Оптимизация тепловыделения в цилиндрических магнитных наночастицах с тройным вихрем для гипертермии рака

Магнитная гипертермия — давно известная техника лечения рака, использующая локальное нагревание МНЧ под высокочастотным переменным магнитным полем для индукции апоптоза раковых клеток и регрессии опухоли. В переменном магнитном поле тепло, диссипируемое МНЧ за один цикл магнитного поля, равно площади гистерезисной петли A, заданной: A = ∫_−Hmax^+H_max μ₀ M(H) dH, где M — намагниченность МНЧ под переменным магнитным полем с частотой f и амплитудой μ₀H_max. Для поддержания низкой дозы МНЧ и короткой длительности лечения в магнитной гипертермии, тепловая эффективность МНЧ должна быть максимизирована. Измерение тепловой производительности МНЧ называется удельной скоростью поглощения (SAR), которое является выделяемым теплом на единицу массы МНЧ (Вт г⁻¹): SAR = Af/ρ, где ρ — плотность МНЧ.

Эффективность тепловыделения МНЧ может быть экспериментально измерена через SAR, энергия, диссипируемая на единицу массы МНЧ (Вт г⁻¹), и задаётся: SAR = C ΔT/Δt 1/m_MNP, где C — удельная теплоёмкость среды (C_water = 4.18 Дж г⁻¹ °C⁻¹), ΔT/Δt — начальный наклон графика температуры от времени, m_MNP — масса МНЧ. Однако значения SAR не полностью репрезентируют тепловую эффективность МНЧ, так как тепловыделение также влияет частота f и сила магнитного поля H. Следовательно, эффективная удельная скорость поглощения или внутренняя мощность потерь (ILP) используется для характеристики тепловой эффективности МНЧ: ILP = SAR / (H²f).

В цилиндрических МНЧ NiFe формируется состояние тройного вихря, в котором по и против часовой стрелки вихри соединены в центре МНЧ через третий вихревой核, приводя к трёхмерной конфигурации намагниченности. Теоретическое тепловыделение от МНЧ для приложений магнитной гипертермии рассчитывали из смоделированных гистерезисных петель и измерений вибрирующего образцовым магнитометром. Используя временно-зависимые калориметрические измерения, удельная скорость поглощения и внутренняя мощность потерь МНЧ определялись и сравнивались с числовыми расчётами.

Методы

Фабрикация магнитных наночастиц

Шаблонно-помощенное импульсное электродепонирование с дифференциальным химическим травлением — простой и недорогой метод фабрикации для производства МНЧ различных составов Ni, Fe или Co. Ni₈₀Fe₂₀, Пермаллой, — ферромагнитный материал, демонстрирующий исключительные магнитные свойства, такие как высокая проницаемость, низкая коэрцитивность и близкая к нулю магнитострикция. Фабрикация цилиндрических МНЧ начинается с выращивания композиционно-модулированных цилиндрических нанопроводников NiFe с использованием шаблонно-помощенного импульсного электродепонирования в электролитической вanne, состоящей из NiSO₄, FeSO₄ и H₃BO₃. Затем нанопроводники освобождали растворением ААО-шаблона в NaOH. Наконец, Fe-богатые области в нанопроводниках химически травили разбавленной HNO₃ для формирования МНЧ. Диаметр МНЧ определялся размером поры ААО-шаблона, а длина контролировалась длительностью высокопотенциального импульса V_H (Дополнительный файл 1).

Живучесть клеток

HeLa клетки посеяли в 12-колончатую микропластинку при 8 × 10⁴ клеток/колодку и инкубировали в модифицированной среде Дюльбекко с 4.5 г/л глюкозы, 2 мМ L-глутамина, 10% фотальной говяжьей сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина в увлажнённой атмосфере при 37 °C и 5% CO₂. Живучесть клеток определяли с использованием PrestoBlue, проницаемого резазурин-базированного реагента живучести, использующего восстанавливающую способность живых клеток для количественного измерения пролиферации клеток. HeLa клетки, обработанные 0.1 мг/мл МНЧ, инкубировали с реагентом PrestoBlue при 37 °C и 5% CO₂ 2 ч. Абсорбционные значения при 570 нм и 600 нм измеряли на микропластинчатом считывателе Tecan Infinite M200 PRO. Живучесть клеток выражалась в процентах относительно клеток, не экспонированных МНЧ. Каждый эксперимент выполняли в четверо наборах экспериментальных и контрольных анализов.

Статистический анализ

Результаты представляли как среднее ± стандартное отклонение (SD). Статистическая значимость анализировалась с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с OriginPro, OriginLab. p значение < 0.05 считалось статистически значимым.

