Выведение металлических наночастиц через кальцивидные клетки: в vivo путь, ускоряемый диареей, вызванной китайскими травами

Аннотация

Несмотря на широкое применение металлических наночастиц в медицине, механизмы их выведения из организма остаются недостаточно изученными. В данном исследовании мы показываем, что кишечные кальцивидные клетки (ГК) и желудочные кавчаточные клетки (КК) активно транспортируют ряд металлических наночастиц — треугольные серебряные нанопластины, магнитные наночастицы, золотые наностержни и золотые нанокластеры — в просвет кишечника, откуда они экскретируются с калом. Используя модель мышей с лигатурой общего желчного протока (ОЖП) для блокировки гепато-билиарного пути, мы демонстрируем, что эти наночастицы накапливаются внутри ГК по всему кишечному тракту, а также внутри КК (для серебряных нанопластин и золотых наностержней). Патологических изменений в тканях кишечника не наблюдалось. Более того, скорость секреции наночастиц ГК и КК существенно увеличивалась в модели диареи, вызванной экстрактом китайских трав, что указывает на модулирующее влияние кишечной подвижности на экскрецию наночастиц. Эти результаты раскрывают ранее неизвестный путь очищения, который может способствовать созданию более безопасных наночастиц для терапевтики и диагностики.

Введение

Нанотехнологии стремительно внедряются в фармацевтику, диагностику и промышленность, однако риски для здоровья и окружающую среду, связанные с инженерируемыми наноструктурами, остаются не до конца понятыми. Нанотоксикология — междисциплинарная область, изучающая взаимодействие наночастиц с биологическими системами, оценку потенциальных опасностей и разработку стандартов безопасности [1–3]. Металлические наночастицы — золото, серебро, магнитные, квантовые точки — вызывают особый интерес благодаря своим оптическим, магнитным и каталитическим свойствам, позволяющим реализовывать таргетированную визуализацию, фототермическую терапию и доставку лекарств [4–10]. Однако те же физико-химические характеристики, обеспечивающие функциональность, препятствуют биодеградации и выведению: большинство частиц размером более ~5 нм не проходят почечную фильтрацию, а крупные агрегаты депонируются в печени, селезенке или легких [11–12]. Понимание путей элиминации критически важно для терапевтической безопасности и оценки рисков.

Существующие знания о в vivo путях выведения фрагментарны. Гепато-билиарная система (ГБС) выводит неразлагаемые почкими частицы с калом, а почечно-мочевой путь утилизирует частицы менее 5 нм [16,21,22]. Оба маршрута показывают ограниченную эффективность для многих металлических наночастиц, что стимулирует поиск альтернативных механизмов. Недавние работы показывают, что кишечная стенка может служить экскреторным путем: кремнеземные наночастицы накапливались в слизистой и кале мышей, а крупные частицы (до 500 нм) устранялись быстрее мелких у рыб, что указывает на существование путей, отличных от ГБС [20,23].

Кальцивидные клетки (ГК) — поляризованные эпителиальные клетки, выделяющие слизь по всему кишечнику и защищающие от механических и химических повреждений [24–26]. Ранее показано, что ГК способны интернализацию наночастиц, а внутривенно введенные частицы обнаруживались в ГК, но динамика и масштаб процесса оставались неясными [27–28]. Цель данного работы — выяснить роль ГК и, в меньшей степени, желудочных кавчаточных клеток (КК) в экскреции репрезентативного набора металлических наночастиц, а также оценить влияние кишечной подвижности, модулируемой моделью диареи, индуцируемой китайскими травами, на этот путь.

Материалы и методы

Синтез и характеристика треугольных серебряных нанопластин

Треугольные серебряные нанопластины синтезировали по протоколу Миркина с незначительными изменениями [29,30]. Кратко: смешивали AgNO₃ (0,1 мМ, 100 мл), тринатрий цитрат (30 мМ, 6 мл), ПВП (30 кДа, 0,7 мМ, 6 мл) и 240 мкл H₂O₂ (30 масс.%) при комнатной температуре. После интенсивного перемешивания быстро добавляли 0,8 мл свежего 0,1 М NaBH₄, получая желтый раствор, который окрашивался в синий через 5 часов под светом. Суспензию хранили при 4 °C.

UV-Vis спектры записывали (200–950 нм, щель 2 нм) на Shimadzu UV-3600. TEM (JEOL JEM-200CX) подтвердил монодисперсные треугольные частицы со средней длиной ребра 44,3 нм (Рис. 1b). Характерный плазмонный пик при 648,5 нм подтвердил успешный синтез треугольной морфологии [36].

Подготовка моделей животных с лигатурой общего желчного протока

Самок крыс Вистар (180–220 г) и мышей Куньмин (20–22 г) получали от Shanghai SLAC Laboratory Animal Co. Ltd. Все процедуры одобрены Комитетом по уходу и использованию лабораторных животных Шанхайского университета Цзяо Тун (№ SYXK2007-0025). Лигатуру ОЖП выполняли по методу Ли с модификациями [34]. Мышей анестезировали пентобарбиталом (25 мг/кг), делали срединный брюшной разрез, изолировали ОЖП. Две найлоновые нити (0,2 мм) подкладывали под проток, создавали герметичный сегмент и перерезали его. На 14-й день после лигатуры измеряли уровень билирубина и АСТ в сыворотке для подтверждения холестаза (Рис. 2e).

Инъекция наночастиц

После подтверждения успешной лигатуры 12 мышей случайно распределяли на четыре экспериментальные группы (треугольные Ag нанопластины, магнитные наночастицы, Au наностержни, Au нанокластеры) и контрольную группу (физраствор). Наночастицы взвешивали в концентрации 550 мкг/мл, соницировали 1 мин и вводили внутривенно (150 мкл, хвостовая вена). Дополнительные 5 мышей без лигатуры служили вторым контролем.

