Секреция париетальных клеток желудка и кишечных бокаловидных клеток:новый опосредованный клетками метаболический путь металлических наночастиц in vivo, усиленный диареей с помощью китайских трав

Аннотация

На сегодняшний день способ, которым металлические наночастицы очищаются in vivo, еще не изучен. Здесь мы сообщаем о новом пути выведения in vivo, опосредованном бокаловидными клетками кишечника, для удаления металлических наночастиц. Типичные металлические наночастицы, такие как треугольные нанопластинки серебра, магнитные наночастицы, золотые наностержни и золотые нанокластеры, были выбраны в качестве типичных примеров. Эти металлические наночастицы были приготовлены, охарактеризованы и введены через хвостовую вену модели мышей с перевязкой общего желчного протока (CBD). Кал и мочу собирали в течение 7 дней, после чего мышей забивали и собирали ткани кишечника и желудка для дальнейшего анализа. Результаты показали, что все четыре выбранные наночастицы металлов были расположены внутри бокаловидных клеток (GC) всей ткани кишечника и выводились в просвет кишечника через секрецию кишечных GC. Более того, треугольные серебряные нанопластинки и золотые наностержни были расположены внутри париетальных клеток желудка (ПК). Важно отметить, что наночастицы не вызывали явных патологических изменений в тканях кишечника. В этом исследовании мы подтвердили, что тельца крови участвуют в пути секреции GC. Кроме того, мы обнаружили, что секреция наночастиц из кишечных ГК и ПК ускоряется диареей, вызванной китайскими травами. В заключение, металлические наночастицы, такие как треугольные серебряные нанопластинки, магнитные наночастицы, золотые наностержни и золотые нанокластеры, могут быть удалены кишечными ГХ и ПК. Этот новый путь удаления металлических наночастиц in vivo имеет большой потенциал для будущих применений, таких как дизайн и разработка новых лекарств, маркировка на основе наночастиц и отслеживание in vivo, а также оценка биобезопасности наночастиц in vivo.

Введение

В связи с быстрым развитием нанотехнологий и их приложений широкий спектр инженерных наноструктурных материалов теперь используется в фармацевтике, биомедицине и других отраслях промышленности. Новые продукты нанотехнологий обладают огромным потенциалом для будущего экономического роста и развития, но риски нанотехнологий для окружающей среды и здоровья человека до сих пор полностью не изучены. Для исследования воздействия наночастиц на организм человека, их взаимодействия с биологическими системами и оценки их потенциального риска нанотоксикология рассматривалась как новый междисциплинарный предмет, привлекающий все большее внимание правительств и ученых и устанавливающий биобезопасность наноматериалов в качестве ключевого фактора. научная проблема. На сегодняшний день многие отчеты тесно связаны с взаимодействием между наночастицами и клетками человека. Например, некоторые наночастицы, такие как оксиды графена, нанокластеры золота и углеродные точки, могут проникать в цитоплазму или ядро клетки, вызывая остановку клеточного цикла или апоптоз клеток, образование гранулем легких и стимулируя секрецию некоторых цитокинов иммунологическими клетками [1,2, 3].

С развитием новых методов молекулярной визуализации металлические наночастицы, такие как наночастицы золота, наночастицы серебра, магнитные наночастицы и квантовые точки, активно исследуются в качестве многофункциональных тераностических реагентов и используются для целенаправленной визуализации in vivo, магнитно-индуцированного нагрева, фототермических или фотодинамическая терапия или как высокоэффективные системы доставки лекарств, среди прочего. Было замечено, что эти многофункциональные нанозонды на основе металлических наночастиц расположены в участках опухоли, а часть из них также находится в тканях печени и селезенки и может распространяться по тканям почек, легких и головного мозга [4,5,6, 7,8,9,10]. Поскольку почки удаляют только наночастицы диаметром менее 5 нм, большинство наночастиц очень трудно удалить таким способом [11, 12]. Таким образом, очистка металлических наночастиц in vivo стала одной из ключевых научных проблем. Однако до настоящего времени не существует убедительных альтернативных путей и подробных механизмов удаления наночастиц металлов из человеческого тела. Таким образом, наша задача - очистить металлические наночастицы in vivo.

