Углеродные точки из обуглённой коры обёлочника китайского защищают почки от островой почечной недостаточности, индуцируемой ядом щитомордника

Аннотация

Фон

Как новозеландный наноматериал, углеродные точки (УТ) привлекли огромное внимание для биомедицинских приложений. Однако мало информации доступно о их биологической активности по ингибированию острой почечной недостаточности (ОПН), индуцируемой змеиным ядом.

Методы

В этом исследовании сообщается о разработке зелёного одноступенчатого пиролитического процесса для синтеза УТ с использованием коры обёлочника китайского (КОК) как единственного прекурсора, и их потенциальное применение как защитного средства против ОПН, индуцируемой ядом Deinagkistrodon acutus (D. acutus), исследуется впервые. Модель ОПН устанавливали введением яда D. acutus в брюшную полость мышей, и потенциальные защитные эффекты УТ обуглённой коры обёлочника китайского (УТ-ОКОК) на почечные аномалии, включая дисфункцию, воспалительные реакции, тканевое повреждение и тромбоцитопению, в шести временных точках (1, 3 и 12 ч, и 1, 2 и 5 дней) исследовали.

Результаты

Эти результаты продемонстрировали, что УТ-ОКОК значимо ингибировали почечную дисфункцию (снизили концентрации сывороточного креатинина (СК), мочевины в крови (МКС), общего белка в моче (ОБМ) и микроальбуминурии (МА)) и продукцию хемоаттрактанта (моноцитарного хемоаттрактантного белка 1 (MCP-1)), про-воспалительных цитокинов (интерлейкин (IL)-1β) и анти-воспалительного цитокина (IL-10) в ответ на внутрибрюшинное введение яда D. acutus. Благоприятный эффект УТ-ОКОК на отравленных мышей был подобен тому, на изменение почечной гистологии и тромбоцитопению.

Заключения

Эти результаты продемонстрировали замечательные защитные эффекты УТ-ОКОК против ОПН, индуцируемой ядом D. acutus, что не только расширит биомедицинские приложения УТ, но также предоставит потенциальную мишень для разработки новых терапевтических препаратов для ОПН, индуцируемой укусом D. acutus.

Введение

Deinagkistrodon acutus (D. acutus), относящийся к семейству Гадюковые, считается одной из самых опасных наземных змей в Китае. Отравление D. acutus ассоциировано с рядом симптомов, таких как кровотечение, тромбоцитопения и возможное прямое повреждение почки. Острая почечная недостаточность (ОПН) — самая серьёзная системная последствие и частое осложнение отравления D. acutus, которое прямо ведёт к стойкой почечной дисфункции и высокой заболеваемости. Текущее местное лечение включает использование конского гипериммунного антидотного сывороточного препарата как антидота. Однако его эффективность ограничена в нейтрализации локального тканевого повреждения, особенно при возникновении ОПН, и имеет несколько неудовлетворительных эффектов, таких как анафилактические и пирогенные реакции. Кроме того, относительно высокая стоимость и низкая стабильность антидотного сывороточного препарата также способствуют неудовлетворительному лечению людей, укушенных D. acutus, особенно в дикой природе или сельских районах. Поэтому существует острая необходимость в эффективных, безопасных и доступных комплементарных лекарствах для лечения ОПН, индуцируемой ядом D. acutus.

Углеродные точки (УТ), новый класс углеродных наноматериалов с размером < 10 нм, были случайно открыты при разделении и очистке одностенок углеродных нанотрубок в 2004 году и привлекли большой интерес за последнее десятилетие благодаря их замечательным новым свойствам, таким как высокая биосовместимость, низкая токсичность, высокая водорастворимость и доступные сырьё. Появление УТ способствовало исследованиям разработки различных «умных» наносистем, в основном включающих биоимиджинг, биомедицину, доставку лекарств и фотокатализ.

Особенно, разработка УТ с врождённым биоактивным потенциалом предоставляет множество стратегий для открытия нового поколения препаратов для эффективного контроля или лечения некоторых заболеваний благодаря вышеупомянутым преимуществам. В нескольких биоактивностях, таких как антибактериальная для лечения бактериального кератита, гемостатическая, пероксидаза-подобная, антираковая, антивирусная и противовоспалительная активности, сообщалось. Эти эффекты привлекли внимание учёных к изучению дополнительных фармацевтических и биомедицинских применений УТ. Особенно, облегчающая активность УТ, полученных из обуглённой колючки шизонепеты, на яд D. acutus-индуцированное кровотечение предоставила новую перспективу на исследование благоприятных эффектов УТ на ОПН, индуцируемую укусом D. acutus, которая оставалась малоизвестной доныне.

Углеродные точки обуглённой коры обёлочника китайского (УТ-ОКОК) синтезируются прямой пиролизом КОК (традиционного китайского лекарства, используемого > 1000 лет) с использованием одноступенчатого пиролитического лечения. УТ-ОКОК — гипотоксичные УТ диаметром от 1.2 до 4.8 нм. Сообщалось, что УТ-ОКОК обладают замечательными гемостатическими эффектами, что не только расширило биомедицинские применения УТ, но также положило начало эллицидированию гемостатической материальной базы ОКОК. Особенно, ОКОК, традиционное китайское лекарство, приготовленное углем обработкой, впервые записано в «Тайпин святой предписаниях для всеобщего спасения» (978–992 гг. н.э., в Китае). Профиль безопасности и удовлетворительная терапевтическая эффективность ОКОК, такие как гемостаз и противовоспалительное действие, поощряли его продолженное клиническое применение более 1000 лет, что было признано в «Фармакопее Народной Республики Китая» (ФНРК, 2015). Однако изучение дополнительных базовых биоактивностей УТ-ОКОК было вызовом. Особенно, мало информации об ингибировании ОПН, индуцируемой D. acutus отравлением.

