Неогликопротеин-функционализированные флуоресцентные золотые нанокластеры для детекции растительных лектинов и визуализации дендритических клеток

Аннотация

Углевод-белковые взаимодействия лежат в основе существенных биологических процессов, таких как оплодотворение, сигнальная трандукция и хозяин-патогенная коммуникация. Сложная природа гликанового распознавания требует передовых аналитических инструментов. Здесь мы сообщаем о первом синтезе неогликопротеин-функционализированных флуоресцентных золотых нанокластеров (G0-OVA-AuNCs), сочетающих биантеннарный N-гликан (G0) как таргетирующий лиганд, овалбумин как переносной белок и самосветящееся золотое ядро. Мы демонстрируем, что G0-OVA-AuNCs служат селективными сенсорами для растительных лектинов и мощными зондами для визуализации мышиных дендритических клеток.

Введение

Золотые нанокластеры (AuNCs), состоящие из 10–100 атомов золота, демонстрируют размерозависимую флуоресценцию, делая их привлекательными для биосенсоринга и визуализации. В отличие от традиционных органических красителей или квантовых точек, AuNCs обладают большим Стоксовым сдвигом, красным-ближним ИК излучением и превосходной фотохимической стабильностью, позволяя приложения в окне прозрачности тканей. Белково-шаблонированные AuNCs были впервые сообщены с сывороточным альбумином грызуна в 2009 году и с тех пор стали универсальной платформой для проектирования водорастворимых, биосовместимых флуорофоров. Гликозилированные белки, однако, остаются недостаточно изученными как шаблоны для нанокластеров, несмотря на критическую роль гликанов в модуляции белкового сворачивания, стабильности и рецепторного связывания. Синтетические неогликопротеины — белки, химически конъюгированные с определёнными углеводами — предлагают стратегию наделения белков новыми функциональными свойствами с сохранением их структурной целостности.

В этом исследовании мы использовали синтетический биантеннарный G0 гликан, конъюгированный к овалбумину (OVA) через C5 аминовый линкер и дискцинимаид суберата, для генерации G0-OVA-AuNCs. Мы исследовали их физико-химические характеристики, оценили доступность гликана через лектиновые агглютинационные анализы и оценили их способность маркировать дендритические клетки (DC) in vitro. Результаты устанавливают G0-OVA-AuNCs как надежные, мультивалентные лектиновые сенсоры и мощные визуализирующие агенты для иммунных клеток.

Результаты и обсуждение

Мы оптимизировали синтез G0-OVA-AuNCs, адаптируя протокол для неконъюгированных OVA-AuNCs. Раствор OVA 15 мг/мл смешивали с HAuCl₄·3H₂O (4,2 мМ) и NaOH (150 мМ) под микроволновым облучением (100 °C, 6 мин), давая бледно-коричневые кластеры, излучающие яркую красную флуоресценцию при 670 нм при возбуждении 350 нм. UV-Vis спектры не показывали плазмонного резонансного пика, подтверждая размеры частиц ниже 5 нм; TEM раскрыл средний диаметр ядра 1,9 ± 0,7 нм, а динамическое рассеяние света показало гидродинамический диаметр 8,7 ± 2,5 нм, согласующийся с инкапсуляцией ядра одним белком. Кластеры демонстрировали квантовый выход ~4% и оставались фотстабильными в диапазоне pH 3–11 и в фетальной грызуньей сыворотке, указывая на пригодность для биологических анализов.

a Схема синтеза OVA-AuNCs. b UV-Vis спектры OVA (синий) и OVA-AuNCs (оранжевый). Вставка: видимое (слева) и UV (365 нм, справа) изображения. c Агарозный гель OVA (Кумасси блю) и OVA-AuNCs (UV). Возбуждения (зелёный) и эмиссии (розовый) спектры OVA-AuNCs.