На сегодняшний день наночастицы металлов вводятся в организм в основном тремя путями, такими как внутривенный, пероральный и внутрибрюшинный пути, среди которых внутривенная инъекция является наиболее распространенным методом из-за ее быстрого распространения по всему телу [4, 13, 14] . Однако разрушение организмом металлических ядер этих типов наночастиц является, если возможно, чрезвычайно трудным, что приводит к основной проблеме, а именно к эффектам накопления остаточных наночастиц. Следует отметить, что качество металлических наночастиц in vivo определяется балансом между биоактивностью, вызванной наночастицами, и нежелательной токсичностью. С токсикологической точки зрения токсический эффект возникает только в том случае, если в целевом участке находится достаточное количество наночастиц, а выведение из организма - лучший способ прекратить действие чрезмерного количества наночастиц, находящихся в клетках и тканях. Следовательно, правильное понимание путей их очистки имеет решающее значение для любого медицинского применения и для всесторонней оценки рисков.

Есть несколько исследований, связанных с удалением наночастиц из тканей или органов in vivo, таких как почки, печень и легкие [15,16,17]. Однако эти эксперименты просто предоставляют информацию о механизме очистки для удаления частиц из одного органа, а не из всего тела [18]. Что касается системного клиренса in vivo, сообщалось о двух основных путях выведения наночастиц, вводимых внутривенно, а именно, путь гепатобилиарной системы (HBS) - фекалии для более крупных наноструктур, которые не могут быть подвергнуты биологическому разложению организмом, как некоторые типы магнитных наночастиц. [19, 20], а также путь почка-моча для наночастиц небольшого размера, таких как квантовые точки, фуллерены, нанокластеры золота и другие типы наночастиц золота с диаметром менее 5 нм [16, 21, 22]. Однако эти два пути демонстрируют ограниченную скорость выведения металлических наночастиц in vivo.

Souris et al. продемонстрировали, что наночастицы кремнезема накапливаются в стенке кишечника в высокой концентрации и что концентрация наночастиц кремнезема размером 50–100 нм, вводимых внутривенно, в печени, была намного ниже, чем в стенке кишечника и кале [20]. Другое исследование показало, что наночастицы размером до 500 нм независимо от модификаций могут быть удалены из тела рыбы и что скорость удаления частиц размером 500 нм была быстрее и эффективнее, чем у частиц размером 50 нм, несмотря на то, что наночастицы большего размера намного превосходят возможности ОБДХ [23]. Эти данные показывают, что путь HBS может не быть основным путем выведения наночастиц in vivo и что могут существовать другие пути выведения наночастиц in vivo.

Кишечные бокаловидные клетки (ГК) представляют собой сильно поляризованные экскреторные клетки, которые присутствуют во всем кишечном тракте. Считается, что эти специализированные эпителиальные клетки играют важную защитную роль в кишечнике, синтезируя и секретируя несколько медиаторов [24,25,26]. Wang et al. сообщили, что бокаловидные клетки (ГК) могут поглощать наночастицы [27], а Sun et al. обнаружили, что введенные внутривенно наночастицы распределяются в кишечных ГК [28]. Тем не менее, на сегодняшний день взаимодействие между наночастицами и кишечными ГК все еще подробно не исследовано. В частности, ни один отчет полностью не разъясняет, как эти наночастицы способны проникать в клетки GC и распределяются ли эти наночастицы в GC всей ткани кишечника. Чтобы прояснить путь выведения металлических наночастиц в ткани кишечника, очень важно выяснить, какую роль кишечные ГК играют в этом новом пути выведения наночастиц. Поскольку наночастицы металлов могут выводиться через HBS и попадать в кишечник, поэтому мы сосредоточились на различении экскреции, опосредованной HBS, от экскреции, опосредованной кишечными ГК (Схема 1).

