Целевая доставка siRNA в рак яичника с фолат-функционализированными нанокомплексами GO/PEI

Аннотация

Генная терапия, включая малые интерференцирующие РНК (siRNA), становится перспективным методом лечения рака яичника. Однако недостаток эффективных таргетированных систем доставки сдерживает развитие данного направления. Синтезирован новый геновый вектор PEG-GO-PEI-FA на базе функционализированного оксида графена (GO), где фолиевую кислоту (FA) используют для специфической связи с фолат-рецептором (FR), сверхэкспрессируемым в раке яичника. Нанокомплексы охарактеризованы ДЛС, АСМ и ФТИР-спектроскопией. Оценены способность к конденсации siRNA и стабильность (агарозная гель-электрофорез), эффективность клеточного захвата и эндосомальный побег (конфокальная микроскопия), био安全性 и цитотоксичность (CCK-8). Размер нанокомплексов 216,1±2,5 нм, проявляют мягкую цитотоксичность. Обеспечивают высокий клеточный захват, быстрый эндосомальный побег и высвобождение гена. PEG-GO-PEI-FA/siRNA эффективно подавляет рост клеток рака яичника. Система представляет перспективную стратегию доставки siRNA для FR-позитивного рака яичника и подобных опухолей.

Введение

Рак яичника — главная гинекологическая причина смертности в мире, часто диагностируется поздно и имеет плохую прогноз. Традиционная химиотерапия страдает от неспецифической распределённости, низкой биодоступности, быстрой клиренса и плохой растворимости. Генная терапия изучается как потенциальный подход к лечению генетических заболеваний, включая рак. Главное препятствие — отсутствие безопасного, высокоэффективного и селективного вектора доставки. Вирусные векторы имеют высокую эффективность трансфекции, но вызывают иммунные реакции и риск рекомбинации. Невирусные векторы обладают большой грузоподъёмностью, низкой иммуногенностью и структурной гибкостью. Нанотехнологии открыли множество наночастиц как потенциальные векторы доставки генов. Предложен новый невирусный вектор PEG-GO-PEI-FA для эффективной доставки в опухолевые ткани.

Оксид графена (GO) — производный графита, полученный многоступенчатой оксидацией, ультразвуком и очисткой. На поверхности GO присутствуют эпоксидные, гидроксильные и карбоксильные группы. Кислородсодержащие группы обеспечивают отличную биосовместимость, стабильную суспензию в воде и органических растворителях, облегчают химические модификации. GO широко применяют в фотوترмической терапии, доставке лекарств и генов, биосенсорах. Полиэтиленгликоль (PEG) — безопасный, нетоксичный, биоразлагаемый материал, одобренный FDA как гидрофильный носитель. Функционализация GO с PEG улучшает стабильность в физиологических условиях, удлиняет циркуляцию в организме и фармакокинетику для лучшей таргетированности. Полиэтиленимин (PEI) — «золотой стандарт» невирусных векторов благодаря высокой эффективности трансфекции, но проявляет сильную цитотоксичность и плохую биосовместимость. Гraftирование PEI на поверхность GO существенно снижает цитотоксичность. Фолат-рецептор гиперекспрессируется на различных раковых клетках, особенно в раке яичника до и после химиотерапии. Для таргетированной доставки фолиевую кислоту ковалентно связывают с GO.

Цель работы — создать новую таргетированную GO-систему доставки генов для повышения эффективности siRNA-терапии рака яичника. Полученный положительно заряженный PEG-GO-PEI-FA загружают siRNA. Анализируют успешный синтез, характеристику, клеточный захват и in vitro антиопухолевой эффект. Оценивают безопасность системы.

Материалы и методы

Материалы

GO получен от Suzhou Carbon Fung Graphene Technology Co. Ltd. Фолиевая кислота (FA), N-гидрокси숙цинымид (NHS), флуоресцеин изотиоцианат (FITC) — Sigma Aldrich. Ветвистый PEI 25K, PEG (ММ 2000), агароза, EDC·HCl — Adama Reagent. PBS, DPBS, остальные реактивы — Sinopharm. Все реактивы аналитического чистоты. RPMI-1640, FBS, трипсин, 20×TAE — Thermo Fisher. CCK-8 — Shanghai Yisheng. LysoTracker Red, параформальдегид, DAPI, Lipofectamine 2000 — Invitrogen. Dil-зонд — Beyotime. siRNA против PLK1 — Shanghai GenePharma.