Кроме того, укус змеи сообщался как возможно угрожающий почечной физиологии напрямую через нефротоксичные компоненты или активацию или модуляцию иммунных и воспалительных медиаторов. Эти эффекты в основном на биомедицинских параметрах (сывороточный креатинин (СК), мочевина в крови (МКС), общий белок в моче (ОБМ) и концентрация микроальбуминурии (МА)), воспалительных цитокинах (интерлейкин (IL)-1β), анти-воспалительном цитокине (IL-10) и моноцитарном хемоаттрактантном белке 1 (MCP-1), изменении почечной гистологии и количестве тромбоцитов (ТР). В настоящем исследовании мы синтезировали УТ-ОКОК, используя зелёный одноступенчатый пиролитический метод и, впервые, исследовали их защитные эффекты против развития этих аномалий в ОПН, индуцируемой внутрибрюшинным введением мышам яда D. acutus.

Материалы и методы

Химикаты

Материал КОК закупали в Beijing Qiancao Herbal Pieces Co., Ltd. (Пекин, Китай), и ОКОК готовили в нашей лаборатории. Диализационные мембраны с молекулярным весом 1000 Да покупали в Beijing Ruida Henghui Technology Development Co., Ltd. (Пекин, Китай). Набор для подсчёта клеток (CCK)-8 закупали в Dojindo Molecular Technologies, Inc. (Кумамото, Япония). Лиофилизированный змеиный яд D. acutus предоставляли An Ren Snake Farm (Юйцзянь округ, Иньтань, Цзянси, Китай) для экспериментального использования. Другие аналитические химические реактивы получали от Sinopharm Chemical Reagents Beijing (Пекин, Китай). Мышиные MCP-1, IL-10 и IL-1β ELISA-наборы закупали в Cloud-Clone Corp. (Ухань, Китай). Все эксперименты выполняли с использованием деионизированной воды (ДВ).

Животные

Управление животными и исследовательские протоколы поддерживались и одобрялись Институциональным комитетом этики животных экспериментов Пекинского университета китайской медицины. Самцы куньмингских мышей (вес 30.0 ± 2.0 г) закупали в Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., с сертификатом соответствия лабораторных животных, и содержали в клетках при постоянной температуре и влажности на 12-часовом цикле свет/тьма с ad libitum доступом к еде и воде.

Подготовка раствора яда

Лиофилизированный яд растворяли в физрастворе с мягким перемешиванием 20 мин (конечная концентрация: 5 мг/мл) и хранили при −20 °C до использования.

Подготовка УТ-ОКОК

ОКОК готовили одноступенчатым пиролитическим методом с КОК как единственным прекурсором согласно предыдущим методам. Кратко, образцы КОК помещали в отдельные фарфоровые тигли и нагревали 1 ч при 350 °C в предразогретой печи. После охлаждения до 30 °C полученные однородные чёрные остатки помолали в тонкий порошок и варили дважды в воде оба при 100 °C по 1 ч каждый раз. Затем раствор собирали предварительной фильтрацией суспензии через 0.22 мкм целлюлозо-ацетатную мембрану. Неуглеродные примеси удаляли диализом против ДВ 72 ч (удерживаемый молекулярный вес: 1000 Да). Раствор УТ-ОКОК концентрировали и хранили при 4 °C до использования. Блок-схема на рис. 1 иллюстрирует вышеуказанный процесс.

Иллюстрация процесса формирования углеродных точек (УТ) из коры обёлочника китайского (КОК) пиролитическим лечением.

Характеризация УТ-ОКОК

Морфологию УТ изучали с использованием передаточного электронного микроскопа (TEM, JEM-2100 электрон, JEOL, Япония) с электронной энергией 200 кВ. Структурные детали изучали высокорезолюционным TEM (HRTEM) с использованием микроскопа Tecnai G2 20 (FEI, США). Ультрафиолетово-видимый (UV-Vis) спектр и флуоресцентные свойства записывали и измеряли с использованием UV-Vis (CECIL, Кембридж, Великобритания) и флуоресцентной (F-4500, Токио, Япония) спектроскопии соответственно. Фурье-преобразование инфракрасной (FTIR) спектроскопия использовалась для анализа поверхностных функциональных групп в спектральном окне между 400 и 4000 см⁻¹.

Цитотоксичность тесты

Клеточные линии человеческих гепатоцитов L02 и эмбриональных почек 293 T использовали для оценки потенциальной цитотоксичности УТ-ОКОК с использованием CCK-8 анализа. L02 клетки культивировали в среде RPMI 1640 с 10% фотальной говяжьей сывороткой (ФГС), в то время как 293 T клетки растили в модифицированной среде Дюльбекко (DMEM) с высокой глюкозой, содержащей 10% ФГС. Обе клеточные линии инкубировали при 37 °C в увлажнённой атмосфере 5% CO₂.

L02 и 293 T клетки посеяли при плотности 2.0 × 10⁴ клеток/колодку в 96-колончатых пластинках и культивировали при 37 °C в увлажнённой атмосфере 5% CO₂ 24 ч. Затем оба типа клеток обрабатывали 100 мкл различных концентраций (5000, 2500, 1250, 625, 156, 78, 39 и 19.5 мкг/мл) растворов УТ-ОКОК в безсывороточной среде и инкубировали ещё 24 ч. После этого среду, содержащую УТ-ОКОК, удаляли и клетки промывали фосфатно-буферизованным раствором (ПБС) дважды. Цитотоксичность определяли чтением пластинки при 450 нм сразу после добавления 10 мкл реагента CCK-8 и инкубации 4 ч при 37 °C.