В этом исследовании мы выбрали четыре типа обычных металлических наночастиц, таких как магнитные наночастицы, наночастицы серебряного треугольника, нанокластеры золота и наностержни золота в качестве объектов исследования. Благодаря характерным оптическим свойствам золотых наностержней, они служили инструментом для наблюдения за распределением наночастиц в кишечнике с помощью двухфотонного возбуждения, тогда как другие три типа частиц служили репрезентативными примерами различных других металлических наноматериалов. Модели мышей получали с перевязкой общего желчного протока для предотвращения связи между HBS и кишечным трактом. Металлические наночастицы вводили мышам через хвостовую вену, затем выращивали голых мышей и собирали фекалии в течение 7 дней, после чего животных умерщвляли, собирали ткани кишечного тракта и желудочные ткани, готовили срезы и, наконец, анализировали. с использованием просвечивающего электроскопа высокого разрешения и ICP-MS для исследования распределения металлических наночастиц в тканях кишечника. Кроме того, присутствие металлических наночастиц было измерено в кале мышей с перевязкой CBD. Более того, в этом исследовании, чтобы в дальнейшем раскрыть механизм секреции наночастиц ГК и ПК, мы использовали недавно разработанную модель диареи у мышей, вызванной китайскими травами.

Материалы и методы

Синтез и характеристика треугольных серебряных нанопластин

Треугольные серебряные нанопластинки были синтезированы с помощью процедур, ранее описанных Миркиным [29] и его коллегами с некоторыми модификациями [30]. В типичном эксперименте при комнатной температуре с воздухом AgNO ₃ (0,1 мМ, 100 мл), тринатрийцитрат (30 мМ, 6 мл), ПВП (молекулярная масса 30 кДа, 0,7 мМ, 6 мл) и 240 мкл H ₂ О ₂ (30 мас.%) Упорядоченно добавляли в колбу на 250 мл. После энергичного встряхивания объединенных растворов в колбе, 0,8 мл свежеприготовленного раствора 0,1 М NaBH ₄ был введен быстро. Через несколько секунд цвет раствора стал желтым, указывая на образование серебряных наносфер. В следующие несколько часов колбу помещали на солнечный свет или под люминесцентную лампу до тех пор, пока раствор не приобрел синий цвет без дальнейшего изменения цвета (не более 5 часов). А окончательный раствор хранили в холодильнике при 4 ° C для дальнейшего использования.

Спектр поглощения приготовленного раствора измеряли спектрометром UV-vis-NIR (UV-3600, Shimadzu, Япония) с использованием кюветы с оптическим путем 1 см. Спектры были получены в диапазоне от 200 до 950 нм со щелью 2 нм. Анализ с помощью просвечивающей электронной микроскопии проводили на JEM-200CX (JEOL, Япония) путем погружения медной сетки ТЕМ с углеродным покрытием в собирающиеся наночастицы в 1 мл деионизированной воды после центрифугирования всего 10 мл раствора в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл. при 6000 об / мин в течение 30 мин при 25 ° C. Всего из изображений ПЭМ было выбрано 200 треугольных серебряных нанопластинок, чтобы статистически вычислить распределение размеров их краев.

Суперпарамагнитный магнетит (Fe ₃ О ₄ ) наночастицы, нанокластеры золота и наностержни золота были синтезированы и охарактеризованы в соответствии с нашими предыдущими отчетами [31,32,33] и хранились при комнатной температуре.

Подготовка моделей животных с перевязкой общего желчного протока

Здоровые самки крыс линии Вистар (180–220 г) и самки грубых мышей (20–22 г) были получены от Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd. (Шанхай, Китай). Все эксперименты на животных проводились в соответствии с соответствующими законами и институциональными правилами. Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Шанхайского университета Цзяо Тонг (NO.SYXK2007-0025). Общий желчный проток был перевязан по методу, первоначально описанному Ли с некоторыми модификациями [34]. Вкратце, этих мышей анестезировали пентобарбиталом (25 мг / кг) и фиксировали на деревянном хирургическом полотне. Был сделан разрез в середине брюшной полости, и ткани брюшной полости были аккуратно отделены, чтобы четко обнажить CBD. Два стерильных нейлоновых медицинских хирургических шва (Shanghai Jinhuan Industry CO., Ltd., Шанхай, Китай) диаметром 0,2 мм были наложены под CBD, и на обоих концах сегмента CBD были наложены три узла (рис. 1б, в). Наконец, CBD был отрезан между двумя концами с последующим окончательным закрытием брюшной полости. На 14-й день после перевязки общего желчного протока у каждой мыши были взяты образцы крови для проверки основной функции печени.