Синтез PEG-GO-PEI-FA

Синтез по схеме на рис. S2(A). 10 мл водной суспензии GO (1000 мкг/мл) ультразвуковые обрабатывали 2 ч (50 Вт). Добавляли 1 мл EDC·HCl (5000 мкг/мл) и NHS (5000 мкг/мл), ультразвук 30 мин (100 Вт), затем PEG (10 мг), ультразвук 30 мин, магнитное перемешивание 6 ч при 0 °C. Диализ 24 ч (MWCO 3500 Da) для удаления нереагировавших реагентов — получение GO-PEG. Аналогично графтилировали PEI 25K (2 мл, 5000 мкг/мл) с EDC/NHS, ультразвук, перемешивание 6 ч при 0 °C, диализ 24 ч — PEG-GO-PEI. Финальный этап: конъюгация FA (10 мг) с EDC/NHS, ультразвук 30 мин, перемешивание 12 ч при 0 °C, диализ 48 ч — PEG-GO-PEI-FA. Раствор сушили вакуумной сублимацией (Biosafer-10D).

Характеризация

Зета-потенциал и размер частиц — ДЛС (Malvern Zetasizer Nano ZS). Морфология — АСМ (MuLtimode Nanoscope IIIa). ФТИР-спектры — Thermo Nicolet 6700 (KBr, 400–4000 см⁻¹). UV-Vis спектры — EV300. Раман-спектры — Senterra R200-L (532 нм).

In vitro биобезопасность (CCK-8)

Клетки SKOV3 (человеческий рак яичника) от Keygen. Культура: RPMI-1640 + 10% FBS, пенициллин/стрептомицин, 37 °C, 5% CO₂. Цитоксичность материалов на SKOV3 методом CCK-8. Посев 6×10³ клеток/колодка в 100 мкл среды, инкубация 12 ч. Добавление GO, GO-PEG, PEG-GO-PEI, PEG-GO-PEI-FA в концентрациях 10–1000 мкг/мл на 12 ч. Также инкубация 4–24 ч при 100 мкг/мл. Добавление 10 мкл CCK-8, инкубация 3 ч, измерение абсорбции при 450 нм. Три повторения. Жизнеспособность = (Abs_образца – Abs_фон)/(Abs_контроля – Abs_фон) × 100%.

Агарозный гель-ретардационный анализ

1% агарозный гель в 1×TAE с этидиумбромидом (0,5 мкг/мл). Смеси PEG-GO-PEI, PEG-GO-PEI-FA с siRNA при разных массовых соотношениях загружали в колодки. Электрофорез 110 В, 40 мА, 60 мин. Визуализация УФ-образателем.

Изучение клеточного захвата

Нанокомплексы маркировали FITC (прибл. 1 мг/мл, 2 мл + 0,2 мл FITC 26 мМ в DMSO, перемешиваниеovernight, диализ MWCO 5000, лиофилизация). Клетки SKOV3 в 6-колодчатых пластинках (2×10⁵/колодка) инкубировали 12 ч. Замену среды на безсывороточную. Обработка разными нанокомплексами/FITC. Контроль — без нанокомплексов, параллельный контроль — PEI 25K. Инкубация 4 ч (37 °C, 5% CO₂). Промывка холодным DPBS. Маркировка ядер DAPI (20 мкл), цитоплазматической мембраны Dil (5 мкл), 20 мин 37 °C в темноте. Промывка, фиксация препаратов Permount. Регистрация флуоресценции КЛСМ.

Эндосомальный побег и проникновение в ядро

Клетки SKOV3 в 12-колодчатых пластинках (1×10⁵/колодка) 12 ч. Замена среды на безсывороточную. Нанокомплексы (100 мкг/мл), помеченные FITC, 1 мл/колодка. Через 6 ч промывка, инкубация с LysoTracker Red (5 мкг/мл, 50 мкл/колодка) 15 мин. Промывка, DAPI (20 мкл) 20 мин при 4 °C в темноте. Промывка, фиксация 4% параформальдегидом 15 мин. Препараты на стеклах, КЛСМ.

Цитоингибиторный анализ

Эффект PEG-GO-PEI/siRNA и PEG-GO-PEI-FA/siRNA методом CCK-8 на SKOV3. Посев 6×10³/колодка, 12 ч. Добавление носителей 10–500 мкг/мл на 12 и 24 ч. Затем комплексы с siRNA при 100 мкг/мл на 4–48 ч. Lipofectamine 2000/siRNA и необработанные — контроль. CCK-8, 3 ч, 450 нм. Три повторения. Ингибиторная активность = 1 – (Abs_образца – Abs_фон)/(Abs_контроля – Abs_фон) × 100%.