Обработка тканей и визуализация

Через 7 дней после инъекции мышей эвтаназировали, собирали кишечные и желудочные ткани. Срезы (5 мкм) фиксировали в 10% формальдегиде, парафинизировали и окрашивали гемоксилином-эозином для гистологии. Для ультразвуковой структуры ткани фиксировали в 2,5% глютаральдегиде, дегидратировали, заливали эпоксидной смолой и изучали высокорозрешающим TEM (FEI Tecnai G2 Spirit Biotwin). Двухфотонное возбуждение (780 нм) использовали для визуализации Au наностержней в срезах на системе Caliper IVIS-100.

Квантификация металлов

Кал собирали ежедневно в течение 7 дней, взвешивали и минерализовывали в царской воде. Содержание металлов определяли ИСП-МС (Agilent 7500a). Аналогично минерализовывали и анализировали кишечные ткани на золото для оценки удержания.

Модель диареи, индуцированная китайскими травами

Смесь листьев сенны (10 г), ревня (2 г) и плодов конопли (1 г) варили в 100 мл воды, фильтровали и концентрировали до 0,3 г/мл. Мышам вводили 0,1 мл экстракта или физраствора ежедневно в течение 7 дней через зонд для индукции диареи.

Анализ кальцивидных клеток

Кишечные сегменты встраивали в OCT, делали срезы (8 мкм) и окрашивали синим алцианом/реактивом Шилла для квантификации плотности ГК и кавитации. Изображения получали на инвертированном микроскопе.

Результаты и обсуждение

Синтез и характеристика наночастиц

Треугольные Ag нанопластины показывали сильный SPR пик при 648,5 нм и узкое распределение размеров (среднее ребро 44,3 нм), подтверждая успешный синтез (Рис. 1a–c). Магнитные наночастицы (20 нм) и Au нанокластеры (5 нм) получали по установленным протоколам [31–33]. Au наностержни продемонстрировали ожидаемый продольный плазмонный резонанс в ближнем ИК диапазоне.

Валидация модели лигатуры ОЖП

Лигатура ОЖП вызвала выраженную дилатацию протока и повышение сывороточного ТБИЛ и АСТ относительно шам-контроля (Рис. 2d–e), подтверждая эффективную изоляцию гепато-билиарного пути и индукцию холестаза.

Гистологическое влияние наночастиц

Окраска гемоксилином-эозином не выявила значимого воспаления или повреждения эпителия ни в одной экспериментальной группе по сравнению с контролями (Рис. 3). Это указывает на то, что введенные наночастицы не нарушают барьерную функцию кишечника.

Локализация наночастиц в кальцивидных клетках

TEM визуализация показала, что треугольные Ag нанопластины присутствуют в ГК по всему тонкому кишечнику, подвздошной кишке и толстой кишке, часто в агрегированном и диспергированном состояниях (Рис. 4). Аналогичное распределение наблюдалось для магнитных наночастиц, Au нанокластеров и Au наностержней (Доп. файлы S4–S6). Агрегация, вероятно, отражает высокую локальную концентрацию, а диспергацию — низкую загрузку.

Количественный ИСП-МС кишечных тканей подтвердил, что уровень металлов выше у мышей с лигатурой ОЖП, чем у контролов, тогда как fekальное содержание металлов было значительно снижено в лигированной группе, что подчеркивает вклад ГК в экскрецию (Рис. 8).

Механизм транспорта в ГК

Наночастицы обнаруживали внутри циркулирующих эритроцитов и наблюдали их проникновение через сосудистую стенку в ламина проприа, откуда они попадали в ГК (Рис. 5). Это указывает на то, что размер и поверхностная химия частиц обеспечивают пассивную диффузию через эндотелиальные мембраны в слизистый слой.

Влияние диареи на экскрецию наночастиц

Модель диареи увеличивала плотность ГК и долю кавитированных клеток (Рис. 6), что коррелировало с ускоренной секрецией наночастиц из ГК. Двухфотонная визуализация Au наностержней показала снижение удержания в тканях и увеличение fekального золота у мышей с диареей по сравнению с лигированными контролями (Рис. 7). Эти данные демонстрируют, что кишечная подвижность может модулировать ГК-медированный путь очищения.

Секреция, медиаруемая кавчаточными клетками

Au нанокластеры и Ag нанопластины также обнаруживали внутри желудочных кавчаточных клеток (КК) (Рис. 9). Хотя вклад КК кажется меньше, чем ГК, эти данные предполагают, что КК могут обеспечивать дополнительный экскреторный путь для определенных типов наночастиц.

Заключение

Наше исследование устанавливает ранее нераспознанный ГК- и КК-медированный путь выведения разнообразных металлических наночастиц в vivo. Лигатура ОЖП позволила изолировать этот маршрут от ГБС и показать, что наночастицы активно транспортируются из кровотока в просвет кишечника через ГК, а КК способствуют желудочной экскреции. Важно, что диарея, индуцированная экстрактом китайских трав, существенно ускоряет этот процесс, подчеркивая возможность манипулирования кишечной подвижностью для усиления выведения наночастиц. Эти данные открывают путь к более безопасному проектированию наночастиц для терапевтики, улучшенному in vivo трекингу и более точной оценке биобезопасности.

Аббревиатуры

ОЖП

Общий желчный проток

ГК

Кальцивидные клетки

AuНС

Золотые наностержни

ГБС

Гепато-билиарная система

КК

Кавчаточные клетки

TEM

Трансмиссионная электронная микроскопия

ИСП-МС

Масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой