и более эффективную способность к КТ-визуализации, чем другие морфологии золотых наночастиц [21, 22]. В последние годы Au наноклетки использовались как усилители контраста для оптической когерентной томографии и фотоакустической томографии, показывая хорошие результаты. Кроме того, благодаря большой площади поглощения, Au наноклетки являются эффективными фототермальными преобразователями [23, 24]. Насколько нам известно, лишь несколько исследований оценивали использование Au наноклеток как контрастного агента для КТ. Основываясь на вышеуказанных исследованиях, мы дополнительно изучили применение Au наноклеток как КТ-контрастного агента. Применение наночастиц в КТ-визуализации требует поверхностей с биосовместимостью и биологической активностью. Полиэтиленгликоль (PEG) — биодеградируемый и биосовместимый полимер, который также служит «невидимым» материалом для предотвращения захвата системой ретикулоэндотелиальной системы (RES) и улучшения биосовместимости, почечной клиренс и времени циркуляции в крови; таким образом, ПЕГилированные наночастицы могут длительно удерживаться в крови [15, 25,26,27,28].

В данном исследовании были получены и охарактеризованы новые AuNC@PEG. Затем ин витро биосовместимость AuNC@PEG оценивалась методами МТТ-колориметрии, определения утечки лактатдегидрогеназы (ЛДГ), измерения внутриклеточного концентрации реактивных форм кислорода (РФК) и окраски Кальцеин-АМ/PI, а также другими экспериментальными техниками. Кроме того, проводились гематологический и гистологический анализы для определения токсичности AuNC@PEG ин виво. Результаты показали, что AuNC@PEG обладают отличной ин витро и ин виво биосовместимостью. Кроме того, установлено, что AuNC@PEG имеют более сильную способность к КТ-визуализации как ин витро, так и ин виво. Эти экспериментальные результаты демонстрируют, что синтезированные AuNC@PEG обладают очевидными преимуществами: сильный контраст, длительное время циркуляции в крови и низкий риск нефротоксичности. Следовательно, функционализированные AuNC@PEG, полученные в этом исследовании, имеют большой потенциал для клинического применения в КТ-визуализации.

Методы

Все экспериментальные протоколы, включая соответствующие детали, были одобрены Региональным этических комитетом Цзиньчжоуского медицинского университета в провинции Ляонин, Китай.

Материалы и инструменты

Наборы для определения ЛДГ и РФК приобретены в Нанкинском институте биоинженерии, Китай, а наборы для окраски Кальцеин-АМ/PI — в Shanghai Dongren Chemical Technology Co., Ltd., Китай. Другие химические реактивы и растворители приобретены у Sigma-Aldrich. Все срезы оценивались с использованием флуоресцентного микроскопа (DMI4000B, Leica, Ветцлар, Германия). Характеристики синтезированных наночастиц оценивались с помощью передаточного электронного микроскопа (ТЕМ). Для сканирования использовался 256-рядный 512-срезовый спиральный КТ-сканер (Philips, Германия) со следующими параметрами: толщина среза 0,625 мм; трубное напряжение 100 кВ; трубной ток 100 мА.

Синтез AuNC@PEG

Au наноклетки были получены простой реакцией гальванической замещения между Ag нанокубами и раствором HAuCl₄ согласно предыдущему исследованию [29, 30]. Типичным образом, 25-нм Ag нанокубы готовились в диэтиленгликоле и использовались как матрицы для синтеза 30-нм Au наноклеток. Затем SH-PEG (молекулярная масса ≈ 2000, 10 мг, растворенные в 5 мл фосфатно-буферного раствора (ФБР)) добавляли к раствору AuNC (pH 8,0, 6,55 нМ, 6 мл) и перемешивали в течение ночи в темноте под защитой азота. После трехкратного промывания AuNC@PEG диспергировали в водном растворе.

Оценка ин витро токсичности

В этом исследовании для определения токсичности синтезированных AuNC@PEG ин витро использовались МТТ-колориметрия, метод утечки ЛДГ, анализ внутриклеточной концентрации РФК и окраска Кальцеин-АМ/PI. Клетки HUVEC посеяли в 96-колодчатых пластинках с плотностью 1 × 10⁴/колодез. Использовали среду RPMI-1640 с 10% фетальной телячьей сывороткой, пенициллином (100 мкг/мл) и стрептомицином. Клетки культивировали при 37 °C и 5% CO₂ в течение 12 ч. Затем добавляли среду с AuNC@PEG в разных концентрациях (10, 20, 50, 100, 200, 500 и 1000 мкг/мл) для дальнейшей культивации. Через 24 ч проводили МТТ-тест. Культуральная среда без наночастиц использовалась как контроль в каждой группе.