Статистика

Три повторения, SPSS 17.0. ANOVA для многогрупповых сравнений, t-тьюдента для парных. Данные как среднее ± SD, значимость p < 0,05.

Результаты и обсуждение

Синтез PEG-GO-PEI-FA

Экспрессия FR проанализирована в раковых линейках (база CCLE) и тканях яичника (GEPIA2) — соответствует литературе (рис. S1). FA выбрана как таргетирующий лиганд.

GO содержит множество кислородсодержащих групп: карбоксил по краям, гидроксил и эпоксиды на базовой плоскости. Для получения нано-GO (NGO) GO ультразвуково обрабатывали 2 ч (50 Вт), затем ковалентно связывали PEG/PEI/FA через химию EDC/NHS (рис. S2А). Схема обработки PEG-GO-PEI-FA/siRNA на рис. S2(B). Химическая конъюгация анализировалась ФТИР (рис. 1а). В GO найдены OH (3425 см⁻¹), C=O (1719 см⁻¹), C–H (1350 см⁻¹) — подтверждают гидроксил и карбоксил. После реакции с PEG появляется полоса CH (2885 см⁻¹) — PEG ковалентно присоединен (эффективность ~6%). После реакций с PEI и FA наблюдаются полосы NH (1590 см⁻¹) и C–N (1420 см⁻¹) — этерификация. Успешный синтез PEG-GO-PEI-FA подтверждён.

UV-Vis спектры (рис. 1b): GO — пик 223 нм; FA — 275 нм; GO-PEG — сглаженная кривая (PEG сгладил пик GO); PEG-GO-PEI — пик 219 нм (PEI присоединился); PEG-GO-PEI-FA — пики 219 и 275 нм (FA присоединился). Дополнительное подтверждение синтеза.

Характеризация PEG-GO-PEI-FA

Таблица 1: размер частиц и зета-потенциал. Размер постепенно растёт до 218,4 нм при последовательном графтилировании PEG, PEI, FA. Зета-потенциал меняется с –16,5 на +17,5 мВ при присоединении PEI — способствует адсорбции отрицательно заряженных ДНК/РНК и клеточному захвату. Зета PEG-GO-PEI-FA и PEG-GO-PEI-FA/siRNA: +14,7 и +14,5 мВ — ниже из-за отрицательного заряда FA и siRNA. Это указывает на адсорбцию на клеточную поверхность зарядовым взаимодействием и рецептор-мединированную эндоцитоз.

Морфология и размер АСМ и ДЛС (рис. 2а, b): GO — гладкие листы 192,1 нм. PEG-GO-PEI-FA — 216,1 нм, на поверхности многочисленные выступы (иммобилизация декораций на GO). Высота выше из-за присоединения PEG, PEI, FA на обеих плоскостях.

Раман-спектроскопия (рис. 2c): GO — G-полоса 1600 см⁻¹, D-полоса 1354 см⁻¹, ID/IG = 1,0385 (часть sp² нарушена, образованы OH и COOH). GO-PEG и PEG-GO-PEI: G 1595, D 1352 см⁻¹, ID/IG = 0,7737 и 0,5238. Постепенное снижение ID/IG подтверждает графтилирование PEG и PEI на поверхности GO.

In vitro биобезопасность функционализированных NGO

Высокий положительный заряд обеспечивает конденсацию генов, но вызывает цитотоксичность. CCK-8 на SKOV3 с свободными нанокомплексами (10–1000 мкг/мл, 4, 8, 12, 24 ч). На рис. S3: высокая жизнеспособность даже при 1000 мкг/мл и 24 ч. Цитоксичность дозозависимая и временнозависимая (жизнеспособность ≥84,38% при 1000 мкг/мл, ≥94,21% при 24 ч). Нанокомплексы проявляют пренебрежимую цитотоксичность — биосовместимые геновые векторы.

Анализ комплексации с siRNA

Свободные РНК с отрицательным зарядом трудно проникают в клетки. Катионные полимеры решают проблему. Загрузка siRNA на PEG-GO-PEI-FA — смешивание в водном растворе. Зета PEG-GO-PEI-FA +14,7 мВ — электростатическая адсорбция siRNA. Агарозный гель-электрофорез (рис. 3): PEG-GO-PEI конденсирует siRNA при соотношении 10:1; PEG-GO-PEI-FA — полная ретардация при 20:1. PEG-GO-PEI-FA защищает siRNA от деградации, но требует больше носителя для хорошей связывающей способности (связано с низким зета-потенциалом). Оба носителя обладают достаточной доставкой, особенно PEG-GO-PEI-FA — перспективный безопасный вектор.