D. acutus яд-индуцированная ОПН и лечение

D. acutus яд-индуцированная модель ОПН

Модель ОПН у мышей устанавливали внутрибрюшинным введением змеиного яда D. acutus. Мыши случайно делили на следующие пять групп по 36 животных каждая: контроль; модель; и высоко-, средне- и низкодозные группы лечения УТ-ОКОК. Группа модели получала яд D. acutus при 1 мг/кг (0.15 мг/мл, 0.2 мл) массы тела и 0.5 мл физраствора внутрибрюшинно, в то время как высоко-, средне- и низкодозные группы лечения УТ-ОКОК получали эквивалентный объём змеиного яда и экстракт УТ-ОКОК в дозах 8.0, 4.0 и 2.0 мг/кг соответственно. Мыши, получившие внутрибрюшинно только физраствор (ФР), служили контролем. Шесть мышей из каждой группы жертвовали 1, 3 и 12 ч после введения ФР, яда D. acutus и УТ-ОКОК по описанному выше расписанию, в то время как мыши, жертвованные на 1, 2 и 5 день, непрерывно получали ФР, змеиный яд D. acutus и УТ-ОКОК дважды в день.

Анализ концентраций ОБМ и МА

После введения соответствующих лечений, животные в контрольной, модельной и УТ-ОКОК-обработанных (4.0 мг/кг) группах сразу помещали в соответствующие метаболические клетки для сбора мочи до окончания инкубационного периода (24 ч). Концентрации ОБМ и МА анализировали автоматическим биохимическим анализатором.

Анализ биомаркеров почечной функции

Почечная функция оценивали измерением уровней СК и МКС. Перед эвтаназией мышей, кровь отбирали из заднеглазной вены и затем помещали в пластиковые пробирки минимум на 4 ч при 4 °C. Сыворотку получали центрифугированием 750×g 15 мин, и уровни МКС и СК анализировали автоматическим биохимическим анализатором.

Детекция уровней воспалительных цитокинов

Правые почки мышей удаляли, быстро заморожали в сухом льду и хранили при −80 °C до использования в следующих процедурах. Тканевые образцы (100 мг) из разных групп гомогенизировали с ПБС на льду и затем центрифугировали 750×g 15 мин. Супернатанты собирали для определения уровней MCP-1, IL-10 и IL-1β с использованием соответствующих ELISA-наборов согласно инструкции производителя.

Почечная гистология

Образцы левой почки мышей фиксировали в 10% нейтральном буферизованном формалине при 4 °C более 48 ч, дегидратировали, парафинизировали, резали на срезы и затем окрашивали гемоксилином и эозином (Г&Е). Морфологические изменения сравнивали среди контрольной, модельной и УТ-ОКОК-обработанных групп.

Тромбоцитопеническая активность

ТР выполняли на крови, отобранной у мышей из заднеглазной вены, и детектировали с использованием автоматизированного гематологического анализатора (XS-800i, Sysmex Corporation Co., Ltd., Кобе, Япония).

Статистический анализ

Статистический анализ выполняли с использованием Statistical Package for the Social Sciences (SPSS, версия 13.0). Нормально распределённые данные и однородные дисперсии выражали как среднее ± стандартное отклонение (SD). Односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим тестом наименьшей значимой разницы (LSD) использовался для множественных сравнений. P < 0.05 считался статистически значимым.

Результаты

Характеризация УТ-ОКОК

TEM использовали для прямого наблюдения морфологии и распределения размеров УТ-ОКОК (рис. 2a, c, d). Подготовленные УТ были сферическими и однородными по размеру, большинство при 2.84 ± 0.89 нм без выраженных агрегаций. HRTEM изображение показало решёточные фриджи (0.24 нм) УТ, соответствующие графитному углероду, как показано на рис. 2b.

a и c Изображения передаточной электронной микроскопии (TEM) углеродных точек обуглённой коры обёлочника китайского (УТ-ОКОК), b Высокорезолюционное TEM изображение УТ-ОКОК, d Распределение размеров УТ-ОКОК.

Как изображено на рис. 3a, УТ демонстрировали выраженную синюю флуоресценцию с пиковым максимумом при 445 нм после возбуждения 370 нм. Соответственно, оптическая информация на УТ-ОКОК, показанная в UV-Vis спектре, демонстрировала сильный пик поглощения при 265 нм, соответствующий π-π* переходу сопряжённых органических молекул на поверхностях УТ (рис. 3b).

Оптические свойства углеродных точек обуглённой коры обёлочника китайского (УТ-ОКОК). a Флуоресцентные спектры, b ультрафиолетово-видимые спектры (UV-Vis) и c Фурье-преобразование инфракрасного спектра (FTIR).

Кроме того, функциональные группы сформулированных УТ идентифицировали детально на основе FTIR спектра, как изображено на рис. 3c. Пик при 3433 см⁻¹ был назначен поглощающим полосам растяжения O–H и N–H, в то время как растяжение C–H появлялось при 2923 см⁻¹ и 2853 см⁻¹. Дополнительно, пик поглощения при 1624 см⁻¹ указывал на наличие C=O. C–O–C связи наблюдались при 1109 см⁻¹, и пик при 1400 см⁻¹ атрибутировался растяжению C–N. Эти выводы были согласованы с предыдущими отчётами.