Введение наночастиц в мышей

После завершения лигирования CBD 12 мышей случайным образом разделили на четыре группы:контрольная группа 1, тестовая группа с серебряными нанопластинами, тестовая группа с магнитными наночастицами и тестовая группа с нанокластерами золота. Дополнительная контрольная группа состояла из пяти мышей без лигирования CBD. Мышам в контрольных группах вводили внутривенную инъекцию 0,9% водного раствора NaCl, в то время как испытуемым группам вводили суспензию наночастиц, такую как треугольные серебряные нанопластинки, магнитные наночастицы, золотые наностержни и золотые нанокластеры в дозе 150 мкл ( 550 мкг / мл). Все четыре суспензии наночастиц перед использованием диспергировали ультразвуком в течение 1 мин. Мышей анестезировали путем ингаляции 5% изофлурана до расслабления мышечного тонуса, затем внутривенно вводили четыре вида суспензий наночастиц с помощью шприца объемом 1 мл соответственно.

Распределение наночастиц в тканях

На седьмой день после инъекции суспензии металлических наночастиц мышей анестезировали, извлекали их кишечные ткани, фиксировали в 10% формальдегиде в течение 24 часов и затем заливали парафином. Ротационный микротом Leica RM2135 использовали для приготовления срезов фиксированных образцов толщиной 5 мкм. Наконец, срезы обезвоживали спиртом и окрашивали гематоксилином и эозином. Срезы образцов наблюдали под фазово-контрастным микроскопом (Olympus, RX-71, Япония).

На седьмой день после инъекции суспензии металлических наночастиц ткани кишечника и желудка собирали сразу после скарификации мышей и фиксировали в 2,5% растворе глутаральдегида. Фиксированные образцы были последовательно дегидрированы в этаноле и залиты эпоксидной смолой. После этого был изготовлен ультратонкий образец кишечника и исследован с помощью ПЭМ высокого разрешения (FEI, Tecnai G2 Spirit Biotwin, США).

В тот же день их кишечные ткани были собраны сразу после умерщвления и визуализированы с помощью системы визуализации in vivo (система визуализации IVIS-100, Caliper) в сочетании с камерой с холодным зарядовым устройством (CCD) и красным флуоресцентным белком. (DsRed) фильтр (Caliper Life Sciences). Изображения и измерения флуоресцентных сигналов были получены и проанализированы с помощью программного обеспечения Living Image 3.2 (Caliper Life Sciences).

Металлическое содержание фекалий

Кроме того, фекалии всех мышей собирали в течение 7 дней после инъекции, фекалии взвешивали и переваривали царской водкой при нагревании. Наконец, содержание металлов в растворе определяли с помощью ICP-MS (Agilent 7500a, США).

Приготовление экстрактов китайских трав

Экстракты листьев сенны 10 г, ревеня 2 г и фрукта каннабиса 1 г добавляли к 100 мл воды, нагревали до 100 ° C в течение 10 мин, а затем фильтровали через два слоя марли [35]. Наконец, фильтраты собирали и концентрировали до 0,3 г / мл при пониженном давлении. Экстракты листьев сенны получали, как показано ниже, и хранили при 4 ° C перед проведением испытаний.

Анализ бокаловидных ячеек

Во-первых, шесть мышей-самцов Kunming были случайным образом разделены на две группы:контрольную группу и группу диареи; оба получали физиологический раствор и экстракты китайских трав ежедневно в течение 7 дней через желудочный зонд (0,1 мл) соответственно. На седьмой день после введения через желудочный зонд мышей умерщвляли, ткани кишечника собирали, ткани кишечника и желудка замораживали в Tissue Tek OCT и делали срезы на криостате Leica CM 1510 S (Sakura Funetek, США). Срезы размером 8 мкм окрашивали Alcian Blue (1% Alcain Blue 8GX в 3% ледяной уксусной кислоте) в течение 5 минут и, наконец, промывали в дистиллированной воде. Этот образец был окислен 1% -ной периодической кислотой перед промывкой, а затем обработан в течение 15 минут в реактиве Шиффа. Изображения срезов ткани регистрировали с помощью инвертированного микроскопа. Ткани желудка собирали на положительно заряженные предметные стекла для двухфотонной люминесцентной визуализации.