Микромагнитные симуляции

Конфигурации намагниченности МНЧ исследовали с использованием GPU-ускоренной программы микромагнитных симуляций MuMax3 для решения уравнения Ландау-Лифшица-Гилберта (LLG) в трёх измерениях. Эти микромагнитные симуляции дали понимание конфигураций намагниченности МНЧ на микроскопическом уровне, показывая корреляцию между аналитическими моделями и наблюдениями из экспериментальных результатов. Полная энергия системы описывается: E_Total = E_Exchange + E_Anisotropy + E_Zeeman + E_Dipolar = −∫ μ₀ H_eff(r)·M(r) d³r, где H_eff = −(1/μ₀) ∇_M E. Уравнение Ландау-Лифшица-Гилберта (LLG) описывает прецессию намагниченности M в эффективном магнитном поле H_eff с затуханием α: dM(r)/dt = −γ M(r) × H_eff(r) − (ᾱ/M_s) M(r) × (M(r) × H_eff(r)), где γM(r) × H_eff(r) — прецессия M(r) в локальном поле H_eff(r) и (ᾱ/M_s) M(r) × (M(r) × H_eff(r)) — эмпирический затухающий член. Материальные параметры для Пермаллоя Ni₈₀Fe₂₀ использовали: насыщенная намагниченность M_s = 860 × 10³ А/м, константа жёсткости обмена A_ex = 1.3 × 10⁻¹¹ Дж/м, нулевая магнитокристаллическая анизотропия k = 0, и постоянная затухания Гилберта α = 0.01. Размер ячейки 5 нм × 5 нм × 5 нм использовали для всех симуляций, что достаточно мало по сравнению с длиной обмена.

Экспериментальная установка для магнитной гипертермии

SAR экспериментально получали из временно-зависимых калориметрических измерений, экспонируя МНЧ переменному магнитному полю, генерируемому высокочастотным индукционным нагревателем. МНЧ в водной суспензии с концентрациями 0.05–0.1 мг/мл заливали в фальконовую пробирку, которая изолировали пенопластом и окружали индукционными катушками. Температура катушек поддерживали при 28.0 ± 0.5 °C системой водяного рециркуляционного хиллера. Начальная температура суспензии поддерживали при 28.0 ± 0.5 °C 1 мин для устранения любых тепловых вкладов от индукционных катушек. Применяли переменное магнитное поле в диапазоне 15.9–47.8 кА м⁻¹ и фиксированной частоте 360 кГц, в пределах критерия для клинической магнитной гипертермии.

Результаты и обсуждение

Характеризация магнитных наночастиц

Состав fabriцированных цилиндрических МНЧ NiFe определяется V_H или составом электролита. Чтобы показать большую степень контроля в составе МНЧ, различные составы МНЧ fabriцировали (Ni₈₈Fe₁₂, Ni₇₆Fe₂₄, Ni₅₂Fe₄₈, Ni₃₆Fe₆₄) и верифицировали энергодисперсивной рентгеновской спектроскопией (EDX). Рис. 1 показывает нормированные гистерезисные петли, полученные измерениями вибрирующего образцовым магнитометром (VSM) для МНЧ NiFe с различными составами. Магнитное поле увеличивали до значения, достаточного для преодоления эффективной магнитной анизотропии, так что намагниченность достигала насыщения. Коэффициент квадратности SQR — базовое измерение того, насколько квадратной гистерезисная петля, задаётся: SQR = M_r/M_s.

Значения коэрцитивности H_c и квадратности SQR = M_r/M_s для в-плоскости и вне-плоскости приложенных магнитных полей таблицированы в Таблице 1. В общем, тренд в-плоскости H_c выше вне-плоскости H_c для Ni-богатых МНЧ (Ni₈₈Fe₁₂, Ni₇₆Fe₂₄, Ni₅₂Fe₄₈), но обращается для Fe-богатых МНЧ (Ni₃₆Fe₆₄), что согласуется с предыдущими исследованиями аномального ко-депозицирования нанопроводников NiFe.

Биосовместимое поверхностное покрытие

МНЧ NiFe склонны к агрегации из-за эффектов сильных дипольных взаимодействий между соседними МНЧ. Поэтому поверхностная модификация МНЧ с использованием биосовместимого и биодеградируемого полимера, такого как хитозан, поливиниловый спирт, олеиновая кислота, декстран и, наиболее часто, полиэтиленгликоль (ПЭГ), предлагалась. ПЭГ — гидрофильный полимер, широко используемый для улучшения кровообращения липосом и МНЧ. Для диспергирования цилиндрических МНЧ NiFe в воду использовали биосовместимый ПЭГ 5000 г моль⁻¹ как стабилизатор. Растровое электронное микроскопирование (SEM) показывает формирование оксидной оболочки вокруг МНЧ, показано на рис. 2a. Эта оксидная оболочка предотвращает окисление магнитных материалов в МНЧ. Предыдущие исследования FeCo МНЧ и Fe МНЧ показали тяжёлую окисленность от простого воздействия атмосферы.