In vitro цитотоксичность

Для оценки цитотоксичности, L02 и 293 T клетки экспонировали различным концентрациям УТ-ОКОК 24 ч и живучесть изучали CCK-8 анализом. Как проиллюстрировано на рис. 4a, живучесть L02 клеток, обработанных УТ-ОКОК, была > 85% по сравнению с контрольными клетками, даже при концентрации до 5 мг/мл. Аналогично, УТ-ОКОК не влияли на рост 293 T клеток при концентрациях до примерно 2500 мкг/мл (рис. 4b). Эти результаты указывали на то, что УТ-ОКОК демонстрировали низкую цитотоксичность.

Живучесть клеток CCK-8 анализом (a) L02 клеток и (b) 293 T клеток, инкубированных с УТ-ОКОК 4 ч.

Эффект УТ-ОКОК на концентрации ОБМ и МА

По сравнению с уровнем ОБМ в контрольной группе (0.98 ± 0.38 мг/л), уровни ОБМ значимо увеличились в группе, обработанной ядом D. acutus (3.08 ± 0.92 мг/л, P < 0.01) и группе УТ-ОКОК (2.36 ± 0.83 мг/л, P < 0.05) (рис. 5a). Более того, уровень ОБМ снизился после лечения УТ-ОКОК по сравнению с уровнями после введения яда (P < 0.05). Кроме того, уровень МА очевидно увеличился через 24 ч после внутрибрюшинного введения яда D. acutus (17.78 ± 5.96 мг/л, P < 0.01) по сравнению с контрольной группой (2.02 ± 0.91 мг/л). Напротив, УТ-ОКОК-обработанные мыши показали тенденцию к снижению уровня МА (14.25 ± 4.16 мг/л, рис. 5b).

Эффекты углеродных точек обуглённой коры обёлочника китайского (УТ-ОКОК) на общий белок в моче (ОБМ) и микроальбуминурию (МА) в моче. a ОБМ и b МА. Мыши лечили физраствором (ФР), ядом D.acutus (Dav, 1 мг/кг) и УТ-ОКОК (4 мг/кг) + Dav (1 мг/кг). Данные представлены как среднее ± SD шести животных каждой группы. *p < 0.05 и **p < 0.01 по сравнению с контрольной группой, обработанной ФР. ^#p < 0.05 по сравнению с группой Dav.

УТ-ОКОК облегчили почечную дисфункцию у мышей с ОПН, индуцированной ядом D. acutus

Почечная функция оценивали измерением уровней МКС и СК, показанных на рис. 6 и 7. Мыши, обработанные ядом D. acutus, имели значимо более высокие уровни МКС (12.07 ± 1.00 ммоль/л [1 день], P < 0.01; 11.43 ± 1.37 ммоль/л [2 дня], P < 0.01; 14.83 ± 2.53 ммоль/л [5 дней], P < 0.01) и СК (12.83 ± 1.43 мкмоль/л [1 день], P < 0.01; 13.48 ± 2.26 мкмоль/л [2 дня]; P < 0.01. 13.80 ± 1.90 мкмоль/л [5 дней], P < 0.01) чем мыши, обработанные ФР (МКС: 8.95 ± 1.04 [1 день], 9.53 ± 1.40 [2 дня], и 9.07 ± 1.57 [5 дней] ммоль/л; СК: 9.40 ± 0.89 [1 день], 10.27 ± 2.04 [2 дня], и 9.85 ± 1.99 [5 дней] мкмоль/л) с 1 по 5 день (рис. 6a и 7a). Особенно, по сравнению с модельной группой, лечение низкой дозой УТ-ОКОК значимо ингибировало увеличение уровней СК (9.77 ± 0.79 мкмоль/мл, P < 0.01) и МКС (10.50 ± 1.38 ммоль/л, P < 0.05), в то время как высокие (9.62 ± 1.87 мкмоль/мл, P < 0.01) и средние (10.75 ± 1.48 мкмоль/мл, P < 0.05) дозы ингибировали увеличение СК (рис. 7b), но не МКС (рис. 6b), индуцированное ядом D. acutus на 1-й день. Уровни СК (рис. 7c) высоко-, средне- и низкодозных групп УТ-ОКОК снизились (10.97 ± 0.88, 10.42 ± 1.75 и 10.68 ± 1.41 мкмоль/мл соответственно; P < 0.05) по сравнению с модельной группой на 2-й день. Более того, по сравнению с модельной группой, уровни МКС значимо снизились в высокой (9.57 ± 0.52 ммоль/л, P < 0.01) и низкой дозе (10.72 ± 2.04 ммоль/л, P < 0.05) групп УТ-ОКОК, но не в средней дозе (рис. 6c) на 2-й день. Как показано на рис. 6d и 7d, ингибирующие эффекты наблюдались на уровнях обоих индексов при высокой (12.28 ± 1.65 ммоль/л, P < 0.01 (МКС); 11.38 ± 1.80 мкмоль/мл, P < 0.05 (СК) соответственно) и средней (12.40 ± 1.33 ммоль/л, P < 0.05 (МКС); 10.83 ± 2.57 мкмоль/мл, P < 0.05 (СК) соответственно) дозах УТ-ОКОК. Кроме того, значимых различий между контрольной и УТ-ОКОК-обработанными группами в СК не наблюдалось.