Содержание золота в кишечных тканях и кале

Вкратце, 9 мышей-самцов Kunming были разделены на каждую из трех групп в соответствии с различным лечением:контрольная группа, группы лигирования и группы лигирования + диареи. Затем этим мышам внутривенно вводили 100 мкл ЗНР (1 мг / мл). На второй день после инъекции в хвостовую вену контрольную группу и группу лигирования обрабатывали физиологическим раствором, в то же время группы лигирования + диареи обрабатывали экстрактами китайских трав. Доза лечения оставалась постоянной и вводилась ежедневно в течение следующих 7 дней через желудочный зонд (0,1 мл). На седьмой день мышей умерщвляли, ткани кишечника замораживали в Tissue Tek OCT и делали срезы на криостате Leica CM 1510 S (Sakura Funetek, США). Срезы (8 мкм) собирали на положительно заряженных предметных стеклах для визуализации двухфотонной люминесценции. После инъекции собирали фекалии всех мышей. Кал взвешивали и переваривали царской водкой при нагревании. Наконец, содержание золота в растворе определяли с помощью ICP-MS (Agilent 7500a, США).

Статистический анализ

Каждый эксперимент повторяли трижды в двух экземплярах. Результаты были представлены как среднее ± стандартное отклонение. Статистические различия оценивались с использованием t тестировать и рассматривать на P <0,05.

Результаты и обсуждение

Синтез и характеристика наночастиц

Треугольные нанопластинки серебра были синтезированы методом быстрого термического синтеза и обладают хорошей растворимостью в воде. Что еще более важно, особая треугольная форма этих наночастиц позволяет легко идентифицировать их с помощью электронной микроскопии. Как показано на рис.1, в УФ-видимом спектре приготовленные наночастицы серебра показали сильный пик при 648,5 нм, соответствующий полосе плазмонов на поверхности диполя в плоскости, и два умеренных пика на более низких длинах волн, соответствующих плоскости (482 нм) и квадрупольный резонанс вне плоскости (333 нм), что указывает на формирование треугольной архитектуры [36], что дополнительно подтверждается ПЭМ-изображением наночастиц серебра, собранных после центрифугирования. ПЭМ-изображение (рис. 1b) показало, что приготовленные партии действительно содержали субпопуляцию серебряных наносфер, что, возможно, вносило вклад в пик ППР при 389 нм [36]. Длина края собранных треугольных серебряных нанопластинок составляла 44,3 нм с хорошим монодисперсным распределением.

Были приготовлены магнитные наночастицы диаметром 20 нм и нанокластеры Au диаметром 5 нм, и их характеристики показаны в дополнительном файле 1:рис. S1 и S2 соответственно. ПЭМ-изображения и УФ / видимые спектры наностержней Au показаны в дополнительном файле 1:Рисунок S3.

Подготовка моделей мышей для лигирования CBD

Лигирование общего желчного протока (CBD) - хорошо известная экспериментальная модель, используемая для индукции холестатического фиброза печени [37, 38]. Здесь мы провели эксперименты на мышах с лигированием CBD, чтобы полностью заблокировать связь между HBS и кишечным трактом (рис. 2a, b), убедившись, что металлические нанопластинки транспортируются только кровотоком в ткани кишечника после внутривенной инъекции. По сравнению с нормальным контролем, обработанные группы показали сильное увеличение диаметра и толщины стенки общего желчного протока через 14 дней после лигирования CBD из-за застоя желчи (рис. 2d). Кроме того, как показано на фиг. 2e, уровни TBIL и AST в группе лигирования были значительно выше, чем в группе с контрастированием. Эти результаты свидетельствуют о том, что после успешного построения модели мышей с лигированием CBD общий желчный проток был полностью заблокирован и что связь между HBS и кишечным трактом была полностью отключена, что привело к холестазу и холестатическому фиброзу печени [39].