Рентгеновская дифракция (XRD) пик в основном индексировался на (111) кристаллических плоскостях, соответствующих гранецентрированной кубической (fcc) структуре объёмного NiFe, как показано на рис. 2b. Это указывает на то, что МНЧ были электродепонированы с предпочтительной ориентацией (111), что также очевидно в нанопроводниках NiFe, fabriцированных электродепонированием или спуттерингом. Дополнительно отсутствовали дифракционные пики, соответствующие шпинельной оксидной фазе ((NiFe)₃O₄), которая результатом формирования оксидных фаз из-за высокой концентрации Fe. Высокая кристалличность МНЧ NiFe привела к пренебрежимо малому поверхностному спиновому кантированию и следовательно сохранили высокую насыщенную намагниченность и малую коэрцитивность МНЧ. Дальнейшие характеристики ПЭГ-покрытых МНЧ NiFe проводили с использованием EDX измерений. Как показано на рис. 2c, в основном детектировались Ni и Fe элементы, с присутствием малого процента O элемента, указанием на оксидную оболочку, сформированную вокруг МНЧ.

С рис. 2d, живучесть HeLa клеток, экспонированных непокрытым и ПЭГ-покрытым МНЧ NiFe после 24 ч, составляла 82.2% и 82.6% соответственно. После 48 ч живучесть слегка снизилась до 79.9% и 82.1%, демонстрируя слегко более высокую биосовместимость для ПЭГ-покрытых МНЧ. МНЧ NiFe без оболочек токсичны для млекопитающих клеток и влияют на живучесть. ПЭГ покрытие было высоко биосовместимым и может снизить цитотоксичность и интернализацию МНЧ в клетки через эндоцитоз. Цитотоксичность цилиндрических МНЧ NiFe для HeLa клеток сопоставима с другими коммерчески доступными ферромагнитными НЧ, используемыми в исследованиях магнитной гипертермии.

Динамика намагниченности

Состав МНЧ держали при Пермаллое Ni₈₀Fe₂₀, в то время как длина (l) и диаметр (d) МНЧ варировали. Вклад обменной энергии, демагнетизационной или диполярной энергии и энергии Зеемана в полную энергию МНЧ изображены как функция приложенного магнитного поля H вдоль длинной оси МНЧ на рис. 3a–d соответственно. МНЧ сначала насыщали сильным магнитным полем, параллельным его длинной оси. При больших магнитных полях вклад энергии Зеемана преобладает и спины в основном выровнены в направлении магнитного поля. Это параллельное расположение спинов к полю минимизирует вклад обменной энергии в полную магнитную энергию. По мере снижения приложенного магнитного поля, нуклеация по и против часовой стрелки вихрей происходит на концах МНЧ, которые прогрессируют к центру МНЧ, приводя к постепенному снижению параллельного компонента намагниченности, вызывая падение вклада Зеемана, в то время как другие вклады становятся всё более значимыми. Намагниченность МНЧ пытается минимизировать рассеянное поле, и таким образом снижает демагнетизационную энергию. При достаточно низких магнитных полях формируется состояние тройного вихря, которое является стабильной конфигурацией намагниченности с полной энергией, сохранённой на минимуме. По мере реверса магнитного поля, резкое падение обменной энергии соответствует внезапному расщеплению двух вихрей.

МНЧ с разными длинами (l) оказались имеющими значимо разные конфигурации намагниченности. При длинах l ниже 100 нм нуклеация только одиночного вихря происходила, что является в-плоскостной и замкнутой флюксной доменной структурой, благодаря взаимодействию между магнитостатической и обменной энергией. Для l выше 100 нм нуклеация пары против часовой стрелки и по часовой стрелки вихревых ядер на концах МНЧ происходила — состояние двойного вихря. Когда магнитное поле снижалось, один из вихрей аннигилировался, коллапсируя в состояние одиночного вихря. Однако при l выше 300 нм не было аннигиляции вихря при низких полях, вместо этого нуклеация дополнительного третьего вихревого ядра на кривой поверхности МНЧ происходила — состояние тройного вихря.