Эффекты углеродных точек обуглённой коры обёлочника китайского (УТ-ОКОК) на мочевину в крови (МКС). a Изменения концентрации МКС в 1 ч, 3 ч, 12 ч, 1 день, 2 дня и 5 дней. Уровни МКС в (b) 1 день (c) 2 дня (d) 5 дней. Мыши лечили физраствором (ФР), ядом D.acutus (Dav, 1 мг/кг) и высокой (H), средней (M) и низкой (L) дозами УТ-ОКОК + Dav (1 мг/кг). Данные представлены как среднее ± SD шести животных каждой группы. *p < 0.05 и **p < 0.01 по сравнению с контрольной группой, обработанной ФР. ^#p < 0.05 по сравнению с группой Dav.

Эффекты углеродных точек обуглённой коры обёлочника китайского (УТ-ОКОК) на сывороточный креатинин (СК). a Изменения концентрации СК в 1 ч, 3 ч, 12 ч, 1 день, 2 дня и 5 дней. Уровни СК в (b) 1 день (c) 2 дня (d) 5 дней. Мыши лечили физраствором (ФР), ядом D.acutus (Dav, 1 мг/кг) и высокой (H), средней (M) и низкой (L) дозами УТ-ОКОК + Dav (1 мг/кг). Данные представлены как среднее ± SD шести животных каждой группы. *p < 0.05 и **p < 0.01 по сравнению с контрольной группой, обработанной физраствором (ФР). ^#p < 0.05 по сравнению с группой Dav.

УТ-ОКОК ингибировали секрецию цитокинов

Эффекты трёх концентраций УТ-ОКОК на продукцию хемоаттрактанта (MCP-1) и про-воспалительного (IL-1β) и анти-воспалительного (IL-10) цитокинов в ответ на инъекции яда D. acutus исследовали. Рис. 8 показал, что введение яда увеличило выделение IL-1β в модели мыши (1 ч: 58.19 ± 5.35 нг/мл, P < 0.01; 3 ч: 56.57 ± 3.54 нг/мл, P < 0.01; 12 ч: 49.48 ± 7.74 нг/мл, P < 0.05; 1 день: 41.09 ± 4.82 нг/мл, P < 0.05; 2 дня: 47.96 ± 8.33 нг/мл, P < 0.05; 5 дней: 45.11 ± 6.95 нг/мл, P < 0.05) по сравнению с уровнями в ФР-обработанной мыши (1 ч: 35.96 ± 4.72 нг/мл, 3 ч: 34.94 ± 2.58 нг/мл, 12 ч: 36.42 ± 5.25 нг/мл, 1 день: 34.47 ± 3.67 нг/мл, 2 дня: 39.84 ± 3.71 нг/мл, 5 дней: 36.82 ± 8.27 нг/мл). Как показано на рис. 8b–d, сравнение с группой, индуцированной ядом D. acutus, показало, что 1-, 3- и 12-часовое воздействие высокой (50.09 ± 7.68 нг/мл, P < 0.05 [1 ч]; 40.36 ± 8.51 нг/мл, P < 0.01 [3 ч]; 39.87 ± 4.64 нг/мл, P < 0.05 [12 ч] соответственно) и низкой (46.64 ± 3.83 нг/мл, P < 0.01 [1 ч]; 37.65 ± 9.61 нг/мл, P < 0.01 [3 ч]; 38.75 ± 6.64 нг/мл, P < 0.05 [12 ч] соответственно) дозами УТ-ОКОК значимо снизили уровни IL-1β. Кроме того, средняя доза УТ-ОКОК значимо снизила уровень IL-1β (41.50 ± 11.08 нг/мл, P < 0.01) по сравнению с ядом-обработанными мышами в 3 ч, но не в других временных точках.

Эффекты углеродных точек обуглённой коры обёлочника китайского (УТ-ОКОК) на уровень IL-1β в почечной ткани. a Изменения уровня IL-1β в 1 ч, 3 ч, 12 ч, 1 день, 2 дня и 5 дней. Уровни IL-1β в (b) 1 ч, (c) 3 ч, (d) 12 ч, (e) 1 день, (f) 2 дня и (g) 5 дней. Мыши лечили физраствором (ФР), ядом D.acutus (Dav, 1 мг/кг) и высокой (H), средней (M) и низкой (L) дозами УТ-ОКОК + Dav (1 мг/кг). Данные представлены как среднее ± SD шести животных каждой группы. *p < 0.05 и **p < 0.01 по сравнению с контрольной группой, обработанной физраствором (ФР). ^#p < 0.05 по сравнению с группой Dav.

Уровни анти-воспалительного цитокина IL-10 драматически увеличились в группе, обработанной ядом D. acutus, в разных временных точках (23.27 ± 0.72 нг/мл, P < 0.01; 22.03 ± 0.96 нг/мл, P < 0.05; 21.76 ± 1.99 нг/мл, P < 0.05; 26.31 ± 6.55 нг/мл, P < 0.01; 3 ч, 12 ч, 1 день и 2 дня соответственно) по сравнению с ФР-обработанной группой (рис. 9). В резком контрасте, лечение высокой и средней дозой УТ-ОКОК (17.17 ± 4.04 и 17.25 ± 5.64 нг/мл соответственно, оба P < 0.05) ингибировало яд-индуцированную секрецию IL-10 в 3 ч, в то время как низкая доза УТ-ОКОК ингибировала уровни в 3 ч, 12 ч и 1 день (17.17 ± 5.24, 17.83 ± 4.11 и 18.31 ± 2.14 нг/мл соответственно, все P < 0.05). Значимых различий между УТ-ОКОК-обработанными и ФР группами не наблюдалось.