Затем определяли содержание лактатдегидрогеназы (ЛДГ), выделенной из клеток HUVEC, обработанных AuNC@PEG в разных концентрациях, для оценки ин витро токсичности. Клетки посеяли аналогично МТТ-тесту, затем обрабатывали AuNC@PEG в разных концентрациях (10, 20, 50, 100, 200, 500 и 1000 мкг/мл) в течение 24 ч. Надстоявшую отделяли, центрифугировали и переносили в чистую 96-колодчатую пластинку. Активность ЛДГ в культуральной среде оценивали согласно инструкции производителя, абсорбцию измеряли на ферментном иммуноанализаторе (450 нм).

На основе принципа измерения внутриклеточной концентрации РФК с использованием набора для определения РФК, DCFH окислялся до дихлорфлуоресцеина (DCF) — ярко-зеленого флуоресцирующего вещества — в присутствии 2',7'-дихлорфлуоресцеина (DCFH-DA). Клетки HUVEC культивировали в 24-колодчатых пластинках 12 ч, обрабатывали AuNC@PEG в разных концентрациях (50, 100, 200 и 500 мкг/мл) 24 ч и инкубировали с DCFH-DA при 37 °C в течение 40 мин. Клетки, обработанные перекисью водорода (H₂O₂), использовались как положительный контроль. Флуоресцентную интенсивность клеток наблюдали на флуоресцентном микроскопе (λэкз, 485 нм; λэмиссион, 525 нм). Перед оценкой клетки трижды промывали безсывороточной и безледяной средой.

Для окраски живых/мертвых клеток HUVEC посеяли в 24-колодчатые пластинки и культивировали 12 ч. Затем клетки обрабатывали AuNC@PEG в разных концентрациях (10, 20, 50, 100, 200, 500 и 1000 мкг/мл) 24 ч. После трипсинизации с EDTA и центрифугирования клетки промывали ФБР (pH = 7,4); затем полученную клеточную суспензию смешивали с предварительно приготовленным реагентом Кальцеин-АМ/PI и культивировали при 37 °C в течение 15 мин. Для определения токсичности AuNC@PEG подсчитывали количество мертвых клеток с помощью флуоресцентной микроскопии.

Животная модель

Все процедуры животных экспериментов выполнялись в соответствии с критериями, установленными Комитетом по защите и использованию животных Цзиньчжоуского медицинского университета. После эксперимента животных усыпляли по гуманитарным принципам. В исследовании использовали взрослых крыс линии Sprague Dawley весом 250–300 г (приобретенных в Центре животных Цзиньчжоуского медицинского университета). Все животные случайным образом разделяли на группы. Раствор хлоральгидрата (10 масс.%) вводили внутрибрюшинно; затем все материалы инъецировали в хвостовую вену.

Ин витро и ин виво КТ-визуализация

Для ин витро КТ-визуализации AuNC@PEG в разных концентрациях и йодсодержащие растворы помещали в эппендорфовские трубки и располагали в надлежащем порядке, затем проводили КТ-сканирование спереди назад. При ин виво КТ-сканировании, после внесения анестезии, животных сканировали от головы до хвоста, используя центр брюшной полости как ориентир. Положение животных не менялось при каждом сканировании. Все исходные данные (изображения 0,625 мм) передавали на рабочую станцию Philips для анализа КТ-сканированием.

Оценка ин виво токсичности

Гематологический анализ проводили стандартным методом взятия крови из сафеновой вены. Ткани сердца, печени, селезенки, легких и почек крыс фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 48 ч и встраивали в парафин после обезвоживания. Парафиновые срезы толщиной 5 мкм монтировали на стекло. Затем проводили гемоксилин-эозиновое (H&E) окрашивание и анализ под микроскопом.

Статистический анализ

Данные анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа, а P-значение использовалось как индекс. P < 0,05 считалось статистически значимым, выражалось средним значением стандартного отклонения.