Влияние четырех видов наночастиц на ткани кишечника

Обычно кишечный эпителий обеспечивает полупроницаемый барьер, который позволяет небольшому количеству молекул разного размера и характеристик проходить через интактный эпителий как активными, так и пассивными механизмами. Как правило, чем крупнее молекула, тем меньше вероятность того, что она преодолеет этот барьер. Однако, как только слизистая оболочка кишечника воспаляется или повреждается, кишечному эпителию становится труднее удерживать инородные и крупные частицы, поскольку пространства между клетками открываются [40, 41]. Учитывая, что наночастицы могут быть причиной патологических изменений тканей кишечника и, как следствие, увеличения проницаемости стенки кишечника, что приводит к прохождению наночастиц через стенку кишечника, мы провели гистопатологическое исследование тканей кишечника после воздействия четыре различных типа наночастиц:магнитные наночастицы, наночастицы серебряного треугольника, золотые наностержни и золотые нанокластеры. Как показано на рис. 3, не наблюдалось никаких существенных различий между контрольными группами и тестовыми группами, а также не было других гистологических изменений, таких как воспалительный инфильтрат [42]. Результаты показывают, что эти металлические наночастицы не вызывали патологических изменений тканей кишечника, что исключает возможность утечки наночастиц из промежутков между клетками.

Распределение металлических наночастиц в кишечных ГК

ГК являются одним из четырех основных типов клеток, присутствующих во всем кишечном тракте, и отвечают за производство и сохранение защитного слоя слизи путем синтеза и секреции высокомолекулярных гликопротеинов, известных как муцины, которые способствуют удалению содержимого кишечника и обеспечивают первую линию защиты от физических и химических повреждений, вызванных проглоченной пищей, микробами и микробным продуктом [43, 44]. ГК были легко идентифицированы благодаря большому количеству слизи. Как показано на рис. 6, треугольные серебряные нанопластинки были расположены внутри кишечных ГК по всему кишечному тракту, и можно было получить различные фазы их секреции из ГК. На рисунке 4d показано, как несколько треугольных нанопластинок серебра были выделены в кишечник с помощью ГХ. Рисунок 4e показывает, что некоторые треугольные серебряные нанопластинки, инкапсулированные в слизистом содержимом кишечных ГК, были готовы к секретированию. На рис. 4е показано, как некоторые треугольные серебряные нанопластинки были вытеснены из ГХ, в то время как другие все еще находились в нем. Из изображений ПЭМ мы обнаружили, что некоторые треугольные серебряные нанопластинки были показаны в режиме агрегации (рис. 4 (a2, d и e), зеленые стрелки), тогда как другие были в режиме дисперсии (рис. 4 (a1, b1, b2, c1, c2 и f), белые стрелки). Агрегация - обычное явление для наночастиц, и обычно наблюдается, когда их концентрация в клетках сильно увеличивается [45]. Напротив, уменьшение концентрации наночастиц препятствует их агрегации.

Аналогичные результаты наблюдались для нанокластеров золота, магнитных наночастиц и золотых наностержней, как показано в Дополнительном файле 1:Рисунок S4, S5 и S6. Эти результаты ясно показали, что эти три типа металлических наночастиц расположены внутри GC кишечного тракта, косвенно подтверждая, что эти металлические наночастицы могут быть удалены с помощью пути GC.

Хотя GC распределены по всей линии кишечного тракта, их вклад в общий объем эпителия неодинаков. В тонком кишечнике мышей объемная плотность ГК прогрессивно увеличивается от двенадцатиперстной кишки к подвздошной кишке. Эта тенденция продолжается и в толстом кишечном тракте, при этом плотность GC в эпителии толстой кишки также увеличивается от проксимального к дистальному отделу, от толстой кишки к прямой кишке [43]. Основываясь на том факте, что треугольные серебряные нанопластинки, магнитные наночастицы и нанокластеры золота существуют в кишечных ГК по всему кишечному тракту, и что вклад ГК в общий объем эпителия совершенно другой, мы полагаем, что толстый кишечник может быть основным место выведения кишечных ГК.

