Зеленый синтез серебряных наночастиц из кожуры граната: мощная антимикробная активность и цитотоксичность к раке толстой кишки

Аннотация

Лекарствоустойчивые микробы и растущие показатели онкозаболевательности требуют инновационных решений. В работе продемонстрирован эко-безопасный синтез серебряных наночастиц (AgNP) с использованием водного экстракта кожуры граната (Punica granatum) — распространенного биоотхода. Переход прозрачного раствора в темно-коричневый, подтвержденный UV-Vis спектроскопией (плазмонный пик при 378 нм) и рентгеновской дифракцией (кубическая структура), дал сферические AgNP диаметром 20–40 нм (в среднем 26,95 нм). Частицы проявили сильную антибактериальную активность по отношению к грамотрицательным и грампозитивным патогенам: E. coli, P. aeruginosa, P. vulgaris, S. typhi, S. aureus, S. epidermidis, K. pneumoniae. Цитотоксичность на клетках рака толстой кишки RKO составила 56% живучести на 3-й день и 61% на 5-й день при концентрации 12,5 мкг/мл AgNP. Результаты подчеркивают потенциал гранатовых AgNP как двойных антибактериальных и антинеопластических агентов.

Введение

Быстрое развитие нанотехнологий обратило внимание на зеленый синтез — использование растительных экстрактов для получения наночастиц ниже 100 нм, идеальных для доставки лекарств и биомедицинских применений. В отличие от дорогих химических или физических методов, зеленый подход дешев, нетоксичен и использует природные восстановители: белки, ферменты, углеводы. Так полученные AgNP демонстрируют высокую антимикробную эффективность благодаря большому соотношению площадь/объем и способности проникать в бактериальные клетки эффективнее ионов серебра.

Больничные инфекции, часто вызванные грамотрицательными и грампозитивными бактериями, требуют новых антибактериальных стратегий. Недавние работы показывают, что AgNP могут синергизировать с традиционными антибиотиками, усиливая общую активность. Кроме того, AgNP проявляют цитоксический эффект на различных линиях раковых клеток, делая их привлекательными для антираковой терапии.

Настоящее исследование фокусируется на синтезе AgNP из экстракта кожуры граната, оценке их антибактериальной силы против панели клинически значимых патогенов и цитоксичности на клетках рака толстой кишки.

Методы

Приготовление экстракта кожуры

1 кг саудовских гранатов (выращенных в Тайфе) вымыли, очистили и сушили. Кожуру смололи в порошок, 10 г замочили в 100 мл двужды дистиллированной воды на 24 ч при комнатной температуре. Смесь отфильтровали через бумагу Whatman №1 для получения водного экстракта, все проводили в стерильных условиях.

Синтез AgNP

0,1 мМ нитрат серебра смешали с 250 мл двужды дистиллированной воды. Добавили 10 мл экстракта кожуры и взбалтывали 5 мин. Изменение цвета от бесцветного к темно-коричневому через 24 ч указало на формирование Ag⁰. Суспензию центрифугировали на 15 000 об/мин 15 мин, повторили 4 раза, получая очищенные AgNP для анализов.

Характеризация

UV-Vis спектры (200–800 нм) регистрировали на 24, 48, 72 ч на Perkin Elmer Lambda 950. XRD (PANalytical) определил кристаллическую структуру. TEM (JEOL JEM-1230) и SEM (JSM 6380 LA) оценили морфологию и размер; EDX (JED 2200) — элементный состав.

Антибактериальные тесты

Бактериальные суспензии

Клинические изоляты (E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27584, P. vulgaris ATCC 8427, S. typhi ATCC 14028, S. aureus ATCC 29213, S. epidermidis MTCC 3615, K. pneumoniae) реанимировали, высевали на питательной агаре и готовили концентрацию 10⁶ КОЕ/мл.

Метод колодцев в агаре

Колодцы заполняли 25, 50, 75 и 100 мкл суспензии AgNP. Инкубировали при 37 °C 24 ч, измеряли зоны ингибирования (мм). Каждый тест в триplicates.

Цитоксичность

Пролиферация клеток

Клетки RKO рака толстой кишки (ATCC CRL-2577) посеяли 5×10³ клеток/мл в 96-колодчатых пластинках и обрабатывали 0,3–100 мкг/мл AgNP. Тесты Alamar Blue проводили на 3-м и 5-м днях, измеряя относительные флуоресцентные единицы.

Апоптоз/Некроз

Клетки окрашивали акридиновым оранжевым/этидиевым бромидом (AO/EtBr) после 5 дней воздействия 1,5–25 мкг/мл AgNP и рассматривали под флуоресцентным микроскопом для выявления живых, апоптотических и некротических клеток.

Статистический анализ

Данные анализировали односторонним ANOVA (GraphPad Prism 6.0). Результаты с p < 0,05 считались статистически значимыми.

Результаты и обсуждение

Зеленый синтез прошел гладко, видимый сдвиг цвета подтвердил образование AgNP. UV-Vis спектры показали характерный плазмонный пик при 378 нм, интенсивность которого росла со временем, отражая увеличение концентрации наночастиц.

XRD паттерны соответствовали 면центрированной кубической структуре серебра (JCPDS № 04-0783). TEM-изображения раскрыли равномерно распределенные сферические частицы 20–40 нм, средний 26,95 нм. SEM подтвердил аналогичную морфологию, EDX-анализ показал 70% Ag по массе, подтверждая успешный синтез.

Антибактериальное тестирование выявило дозозависимыезоны ингибирования. Грамотрицательные (E. coli, P. aeruginosa, S. typhi) и грампозитивные (S. aureus, S. epidermidis, K. pneumoniae) бактерии были ингибированы, наиболее выраженные эффекты при 100 мкл. Особенно, S. typhi проявил меньшую чувствительность, что согласуется с предыдущими отчетами.

Цитоксичность показала снижение живучести клеток RKO до 56% на 3-й день и 61% на 5-й день при 12,5 мкг/мл AgNP. Окраска AO/EtBr подтвердила апоптоз и автофагию-связанные изменения, указывая, что эти наночастицы могут запускать пути программированной смерти в клетках рака толстой кишки.

Заключение

Экстракт кожуры граната служит эффективным, устойчивым восстановителем для производства AgNP оптимального размера (20–40 нм) для доставки лекарств. Синтезированные частицы проявляют сильную антибактериальную активность по спектру клинически значимых патогенов при низких концентрациях и демонстрируют значительную цитоксичность против клеток рака толстой кишки. Эти выводы позиционируют зеленые AgNP как перспективных кандидатов для двойной антибактериальной и антинеопластической терапевтической разработки.

Аббревиатуры

EDX

Энергодисперсная рентгеновская спектроскопия

SEM

Развеивающая электронная микроскопия

TEM

Трансляционная электронная микроскопия

XRD

Рентгеновская дифракция