Эффекты углеродных точек обуглённой коры обёлочника китайского (УТ-ОКОК) на уровень IL-10 в почечной ткани. a Изменения уровня IL-10 в 1 ч, 3 ч, 12 ч, 1 день, 2 дня и 5 дней. Уровень IL-10 в (b) 1 ч, (c) 3 ч, (d) 12 ч, (e) 1 день, (f) 2 дня и (g) 5 дней. Мыши лечили физраствором (ФР), ядом D.acutus (Dav, 1 мг/кг) и высокой (H), средней (M) и низкой (L) дозами УТ-ОКОК + Dav (1 мг/кг). Данные представлены как среднее ± SD шести животных каждой группы. *p < 0.05 и **p < 0.01 по сравнению с контрольной группой, обработанной физраствором (ФР). ^#p < 0.05 по сравнению с группой Dav.

Кроме того, рис. 10 показывает, что введение яда D. acutus значимо увеличило выделение MCP-1 в модельной группе (1 ч: 197.45 ± 22.34 нг/мл, P < 0.01; 3 ч: 182.42 ± 12.94 нг/мл, P < 0.01; 12 ч: 169.20 ± 26.74 нг/мл, P < 0.01; 24 ч: 142.81 ± 25.85 нг/мл, P < 0.05) по сравнению с ФР-контролем (1 ч: 115.82 ± 14.80 нг/мл; 3 ч: 106.46 ± 13.76 нг/мл; 12 ч: 120.35 ± 15.75 нг/мл; и 24 ч: 108.81 ± 25.60 нг/мл). Более замечательно, лечение отравленных мышей тремя дозами УТ-ОКОК ингибировало увеличение уровней MCP-1. Средняя (3 ч: 136.84 ± 39.94 нг/мл, P < 0.01; 12 ч: 127.48 ± 13.75 нг/мл, P < 0.01) и низкая (1 ч: 152.13 ± 18.89 нг/мл, P < 0.05; 3 ч: 129.54 ± 30.85 нг/мл, P < 0.01; 12 ч: 118.75 ± 19.96 нг/мл, P < 0.01) дозы УТ-ОКОК ингибировали увеличение уровней MCP-1 в 1, 3 и 12 ч, за исключением средней дозы в 1 ч (178.20 ± 22.79 нг/мл). Лечение высокой дозой УТ-ОКОК эффективно снизило уровень MCP-1 только в 3 ч (131.42 ± 24.62 нг/мл, P < 0.01).

Эффекты углеродных точек обуглённой коры обёлочника китайского (УТ-ОКОК) на уровень MCP-1 в почечной ткани. a Изменения уровня MCP-1 в 1 ч, 3 ч, 12 ч, 1 день, 2 дня и 5 дней. Уровни MCP-1 в (b) 1 ч, (c) 3 ч, (d) 12 ч, (e) 1 день, (f) 2 дня и (g) 5 дней. Мыши лечили физраствором (ФР), ядом D.acutus (Dav, 1 мг/кг) и высокой (H), средней (M) и низкой (L) дозами УТ-ОКОК + Dav (1 мг/кг). Данные представлены как среднее ± SD шести животных каждой группы. *p < 0.05 и **p < 0.01 по сравнению с контрольной группой, обработанной физраствором (ФР). ^#p < 0.05 по сравнению с группой Dav.

Напротив, уровни IL-1β, IL-10 и MCP-1 УТ-ОКОК-обработанных групп в определённых временных точках не были значимо отличны от модельной группы и показывали нисходящую тенденцию.

Эффект УТ-ОКОК на ингибирование тромбоцитопении

ТР имеют специфическую роль в патогенезе ОПН; поэтому количество ТР изучали и результаты показаны на рис. 11. По сравнению со значениями ТР контрольной группы (1 ч: [1228 ± 51] × 10⁹; 3 ч: [1120 ± 36] × 10⁹; 12 ч: [1245 ± 111] × 10⁹; 1 день: [1177 ± 69] × 10⁹; 2 дня: [1195 ± 51] × 10⁹; и 5 дней: [1181 ± 46] × 10⁹), резкое снижение произошло уже через 1 ч после введения яда D. acutus, с надиром в 3 ч. Впоследствии ТР стабильно увеличивались до 5 дней (1 ч: [354 ± 70] × 10⁹, P < 0.01; 3 ч: [315 ± 77] × 10⁹, P < 0.01; 12 ч: [435 ± 91] × 10⁹, P < 0.01; 1 день: [663 ± 226] × 10⁹, P < 0.01; 2 дня: [941 ± 248] × 10⁹, P < 0.05; 5 дней: [1083 ± 89] × 10⁹). Особенно, даже в этом временном интервале значения ТР были значимо ниже, чем у контрольных мышей. Кроме того, введение УТ-ОКОК в дозе 8 мг/кг выраженно ингибировало яд-индуцированную тромбоцитопению в 1 ч ([435 ± 91] × 10⁹, P < 0.05), 3 ч ([599 ± 290] × 10⁹, P < 0.05), 12 ч ([929 ± 92] × 10⁹, P < 0.01), 1 день ([1028 ± 248] × 10⁹, P < 0.01) и 2 дня ([1183 ± 89] × 10⁹, P < 0.01). Этот ингибирующий эффект также наблюдался при дозе 2 мг/кг УТ-ОКОК в 3 ч и 2 дня и 4 мг/кг УТ-ОКОК в 2 дня, в дополнение к увеличению ТР. Хотя значимых различий между моделью и средней дозой групп не было, восходящая тенденция наблюдалась в других временных точках.