Результаты и обсуждение

Синтез и характеристика AuNC@PEG

Поверхностная функционализация и контроль размера — два ключевых фактора для разработки высокопроизводительных нано-контрастных агентов [15]. Структура и свойства AuNC@PEG определяли с помощью ТЕМ и ДЛС. Рис. 1а показывает, что размер AuNC@PEG составляет около 40 нм с высокой однородностью; при этом гидратационный радиус AuNC@PEG также использовался для проверки дисперсности в растворе, как показано на рис. 1б, гидратационный радиус AuNC@PEG составлял около 50 нм, что свидетельствует о том, что AuNC@PEG очень стабильны без агрегации. AuNC@PEG имеют меньший размер и относительно хорошую биологическую инертность, что лучше для наномедицинских применений. Более того, полая клетчатая структура указывает на большую внутреннюю и внешнюю удельную поверхностную площадь и лучшую способность к КТ-визуализации, а окружающие металлические стенки обеспечивают дополнительную защиту полезной нагрузки при обработке, транспортировке и хранении. Благодаря очевидной ядро-оболочечной структуре, внешняя поверхность покрыта биологически применимым PEG, что может эффективно повысить биосовместимость и избежать захвата макрофагами.

Безопасность и стабильность AuNC@PEG ин витро

Перед использованием AuNC@PEG для ин виво визуализации мы оценили их безопасность и стабильность. Влияние AuNC@PEG на жизнеспособность клеток HUVEC определяли с помощью МТТ-теста (Рис. 2а). Клетки обрабатывали AuNC@PEG в разных концентрациях (10, 20, 50, 100, 200, 500 и 1000 мкг/мл) в течение 24 ч. Результаты МТТ-теста показали, что выживаемость клеток при обработке AuNC@PEG была схожа с контрольной группой и обладала благоприятной биосовместимостью, когда концентрация AuNC@PEG достигала 200 мкг/мл. Выживаемость клеток при концентрации 1000 мкг/мл все еще была > 75%.

Кроме того, ЛДГ-тест также использовался для оценки биосовместимости AuNC@PEG ин витро. В нормальных клетках ЛДГ не проходит через клеточную мембрану. При повреждении клеточной мембраны ЛДГ выходит через нее [31]. Таким образом, мы оценивали безопасность AuNC@PEG, измеряя содержание ЛДГ в надстоявшем клеток (Рис. 2б) после обработки клеток AuNC@PEG в разных концентрациях в течение 24 ч. Результаты показали, что уровень ЛДГ, выделенной клетками, незначительно увеличился по сравнению с неэкспонированными контрольными клетками, когда концентрация AuNC@PEG была < 200 мкг/мл, и был значительно ниже, чем в положительной контрольной группе (H₂O₂), что согласуется с результатами МТТ-теста, и 200 мкг/мл AuNC@PEG как оптимальная концентрация были найдены с хорошей цитокомпатибельностью.

Более того, проводились тесты оксидативного стресса и оценка иммунофлуоресцентной окраски живых/мертвых клеток (Кальцеин-АМ/PI) для определения токсичности AuNC@PEG ин витро. Окидативный стресс — вредное состояние для всех живых систем, и избыток реактивных форм кислорода (РФК) может вызывать окидативный стресс [32, 33]. Поэтому мы измеряли уровень РФК в клетках. После 24-часовой индукции AuNC@PEG в разных концентрациях зеленая флуоресцентная интенсивность клеток, индуцированных при концентрации 50–200 мкг/мл, не значительно отличалась от контрольной группы и была значительно ниже, чем в положительной контрольной группе (Рис. 2с). Флуоресцентная интенсивность была пропорциональна уровню РФК. Как показано на Рис. 3, выживаемость клеток HUVEC при концентрации 0–200 мкг/мл составляла > 90% (Рис. 3а–f). Вышеуказанные результаты подтвердили, что AuNC@PEG при концентрации 200 мкг/мл стабильны и обладают хорошей клеточной совместимостью, и могут быть перспективными клиническими контрастными агентами.

Ин витро КТ-визуализация и определение КТ-значения

Для оценки применимости AuNC@PEG в КТ-визуализации мы сравнили усиление контраста различных молярных концентраций (AuNC@PEG) с клинически используемым контрастным агентом (йод). Получали КТ-изображения и измеряли КТ-значения. AuNC@PEG сравнивали с йодсодержащими образовыми агентами при похожих концентрациях (50, 100, 200, 500 и 1000 мкг/мл). Результаты показали, что КТ-значение увеличивалось с ростом концентрации (Рис. 4а), и согласно анализу КТ-значений AuNC@PEG и йодсодержащего контрастного агента (Рис. 4б), коэффициент поглощения AuNC@PEG был лучше, чем у йодсодержащих контрастных агентов при аналогичных концентрациях, что указывает на то, что использование AuNC@PEG для КТ-визуализации более эффективно.