Калориметрические измерения

Ni₈₀Fe₂₀ МНЧ с l = 500 нм и d = 350 нм экспонировали переменному магнитному полю 15.9–47.8 кА м⁻¹ (200–600 Ое), и кривая температура-время показана на рис. 4a. Как характеризуется уравнением SAR, значения SAR рассчитывали как 427 Вт г⁻¹, 1054 Вт г⁻¹ и 1742 Вт г⁻¹ для 15.9 кА м⁻¹, 31.9 кА м⁻¹ и 47.8 кА м⁻¹ соответственно. Как предсказывалось, чем больше сила магнитного поля, тем больше значение SAR, т.е. значение SAR пропорционально силе магнитного поля. Поэтому ILP получали для лучшей оценки тепловой эффективности МНЧ для магнитной гипертермии. Как характеризуется уравнением ILP, значения ILP рассчитывали как 4.69 нГн м² кг⁻¹, 2.88 нГн м² кг⁻¹ и 2.12 нГн м² кг⁻¹ для 15.9 кА м⁻¹, 31.9 кА м⁻¹ и 47.8 кА м⁻¹ при 360 кГц соответственно.

Далее, МНЧ NiFe с d = 350 нм и l = 100–500 нм экспонировали переменному магнитному полю 47.8 кА м⁻¹ (600 Ое), и кривая температура-время показана на рис. 4b. Значения SAR рассчитывали как 409 Вт г⁻¹, 618 Вт г⁻¹ и 1742 Вт г⁻¹ для l = 100 нм, 200 нм и 500 нм при 47.8 кА м⁻¹ и 360 кГц соответственно. Значения ILP рассчитывали как 0.50 нГн м² кг⁻¹, 0.75 нГн м² кг⁻¹ и 2.12 нГн м² кг⁻¹ для l = 100 нм, 200 нм и 500 нм при 47.8 кА м⁻¹ и 360 кГц соответственно.

МНЧ с l = 500 нм имели намного большую тепловую эффективность, чем МНЧ с l = 100 нм и 200 нм, приводя к более значительному повышению температуры. Наивысшее значение SAR МНЧ с l = 500 нм составляло 1742 Вт г⁻¹ при 47.8 кА м⁻¹ и 360 кГц. Для сравнения, значения SAR для магнитного поля 15.9–31.9 кА м⁻¹ (200–400 Ое) и МНЧ с d = 350 нм и l = 100–500 нм таблицированы на рис. 4c. При тех же условиях значения SAR и ILP МНЧ с l = 500 нм были в четыре раза выше, чем у МНЧ с меньшими l. Из микромагнитных симуляций наблюдалось, что по мере увеличения l до > 300 нм процесс реверса намагниченности МНЧ менялся от состояния двойного вихря к состоянию тройного вихря. При l < 300 нм наблюдались только состояния одиночного или двойного вихря. Остаточная намагниченность M_r МНЧ была значимо выше для состояния тройного вихря по сравнению с одиночным или двойным вихрем.

Для однодоменных МНЧ теоретическая модель для расчёта динамической гистерезисной петли предложена Carrey и соавт. Для много доменных МНЧ использование микромагнитных симуляций для получения статической гистерезисной петли для расчёта было разумным для МНЧ с большими размерами, выше критического размера для суперпарамагнетизма, так как время переключения намагниченности порядка 10⁻⁹ с. Поскольку время переключения магнитной гипертермии порядка ~10⁻⁶ с, большие МНЧ способны следовать за переменным магнитным полем. Площадь гистерезисных петель, полученных из микромагнитных симуляций цилиндрических МНЧ NiFe и VSM измерений, использовалась для теоретического расчёта значений SAR и таблицирована на рис. 4d.

Значения SAR МНЧ с l = 100 нм и 200 нм демонстрировали малые значения SAR при низких магнитных полях ниже H_c и резко возрастали до насыщения при высоких магнитных полях, что является характеристикой ферромагнитного режима. Напротив, зависимость SAR от магнитного поля для l = 500 нм МНЧ с состоянием тройного вихря следовала нелинейному соотношению со значениями SAR ~6 раз большими. Высокая остаточная намагниченность M_r состояния тройного вихря в МНЧ l = 500 нм была очевидна в ненулевых значениях SAR при низких магнитных полях. Сравнение калориметрических измерений (рис. 4c) и числовых расчётов (рис. 4d) указывает на качественное и количественное соглашение по особенностям МНЧ в ферромагнитном режиме, демонстрируя малые значения SAR при низких полях и насыщение при высоких полях, коррелирующее с H_c МНЧ.