Эффекты углеродных точек обуглённой коры обёлочника китайского (УТ-ОКОК) на количество тромбоцитов (ТР) в крови. a Изменения ТР в 1 ч, 3 ч, 12 ч, 1 день, 2 дня и 5 дней. ТР в (b) 1 ч, (c) 3 ч, (d) 12 ч, (e) 1 день, (f) 2 дня и (g) 5 дней. Мыши лечили физраствором (ФР), ядом D.acutus (Dav, 1 мг/кг) и высокой (H), средней (M) и низкой (L) дозами УТ-ОКОК + Dav (1 мг/кг). Данные представлены как среднее ± SD шести животных каждой группы. *p < 0.05 и **p < 0.01 по сравнению с контрольной группой, обработанной физраствором (ФР). ^#p < 0.05 по сравнению с группой Dav.

Гистопатологические наблюдения

Почечное повреждение в группе яда гистологически оценивали. Как показано на рис. 12a, в контрасте с ФР-обработанной группой, показывающей нормальные клубочки и тубулярную клеточность, выраженные изменения наблюдались в почечной паренхиме группы, обработанной ядом D. acutus. Эти изменения включали выраженное кровотечение, тубулярную дилатацию и дегенерацию. Совместное лечение УТ-ОКОК предотвратило яд-индуцированное почечное повреждение, и гистопатологическое обследование архитектуры почечных тканей было почти нормальным с лёгким гемостазом, тубулярной дилатацией и дегенерацией.

Эффекты углеродных точек обуглённой коры обёлочника китайского (УТ-ОКОК) на гистопатологические изменения в почечных тканях у мышей с ОПН, индуцированной ядом D.acutus (Dav). После челленджа ядом D.acutus, почечные ткани из каждой экспериментальной группы физраствор (ФР), яд D.acutus (Dav, 1 мг/кг) и высокой (H), средней (M) и низкой (L) дозами УТ-ОКОК + Dav (1 мг/кг) в (a) 1 ч, (b) 3 ч, (c) 12 ч, (d) 1 день, (e) 2 дня и (f) 5 дней.

Обсуждение

Как новозеландный наноматериал, УТ начинают занимать важную нишу как инновационные материалы для наномедицин следующего поколения. По сравнению с традиционными квантовыми точками на основе тяжёлых металлов, УТ являются хорошими кандидатами для биомедицинского применения благодаря их уникальным характеристикам, имеющим значительные потенциальные преимущества в разработке новых лекарств с относительно низкой токсичностью.

Полученные УТ-ОКОК частицы были квазисферическими и хорошо диспергированными в воде, с обильными функциональными группами на поверхности. Это наблюдение согласуется с ранее сообщёнными находками. Дополнительно, приготовленные УТ показали низкую токсичность против L02 и 237 T клеток, что указало на их пригодность для биомедицинских приложений.

Текущее исследование, по лучшему нашему знанию, впервые демонстрирует замечательные биоактивности УТ-ОКОК на ОПН, индуцируемой укусом D. acutus. D. acutus широко называют «пяти шагов» или «ста шагов» в китайской народной медицине из-за фольклорного описания, что люди или животные, укушенные D. acutus, не могли пройти более 100 шагов. Более 90% популяции D. acutus находится в Китае, и частота критических состояний и даже смерти, связанных с укусом этой змеи, выше, чем от многих других ядовитых змей. ОПН — самая серьёзная системная последствие и частое осложнение, ведущее к вторичной почечной ишемии и отказу. Расширенное знание соответствующей информации об ОПН, индуцируемой D. acutus отравлением, способствует разработке новых терапевтических подходов. Однако в противовес значительным знаниям, доступным о нефротоксичности змеиного яда в целом, информация об ОПН, индуцируемой ядом D. acutus, редка, что привело нас к изучению этого потенциального лекарства, которое всё ещё на ранних стадиях разработки.

В этом исследовании мы установили модель ОПН внутрибрюшинным введением яда D. acutus в мышей для оценки сложного и мультифакторного патогенеза яд-индуцированной ОПН. Более того, модель предоставила инструмент для исследования защитных эффектов УТ-ОКОК против ОПН, индуцируемой ядом D. acutus.

Текущие эксперименты показали развитие существенной ОПН с чёткими изменениями в воспалительных цитокинах и сывороточных и мочевых биохимических индексах, а также гистопатологическими доказательствами почечного повреждения после внутрибрюшинного введения змеиного яда. Эти находки указали на возможные факторы, которые могут в основном способствовать яд-токсичности: (1) прямой цитотоксичный эффект яда против почки и (2) почечные воспалительные реакции.