Из-за их характерной формы треугольные серебряные нанопластинки легко распознавались с помощью ПЭМ-изображений в местах, описанных в предложенном пути достижения GC. Однако, хотя магнитные наночастицы и нанокластеры золота нельзя было отличить от других структур с помощью этого метода, Дополнительный файл 1:Рисунок S4 показывает, что в кишечном тракте группы лигирования CBD все еще есть определенное количество нанокластеров золота, что приводит нас к вывод о том, что вышеупомянутый механизм экскреции GC применим и к другим типам металлических наночастиц.

Кроме того, как показано в дополнительном файле 1:фиг. S7, результаты ICP-MS ясно показывают, что эти наночастицы все еще могут секретироваться из тела лигированной мыши. Эти результаты доказали, что бокаловидные клетки тканей кишечника участвуют в важном пути выведения наночастиц.

Возможный механизм транспорта металлических наночастиц в кишечном кровеносном сосуде

Упомянутые выше результаты демонстрируют, что эти четыре типа металлических наночастиц (магнитные наночастицы, наночастицы серебряного треугольника, золотые наностержни и золотые нанокластеры) были распределены в GC по всему кишечному тракту, но способ, которым наночастицы попадают в GC, все еще не был выяснил. Поскольку модели мышей с лигированием CBD обрабатывали суспензией металлических наночастиц посредством инъекции в хвостовую вену, эти наночастицы могли переноситься только током крови в сосуды кишечника. Как показала ПЭМ-визуализация, некоторые треугольные серебряные нанопластинки действительно были расположены в тельце крови (рис. 5а, белые стрелки). Более того, предыдущие исследования показали, что наночастицы небольшого размера могут доставляться тельцами крови по всей системе кровообращения [46]. На рис. 5б видно, что некоторые треугольные серебряные нанопластинки проходят через мембрану кровеносных сосудов (зеленые стрелки), а некоторые треугольные серебряные нанопластинки расположены в тельце крови (красные стрелки). Таким образом, как показано на рис. 8, мы делаем вывод, что треугольные нанопластинки серебра транспортировались тельцами крови, а затем высвобождались в плазму с последующим прохождением через мембрану сосудистой стенки сосудов кишечника и, наконец, достижением ГК.

Анализ бокаловидных клеток

Бокаловидные клетки играют ключевую роль в пути выведения наночастиц. В этом исследовании мы обнаружили, что наночастицы металлов могут секретироваться этими бокаловидными клетками. Следуя этому заявлению, если процесс секреции бокаловидных клеток ускорится, теоретически возможно, что выведение наночастиц также увеличится. Чтобы решить эту проблему, мы создали модель диареи, вызванной китайской травой, используемой в традиционной медицине. Чтобы изучить, как диарейные процессы влияют на секрецию ГК, был проведен гистологический анализ ГК кишечника. Следует признать, что повышенное количество бокаловидных клеток кишечной ткани увеличивает продукцию муцина [47]. Как показано на фиг. 6, в группах с диареей общее количество бокаловидных клеток в тонком и толстом кишечнике было значительно выше по сравнению с контролем. Кроме того, процент и количество кавитированных бокаловидных клеток в тканях кишечника были значительно выше в группах с диареей по сравнению с контролем. Эти наблюдения позволяют утверждать, что количество клеток ткани кишечника увеличивается в ответ на диарею, что свидетельствует об увеличении экскреции GC. Эти результаты согласуются с данными, сообщенными ранее [47].

Содержание золота в тканях кишечника и фекалиях

Сообщалось, что поперечное сечение двухфотонного действия (TPACS) наностержня может достигать 2320 GM, что намного выше, чем у органических флуорофоров, и находится в диапазоне квантовых точек, обеспечивая многообещающий подход к обнаружению распределение золотых наностержней в биологических тканях с помощью двухфотонного возбуждения [48, 49]. В этой части исследования для наблюдения за распределением наночастиц в кишечнике в группах лигирования и группах лигирования + диареи измеряли двухфотонную люминесценцию ядра AuNR. Как показано на фиг. 7, содержание золота в тонком и толстом кишечнике было значительно выше для групп с лигированием по сравнению с теми, которые наблюдались в группах с лигированием + диареей. Содержание элементарного золота в тканях кишечника определяли количественно с помощью ICP-MS через 7 дней после инъекции в хвостовую вену. Содержание золота в тканях кишечника было значительно выше в группах лигирования по сравнению с группами лигирования + диареи ( P <0,001) на протяжении всего исследования (рис. 7). Эти результаты показывают, что уровень выделяемых бокаловидными клетками диареи наночастиц выше, чем у любой другой группы.

