Зеленое синтезирование церий-содержащих углеродных наночастиц с превосходным поглощением гидроксильных радикалов для антиоксидантной терапии

Аннотация

Недавние достижения в наномедицине подчеркнули оксид церия наночастиц как мощные антиоксиданты. Здесь мы представляем простой, экологически чистый метод, использующий сывороточный альбумин быка (BSA) для биоминерализации церий-содержащих углеродистых наночастиц (Ce-doped CNPs). Полученные частицы монодисперсны, со средним диаметром 14,7 нм, и демонстрируют обильные гидрофильные поверхностные группы, обеспечивающие длительную дисперсию в водных средах. In vitro цитотоксикологические исследования (CCK-8) подтверждают пренебрежимую клеточную токсичность в широком диапазоне доз. При воздействии перекиси водорода индуцируемых реактивных форм кислорода, Ce-doped CNPs проявляют исключительную способность к поглощению гидроксильных радикалов, защищая гладкомышечные клетки сосудов и опухолевые клетки 7721 от оксидативного повреждения дозависящим образом. Эти результаты устанавливают Ce-doped CNPs как перспективные малотоксичные поглотители РАК для лечения заболеваний, связанных с оксидативным стрессом.

Введение

Оксидативный стресс, определяемый как дисбаланс между производством реактивных форм кислорода (РФК) и антиоксидантной защитой, лежит в основе многих хронических заболеваний, включая атеросклероз, рак и нейродегенерацию. Высокореактивный гидроксильный радикал (•OH) особенно вреден, инициируя перекисное окисление липидов, модификацию белков и разрывы цепей ДНК, что завершается гибелью клеток и повреждением тканей. Терапевтические стратегии, снижающие уровень РАК, особенно •OH, поэтому представляют большой клинический интерес.

Наночастицы оксида церия (CeO₂ NPs) выступили в качестве мощных наноферментов благодаря обратимому циклу окисления-восстановления Ce³⁺/Ce⁴⁺. Это позволяет им имитировать активность супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы (КАТ), поглощая •O₂⁻ и H₂O₂ соответственно. Однако обычные CeO₂ NPs часто требуют поверхностных покрытий (например, ПВП) для достижения водной стабильности и биосовместимости, что может изменять их внутренние свойства. Наше исследование обходит это ограничение, встраивая ионы церия в углеродистый каркас, полученный из BSA, образуя Ce-doped CNPs с внутренней гидрофильностью и надежной антиоксидантной активностью.

Экспериментальная часть

Материалы и реактивы

Сывороточный альбумин быка (BSA), флуоресцеиндиацетат (FDA) и йодид пропидия (PI) были приобретены у Sigma (Нью-Йорк, США). Фетовый говяжий сыворотка (FBS) и среда Дюльбекко (DMEM) получены от Invitrogen China Limited (Шанхай). Шестигидрат нитрата церия (Ce(NO₃)₃·6H₂O), метилфиолет (MV), семигидрат сульфата железа (FeSO₄·7H₂O) и 30% H₂O₂ закуплены у Aladdin Reagent Corporation (Шанхай) и Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Пекин). Все химикаты аналитического класса, использованы без дополнительной очистки; использовалась деионизированная вода.

Синтез церий-содержащих углеродистых наночастиц

Ce-doped CNPs были получены биоминерализационным методом, адаптированным от BSA-матричного синтеза, описанного Wang et al. Кратко: 1,25 г BSA растворяли в 50 мл деионизированной воды при непрерывном перемешивании до прозрачного раствора. Раствор 300 мМ Ce(NO₃)₃·6H₂O добавляли капельно при интенсивном перемешивании. Одновременно медленно вводили 2,0 М NaOH для повышения pH до 12. Смесь перемешивали при 55 °C в течение 8 ч, получая бурую суспензию, которая остывала до комнатной температуры. Продукт фильтровали через мембрану PES с порой 0,22 мкм для удаления крупных агрегатов, диализировали против воды (MWCO 14 кДа) в течение 3 суток и сублимировали в вакууме. Полученный порошок хранили для дальнейшей характеристики.

Методы характеристики

Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ, JEOL JEM-2100) дала морфологические данные при 200 кВ. Распределение размеров частиц вычисляли с помощью ImageJ (NIH). Фурье-инфракрасная спектроскопия (ФТИР, Nicolet Nexus 470) и рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия (XPS, PHI 5000) идентифицировали поверхностные функциональные группы и степени окисления. Рентгеновская дифракция (XRD, Rigaku D/MAX-2000) подтвердила кристаллические фазы. UV-Vis поглощение (Shimadzu UV-2550) регистрировали для растворных исследований.

UV-Vis фотометрический анализ поглощения радикалов

Ce-doped CNPs (10 мкМ) диспергировали в 0,1 М Tris-HCl (pH 5,0) и ультразвуковой обработкой улучшали растворимость. Реакционная смесь содержала 3,0 × 10⁻⁵ М MV, 0,15 мМ FeSO₄·7H₂O, 1,0 М H₂O₂ и суспензию Ce-doped CNP (0,17 мМ) в объеме 10 мл. Через 5 мин при комнатной температуре измеряли абсорбцию при 582 нм для оценки восстановления MV, отражающей поглощение гидроксильных радикалов.