Клеточный захват

Ключевой вопрос — специфическое таргетирование опухолей. FITC-маркировка для внутриклеточной визуализации. Ядра — DAPI (синий), цитоплазматическая мембрана — Dil (красный). Рис. 4: контроль и PEG-GO-PEI — нет зелёной флуоресценции у ядер и мембраны (не проникают). PEI 25K и PEG-GO-PEI-FA/siRNA — зелёный сигнал вокруг ядер — проникание в клетки. PEG-GO-PEI-FA — самый активный захват, обусловлен специфической связью FA с FR на SKOV3. FA критичен для эффективного рецептор-мединированного эндоцитоза. Ковалентная амидная связь не мешает связыванию FA с рецептором.

Эндосомальный побег

siRNA должен сбегать из эндосом/лизосом, иначе деградирует или выводится. Оценка побега КЛСМ. PEI 25K известен «эффектом протонной губки» — контроль. Нанокомплексы с FITC. Жёлтый сигнал (FITC зелёный + LysoTracker красный) = локализация в лизосомах. PEI 25K — жёлтый через 4 ч, остальные материалы — через 2 ч (войшли в клетки). Бирюзовый сигнал (FITC зелёный + DAPI синий) = побег в ядро. Рис. 5а: PEI/siRNA — зелёный накопляется в ядрах, яркий бирюзовый через 8 ч (побег). PEG-GO-PEI-FA и PEG-GO-PEI-FA/siRNA — слабый зелёный в ядрах уже через 2 ч, накопление со временем, яркий бирюзовый через 4 ч (рис. 5b, c) — ранний побег. PEG-GO-PEI-FA/siRNA обладает отличной способностью к эндосомальному побегу и эффективной гено-трансфекции in vitro.

Цитоингибиторная оценка PEG-GO-PEI-FA/siRNA

Терапевтический эффект CCK-8 на SKOV3 in vitro. Рис. 6а: PEG-GO-PEI-FA при 10–100 мкг/мл, 12 и 24 ч — нет значимого влияния на выживаемость, даже >100 мкг/мл — выживаемость >80%. Выбрали 100 мкг/мл для дальнейшего исследования. PEG-GO-PEI/siRNA и Lipo2000/siRNA — слабая цитотоксичность (ингибиция <20%). PEG-GO-PEI-FA/siRNA — значительная ингибиторная активность против SKOV3. Ингибиция временнозависима (рис. 6b). PEG-GO-PEI-FA/siRNA — лучшая ингибиторная активность, идеальный наноноситель для генной доставки.

Заключение

Успешно синтезирован новый геновый вектор PEG-GO-PEI-FA. Ненаценный сам по себе и обладающий отличной биосовместимостью, он перспективен как безопасный и эффективный вектор. Нанокомплексы PEG-GO-PEI-FA/siRNA демонстрируют выдающиеся физико-химические свойства для таргетированной доставки. Эффективно проникают в клетки SKOV3 и покидают лизосомы. Цитоксичность показывает хорошую ингибиторную активность против клеток рака яичника во временнозависимом режиме, превосходит другие группы. PEG-GO-PEI-FA даёт надежду как вектор для таргетированной генной доставки и более эффективной стратегии лечения рака яичника.

Доступность данных и материалов

Все данные, полученные или проанализированные в ходе исследования, включены в опубликованную статью и её дополнительные файлы.

Аббревиатуры

АСМ:

Атомно-силовая микроскопия

CCK-8:

Набор для колориметрического анализа пролиферации клеток

CCLE:

Энциклопедия раковых клеточных линий

КЛСМ:

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

DAPI:

4′-6-Диамидино-2-фенилиндол

ДЛС:

Динамическое рассеяние света

DMSO:

Диметилсульфоксид

DPBS:

Фосфатно-буферная солеваная среда Дюльбекко

EB:

Этидиумбромид

EDC·HCl:

1-(3-Диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид гидрохлорид

FA:

Фолиевая кислота

FBS:

Сыворотка фетового теленка

FITC:

Флуоресцеин изотиоцианат

ФТИР:

Фурье-спектроскопия в ИК

FR:

Фолат-рецептор

GEPIA:

Интерактивный анализ профиля геновой экспрессии

GO:

Оксид графена

MWCO:

Молекулярно-массовый отсев

NGO:

Наноразмерный оксид графена

NHS:

N-гидроксисукцинымид

NPs:

Наночастицы

PBS:

Фосфатно-буферный раствор

PDI:

Индекс полидисперсности

PEG:

Полиэтиленгликоль

PEI:

Полиэтиленимин

siRNA:

Малая интерференцирующая РНК