В следующем эксперименте мы проанализировали содержание золота в кале мышей. Как показано на рис. 8а, содержание золота в кале было значительно выше в контрольной группе по сравнению с таковым в группах лигирования или групп лигирования + диареи ( P <0,001). Более того, в группах лигирования + диареи содержание золота было значительно выше, чем в группах лигирования (рис. 8а). Эти результаты предполагают, что диарея ускоряет процесс секреции наночастиц бокаловидными клетками кишечника. В сочетании с количественным анализом золотых элементов в кале мы дополнительно доказали, что бокаловидные клетки тканей кишечника участвуют в важном пути выведения наночастиц.

Влияние париетальных клеток на желудочную секрецию металлических наночастиц

Париетальные клетки в основном расположены в нижней части желудка и тела желудка, которые выделяют соляную кислоту и внутренний фактор. Кроме того, мы обнаружили, что нанокластеры золота распределяются в тканях желудка мышей с лигированием CBD (дополнительный файл 1:рисунок S4B). Таким образом, мы предположили, что париетальные клетки могут участвовать в экскреции наночастиц. Как и ожидалось, из изображений двухфотонной люминесценции было обнаружено, что золотые наностержни распределены в тканях желудка (рис. 9a, b). Кроме того, как показано на рис. 9c, d, мы наблюдали, что треугольные серебряные нанопластинки распределены в париетальных клетках ткани желудка. В сочетании с результатами предыдущих исследований мы предполагаем, что париетальные клетки участвуют в секреции наночастиц.

Выводы

Таким образом, мы успешно подготовили и применили треугольные серебряные нанопластинки, магнитные наночастицы, золотые наностержни и золотые нанокластеры в качестве отслеживающих агентов. Мышей с лигированием CBD лечили предварительно приготовленными наночастицами путем инъекции в хвостовую вену для изучения распределения желудочно-кишечной ткани и выведения этих наночастиц. Мы также проанализировали пути выведения нанокластеров золота и магнитных наночастиц. Следует отметить, что нанокластеры золота в основном удаляются через мочевой путь почек, тогда как магнитные наночастицы в основном удаляются из организма через путь HBS. Поскольку экскреторные возможности почек и HBS для применения металлических наночастиц in vivo очень ограничены, путь экскреции GC и PC может обеспечить еще один важный альтернативный способ выведения этих наночастиц. Что касается этой проблемы, мы также обнаружили, что процесс выделения наночастиц из GC и PC ускоряется диареей, что еще раз доказывает, что GC и PC представляют собой важный путь для выведения металлических наночастиц. По общему признанию, наши знания все еще ограничены в отношении клиренса наночастиц in vivo, как, например, конкретный механизм, лежащий в основе путей секреции GCs и PCs, и эффективность клиренса наночастиц в кишечных GC, поэтому срочно необходимы дальнейшие исследования. Подводя итог, можно сказать, что этот новый путь удаления металлических наночастиц in vivo имеет большой потенциал для краткосрочных применений, таких как дизайн и разработка новых лекарств, маркировка на основе наночастиц и отслеживание in vivo, а также оценка биобезопасности наночастиц in vivo.

Сокращения

CBD:: Общий желчный проток
CCD:: Устройство с зарядовой связью
GC:: Бокалы
GNR:: Золотые наностержни
HBS:: Гепато-билиарный
ПК:: Париетальные клетки
System Fe ₃ О ₄ :: Суперпарамагнитный магнетит
ТЕМ:: Просвечивающая электронная микроскопия
TPACS:: Сечение двухфотонного действия

Исследование ZrO2 прямой струйной печати и центрифугирования для тонкопленочных транзисторов IGZO с напылением Простое приготовление нанокомпозитов углеродные нанотрубки-Cu2O в качестве новых катализаторных материалов д…

Наноматериалы