Ин виво КТ-визуализация

Благодаря высокой контрастной способности AuNC@PEG, мы дополнительно сравнили качество визуализации AuNC@PEG с йодсодержащими агентами ин виво. Двести микролитров AuNC@PEG (200 мкг/мл) вводили в хвостовую вену крыс. Время ангиографии кровеносного русла AuNC@PEG оценивали через доинъекционное (0 мин) и послеинъекционное непрерывное сканирование в временных точках (10, 20, 30, 40, 60 и 90 мин). Затем крысам контрольной группы вводили йодсодержащий контрастный препарат в соответствующей концентрации. Доза инъекции и время сканирования были аналогичны AuNC@PEG. После введения контрастного агента одновременно наблюдали усиление контраста почки (Рис. 5) и наполнение мочевого пузыря (SI Рис. 1). Результаты показали, что почка в группе AuNC@PEG достигала пика через 30 мин и полностью выводилась через 90 мин, а в группе йодсодержащего контрастного агента — пик через 20 мин и полное выведение через 60 мин. Затем наблюдали, что мочевой пузырь постепенно наполнялся контрастным агентом со временем. Это показывает, что время ангиографии кровеносного русла AuNC@PEG лучше, чем у йодсодержащего контрастного агента. Более длительное время циркуляции AuNC@PEG в крови может обеспечить лучшую диагностику, и AuNC@PEG имеет лучшие перспективы развития.

Безопасность AuNC@PEG ин виво

Как показано на Рис. 6а, стандартные параметры общего анализа крови и функции печени и почек отражались уровнем гемоглобина, средней концентрацией гемоглобина в эритроците, средним объемом эритроцита, количеством тромбоцитов, количеством эритроцитов, количеством лейкоцитов, концентрацией альбумина, уровнем АЛТ, АСТ и креатинина. В статистическом анализе значимых различий между группами AuNC@PEG, йодсодержащего контрастного агента и контрольной группы не наблюдалось (P > 0,05). Кроме того, органы (сердце, печень, селезенка, легкие и почки) крыс анализировали гистологически, как показано на Рис. 6б, через 24 ч после инъекции AuNC@PEG (200 мкг/мл); срезы окрашивали (H&E). По сравнению с контрольной группой (без инъекции наноматериалов), под микроскопом не обнаруживали явных морфологических изменений и повреждений. Вышеуказанные результаты дополнительно подтвердили безопасность и надежность AuNC@PEG ин виво.

Заключение

Мы разработали AuNC@PEG — новый тип контрастного агента для КТ со следующими характеристиками: малый размер, высокий контраст, длительное удержание в крови и низкий риск токсичности. Ин витро и ин виво оценки токсичности показали, что AuNC@PEG обладают хорошей биосовместимостью и низким риском побочных эффектов. Производительность КТ-визуализации ин витро и ин виво демонстрировала, что AuNC@PEG имеют более высокий коэффициент поглощения рентгеновского излучения и более длительное время ангиографии кровеносного русла, чем традиционные йодсодержащие образовые агенты. Кроме того, AuNC@PEG превосходят йодсодержащие агенты, и их использование практично. Все эти результаты показывают, что AuNC@PEG имеют более высокий коэффициент поглощения рентгеновского излучения, чем традиционные йодсодержащие контрастные агенты, и производительность визуализации AuNC@PEG выше, чем у традиционных йодсодержащих контрастных агентов. Следовательно, синтезированные в этом исследовании функционализированные AuNC@PEG имеют большой потенциал для клинического применения в КТ-визуализации.

Доступность данных и материалов

Сырые/обработанные данные, необходимые для воспроизведения этих результатов, в настоящее время не могут быть предоставлены, так как данные также являются частью текущих исследований и разработок.

Аббревиатуры

КТ:

Компьютерная томография

DCF:

Дихлорфлуоресцеин

DCFH:

Дихлорфлуоресцин

H₂O₂:

Перекись водорода

ЛДГ:

Лактатдегидрогеназа

МТТ:

3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиевый бромид

ФБР:

Фосфатно-буферный раствор

PEG:

Полиэтиленгликоль

РФК:

Реактивные формы кислорода

ТЕМ:

Передаточный электронный микроскоп