Тепловыделение МНЧ NiFe с состояниями тройного вихря сравнивали для d = 150–350 нм под переменным магнитным полем 47.8 кА м⁻¹ (600 Ое), и кривая температура-время показана на рис. 5a. Значения SAR и ILP рассчитывали как 1785 Вт г⁻¹, 2073 Вт г⁻¹ и 2750 Вт г⁻¹ и 2.17 нГн м² кг⁻¹, 2.52 нГн м² кг⁻¹ и 3.34 нГн м² кг⁻¹ для d = 350 нм, 250 нм и 150 нм соответственно. МНЧ с d = 150 нм и 250 нм могли достичь оптимальной терапевтической температуры 43 °C за 4.92 мин и 7.45 мин при концентрации 0.1 мг/мл. Сравнивая МНЧ с разными аспектными соотношениями, наблюдалось, что тепловая эффективность d = 150 нм МНЧ была в 1.54 раза больше, чем d = 350 нм МНЧ. Это потому, что МНЧ с d = 150 нм обладали наивысшей низкополевочувствительностью и M_r. Поэтому значение SAR тесно коррелировало с процессом реверса намагниченности МНЧ с вариациями как в l, так и в d.

Из микромагнитных симуляций можно наблюдать, что площадь гистерезиса A значимо эволюционирует с диаметром (d) МНЧ. Поэтому значение SAR d = 150 нм МНЧ увеличивается так быстро и насыщается при максимальном значении SAR 6263 Вт г⁻¹. Числовые расчёты показали, что МНЧ с более высокими аспектными соотношениями имеют более высокие гистерезисные потери, приводящие к более высоким теоретическим значениям SAR, как показано на рис. 5b. Сравнение калориметрических измерений (рис. 5a) и числовых расчётов (рис. 5b) было в хорошем качественном согласии, но были количественные разногласия в значениях гистерезисных потерь. Несоответствие между экспериментальными и теоретическими значениями возникло из-за того, что МНЧ NiFe были несуперпарамагнитными и обладали не пренебрежимо малой остаточной намагниченностью, приводящей к нежелательной агломерации из-за сильных магнитных дипольных взаимодействий между соседними МНЧ. Поскольку гидродинамический объём МНЧ является компонентом, управляющим броуновским движением, степень агрегации МНЧ определит доминирующий механизм релаксации, т.е. неэлевский или броуновский. Следовательно, агрегированная группа МНЧ против одиночной свободной МНЧ будет сильно отличаться в значениях SAR. Кроме того, переменное магнитное поле может индуцировать формирование нано-колонн или нано-цепочек, демонстрирующих непохожий броуновский механизм релаксации и поэтому объясняющих разницу между экспериментальными и теоретическими значениями.

Заключение

Высокие значения SAR, демонстрируемые цилиндрическими МНЧ NiFe, сопоставимыми с оксидными железными МНЧ (IOMNP) и суперпарамагнитными оксидными железными наночастицами (SPION), демонстрируют способность этих МНЧ к тепловыделению под переменным магнитным полем. МНЧ с состоянием тройного вихря имели намного большую тепловую эффективность, чем МНЧ с двойным или одиночным вихрем, имея значение SAR в четыре раза большее, атрибутируемое высокой M_r МНЧ в состоянии тройного вихря. Сравнивая МНЧ с разными аспектными соотношениями, наблюдалось, что тепловая эффективность d = 150 нм МНЧ была в 1.54 раза больше, чем d = 350 нм МНЧ из-за большей M_r и низкополевочувствительности. И калориметрические измерения, и микромагнитные симуляции показали корреляцию между процессом реверса намагниченности и более высокими гистерезисными потерями от d = 150 нм МНЧ, приводящими к более высоким экспериментальным и теоретическим значениям SAR. Легкое управление размерами МНЧ и их магнитными свойствами указывает на большой потенциал для in vivo клинических испытаний магнитной гипертермии рака.

Доступность данных и материалов

Наборы данных, сгенерированные в ходе и/или проанализированные в ходе текущего исследования, доступны у соответствующего автора по разумному запросу.

Аббревиатуры

d:

Диаметр магнитных наночастиц

EDX:

Энергодисперсивная рентгеновская спектроскопия

H_c:

Коэрцитивность

ILP:

Внутренняя мощность потерь

l:

Длина магнитных наночастиц

МНЧ:

Магнитные наночастицы

M_r:

Остаточная намагниченность

ПЭГ:

Полиэтиленгликоль

SAR:

Удельная скорость поглощения

SEM:

Растровое электронное микроскопирование

SQR:

Коэффициент квадратности

V_H:

Высокопотенциальный электродепозиционный импульс

VSM:

Вибрирующий образцовый магнитометр

XRD:

Рентгеновская дифракционная спектроскопия