Тест жизнеспособности клеток (CCK-8)

Клетки VSMC и 7721 (1,5 × 10⁴ клеток/ямку) посеяли в 96-ямочных пластинках и культивировали до ~80% конфлюэнтности. Через 24 ч среду заменяли на DMEM с 0–400 мкг/мл Ce-doped CNPs и инкубировали 24 ч. Реактив CCK-8 (10 мкл/ямку) добавляли и инкубировали 4 ч. Абсорбцию при 490 нм считывали на микропластинчатом ридере Synergy HT; жизнеспособность выражали в % от необработанного контроля.

Модель оксидативного стресса, индуцированного перекисью водорода

Для моделирования оксидативного повреждения клетки VSMC и 7721 воздействовали 30% H₂O₂ в концентрациях от 50 мкмоль/мл до 800 мкмоль/мл в течение 4 ч. После обработки жизнеспособность оценивали CCK-8 как описано выше, определяя LD₅₀ H₂O₂ (≈560 мкМ).

Апоптоз и живые/мертвые тесты

Клетки, предобработанные Ce-doped CNPs (0–400 мкг/мл), затем подвергали воздействию 560 мкМ H₂O₂ в течение 4 ч. Окраску живых/мертвых клеток (Calcein-AM/PI) проводили на клетках 7721 в 6-ямочных пластинках, флуоресцентные изображения получали на конфокальном микроскопе.

Цитометрический анализ апоптоза

После воздействия H₂O₂ клетки 7721 собирали, вымывали и окрашивали Annexin V-FITC и PI. Образцы анализировали на цитометре Beckman Coulter Epics XL MCL; проценты раннего (Annexin V⁺/PI⁻) и позднего (Annexin V⁺/PI⁺) апоптоза вычисляли с помощью FlowJo 7.6.2.

Статистический анализ

Данные представлены как среднее ± SEM. Применяли однофакторный ANOVA с пост-хок тестом Тьюки; p < 0,05 считалось статистически значимым.

Результаты и обсуждение

Синтез и морфология наночастиц

Биоминерализационная стратегия дала высокомонодисперсные Ce-doped CNPs, как показывает ТЭМ (Рис. 1а). Частицы демонстрировали полигональную, неагрегированную морфологию со средним диаметром 14,7 ± 0,8 нм (Рис. 1б). Водная дисперсия оставалась прозрачной несколько дней, указывая на отличную коллоидную стабильность — ключевое преимущество для биомедицинской доставки.

Поверхностная химия и степень окисления

XPS анализ подтвердил сосуществование Ce³⁺ (≈15,99%) и Ce⁴⁺, лежащее в основе редоактивной природы частиц (Рис. 2б). Спектр C 1s (Рис. 2в) показал пики при 285,0; 287,8 и 288,9 эВ, соответствующие C–C, C=O и C–O группам, а спектр O 1s (Рис. 2г) демонстрировал пики при 530,5 и 531,8 эВ, указывающие на Ce–O связи и поверхностные гидроксилы. ФТИР спектры (Рис. 3А) показали широкий O–H растяжения при 3400 см⁻¹ и нитрат-связанные пики при 1510 и 1450 см⁻¹, подтверждая наличие гидрофильных функциональных групп и успешное включение ионов церия.

XRD паттерны (Рис. 3Б) показали характерные пики гибридной углерод-цериевой решетки, с углерод-связанными пиками около 24,4° и рефлексиями церия при 30,3°, 35,23° и 43,2°, подтверждая успешную интеграцию Ce в углеродную структуру.

In vitro цитотоксичность

Тесты CCK-8 показали, что Ce-doped CNPs не снижают жизнеспособность клеток при концентрациях до 400 мкг/мл (Рис. 4а). Даже при максимальной дозе жизнеспособность оставалась выше 90%, подчеркивая отличную биосовместимость частиц.

Антиоксидантная эффективность

Перекись водорода при 560 мкМ была определена как LD₅₀ для VSMC и 7721 клеток. Предварительная обработка Ce-doped CNPs значительно повышала выживаемость дозависящим образом, при 400 мкг/мл восстанавливая жизнеспособность до ~88% (Рис. 4в). Окраска живые/мертвые (Рис. 5) показала выраженное снижение красных (PI-позитивных) клеток с увеличением дозы Ce-doped CNPs, подтверждая защиту от оксидативного апоптоза. Цитометрия (Рис. 6) количественно определила апоптоз: H₂O₂ وحدها индуцировала 46,4% позднего апоптоза, который снизился до 24,2; 20,0; 15,1 и 11,2% при 50, 100, 200 и 400 мкг/мл Ce-doped CNPs соответственно.

Заключение

Мы разработали зеленый, одностадийный синтез церий-содержащих углеродистых наночастиц, которые высокодисперсны, биосовместимы и проявляют мощное поглощение гидроксильных радикалов. Частицы сохраняют внутренний редоактивный цикл Ce³⁺/Ce⁴⁺, позволяя имитировать активность СОД и КАТ и защищать сосудистые и опухолевые клетки от H₂O₂-индуцированного оксидативного повреждения. Их дозависящая антиоксидантная эффективность и минимальная цитотоксичность позиционируют Ce-doped CNPs как привлекательных кандидатов для профилактики и лечения патологий, связанных с оксидативным стрессом.