Конкретно, почечная недостаточность подтверждалась примерно через 24 ч после введения яда на основе олигурии, ассоциированной с белокмочеиспусканием и повышенными сывороточными биомаркерами (СК и МКС). Мы дополнительно подтвердили почечное вовлечение в группе, обработанной ядом D. acutus, с использованием биохимического анализа, который показал значимо повышенные уровни ОБМ и МА по сравнению с контрольной группой. Эти находки указывали на наличие клубочковой неисправности и тубулярной реабсорбции в группе, обработанной ядом, что поддерживалось доказательствами гистопатологических изменений. Напротив, значимое снижение уровней ОБМ и МА наблюдалось в отравленной группе, обработанной средней дозой УТ-ОКОК. Кроме того, сывороточные биохимические индикаторы (СК и МКС) — другие жизненно важные параметры, используемые для определения повышения почечной дисфункции в ОПН, и они остаются клиническими индикаторами в её диагностике. Введение змеиного яда с 1 по 5 день также драматически увеличивало уровни СК и МКС, тогда как лечение УТ-ОКОК обращало эти эффекты, приводя к более быстрому восстановлению, чем в контрольной группе. Более важно, чёткие изменения в почечной ткани, выраженное кровотечение, тубулярная дилатация и дегенерация дополнительно указывали на прямое поражение почки ядом. Аттенюирующие эффекты УТ-ОКОК на гистопатологические изменения были продемонстрированы в этом исследовании. Эти результаты предполагали, что УТ-ОКОК ингибировали аномальные проявления мочевых и сывороточных биохимических маркеров, ассоциированных с почечной дисфункцией, вызванной ОПН, а также почечное гистологическое повреждение. Кроме того, эти эффекты могут быть приписаны улучшению прямой нефротоксичности яда D. acutus УТ-ОКОК. Защитные эффекты УТ-ОКОК были подтверждены ингибированием прямого почечного повреждения, индуцированного ядом D. acutus.

Интенсивная воспалительная реакция — общая черта, индуцируемая отравлением ядовитыми животными, такими как змеи и гусеницы. Признаки системного воспаления с мононуклеарной инфильтрацией, нейтрофильным лейкоцитозом, дегенерацией тубулярных эпителиальных клеток и некрозом также показаны в почечном повреждении, индуцированном введением змеиного яда. MCP-1 — маломолекулярный белок, играющий жизненно важную роль в рекрутировании и активации лейкоцитов во время воспалительных реакций. Кроме того, мононуклеарные фагоциты и лимфоциты могут способствовать острой почечной клеточной травме разными механизмами, такими как секреция про-воспалительных медиаторов, которые затем могут индуцировать резидентные почечные клетки к экспрессии хемокинов. Вовлечение MCP-1, воспалительных цитокинов (IL-1β) и анти-воспалительного цитокина (IL-10) в воспалительную реакцию в патогенезе ОПН у мышей, инъецированных только ядом D. acutus, было продемонстрировано в настоящем исследовании. Это наблюдение указывало на то, что базовый механизм ОПН, индуцируемой ядом D. acutus, может быть ассоциирован с почечной воспалительной реакцией. Доказательства того, что воздействие УТ-ОКОК значимо снизило уровни IL-1β, IL-10 и MCP-1, предполагают, что УТ могут демонстрировать нефропротекцию, ингибируя почечные воспалительные реакции.

Более того, ТР играют решающую роль в острых гемостатических и воспалительных процессах и ассоциированы с разнообразными воспалительными патологиями. Они высокочувствительны и быстро реагируют на биологические изменения, когда организм травмирован или кровотеет, как первые клетки, прибывающие на место острого повреждения для взаимодействия с эндотелиальными клетками и лейкоцитами. ТР вовлечены в патогенез ОПН и считаются прогностическим маркером, значимо ассоциированным с худшим исходом ОПН. Это исследование предоставило доказательства того, что яд D. acutus очевидно снизил количество ТР, что согласуется с результатами исследований, сообщающих, что тромбоцитопения может быть индуцирована змеиным ядом. Мы наблюдали, что воздействие УТ-ОКОК значимо повысило количество ТР, что согласуется с находками предыдущего исследования.

Аномалии ОПН, индуцируемые ядом D. acutus, были, по нашему знанию, продемонстрированы впервые в текущем исследовании и в основном включали почечную дисфункцию, ассоциированную с белокмочеиспусканием, олигурией, повышенными уровнями МКС и СК, патологическим почечным повреждением, воспалительными реакциями и тромбоцитопенией.

Замечательно, УТ-ОКОК продемонстрировали защитную активность против ОПН, индуцируемой ядом D. acutus, ингибируя ассоциированные нарушения, как подтверждено в этом исследовании впервые. Это исследование было предварительной оценкой благоприятных эффектов УТ-ОКОК на ОПН, индуцируемую ядом D. acutus, и дальнейшие расследования базового механизма будут фокусом будущих исследований.

Заключение

Впечатляющие защитные эффекты УТ-ОКОК на ОПН, индуцируемую ядом D. acutus, были продемонстрированы в этом исследовании, впервые, по лучшему нашему знанию. Эффекты, связанные с ОПН, в основном проявлялись как почечная дисфункция, патологическое почечное повреждение, воспалительные реакции и тромбоцитопения. Эти результаты указывали на то, что УТ-ОКОК имеют перспективы применения как комплементарное лекарство для лечения аномалий, индуцируемых ОПН от яда D. acutus. Более того, это предоставляет новую стратегию для изучения активных ингредиентов формулировок традиционной китайской медицины и дополнительно расширяет биомедицинские применения УТ.

Доступность данных и материалов

Все данные, сгенерированные или проанализированные в ходе этого исследования, включены в эту опубликованную статью.

Аббревиатуры

ОПН:

Острая почечная недостаточность

МКС:

Мочевина в крови

УТ:

Углеродные точки

D. acutus:

Deinagkistrodon acutus

Г&Е:

Гемоксилин и эозин

IL:

Интерлейкин

МА:

Микроальбуминурия

MCP-1:

Моноцитарный хемоаттрактантный белок 1

КОК:

Кора обёлочника китайского

УТ-ОКОК:

Углеродные точки обуглённой коры обёлочника китайского

ТР:

Количество тромбоцитов

СК:

Сывороточный креатинин

ОБМ:

Общий белок в моче