Для G0-функционализированных кластеров G0 гликаны конъюгировали к OVA с использованием DSS, давая неогликопротеины с 2–3, 3–4 или 5–6 гликанами на белок (подтверждено SDS-PAGE и MALDI-TOF). Последующее формирование AuNCs при идентичных условиях дало G0-OVA-AuNCs, чьи оптические свойства совпадали с OVA-AuNCs: абсорбция при 278 нм и пик эмиссии 670 нм. TEM подтвердил диаметр ядра 1,6 ± 0,5 нм. CD спектры указывали на случайную спираль вторичной структуры, вероятно, из-за щелочного синтеза, однако гликановые моиети оставались доступными для лектинового связывания.

a Синтез G0-OVA неогликопротеина (n = валентность). b SDS-PAGE OVA и G0-OVA вариантов. c MALDI-TOF спектры тех же образцов.

Лектиновые агглютинационные анализы с Bandeiraea simplicifolia лектином-II (BSL-II) и Solanum tuberosum лектином (STL) раскрыли концентрационно-зависимое кенчирование флуоресценции для G0-OVA-AuNCs (5/6), в то время как контрольный лектин (Aleuria aurantia, AAL) не дал эффекта. Кенчирование следовало линейным калибровочным кривым, давая пределы детекции 2,83 мкМ (BSL-II) и 2,35 мкМ (STL). G0-OVA-AuNCs с меньшим числом гликанов (2/3) не агглютинировали, подчёркивая необходимость мультивалентного гликанового представления. Агарозный гель электрофорез в средах для клеточных культур подтвердил, что лектиновое связывание оставалось эффективным в сложных биологических средах.

Лектиновая агглютинация G0-OVA-AuNCs (5/6). a Флуоресцентные спектры после инкубации с BSL-II. b F₀/F vs концентрация BSL-II. c Спектры после инкубации с STL. d F₀/F vs концентрация STL. e Спектры после инкубации с AAL. f UV изображения образцов; осадок наблюдался с STL.

Конфокальная микроскопия мышиных селезенковых DC (CD11c⁺), инкубированных с G0-OVA-AuNCs (3/4), продемонстрировала быструю интернализацию в течение 40 мин, с флуоресценцией, локализованной внутриклеточно и отсутствующей в необработанных контролах. 3D реконструкции подтвердили внутриклеточное распределение кластеров.

Поглощение DC G0-OVA-AuNCs (3/4). a Представительные изображения маркированных клеток. b Z-стек иллюстрирующий внутриклеточную флуоресценцию.

Подводя итог, мы представляем первые неогликопротеин-защищённые AuNCs, демонстрируем их селективное лектиновое распознавание через мультивалентные гликаны и устанавливаем их способность визуализировать дендритические клетки. Их надежная флуоресценция, водорастворимость и pH-стабильность делают их перспективными альтернативами традиционным красителям для исследований углевод-белковых взаимодействий и иммунологической визуализации.

Заключение

Мы успешно синтезировали и охарактеризовали G0-OVA-AuNCs, подтвердив доступность гликана и лектино-специфическую агглютинацию. Мультивалентное гликановое представление было существенным для эффективного перекрёстного связывания, в то время как кластеры сохраняли высокую фотстабильность и водорастворимость. In vitro визуализация мышиных дендритических клеток подтвердила кластеры как мощные, самофлуоресцентные зонды. Эти выводы поддерживают дальнейшее изучение неогликопротеин-функционализированных AuNCs как универсальных инструментов для анализов углевод-белковых взаимодействий, визуализации иммунных клеток и потенциальных терапевтических приложений.

Методы/Экспериментальная часть

Материалы

Все растворы готовили в нанопурной воде (18 МОм·см). Хлорид золота (III) тригидрат, NaOH и триэтиламин были от Sigma-Aldrich. Овалбумин приобрели у Hyglos. DSS и DMSO от Thermo Fisher. G0 гликан синтезировали как описано ранее.

Синтез AuNCs. Общая процедура

15 мг/мл белка в нанопурной воде смешивали с 4,2 мМ HAuCl₄·3H₂O, помешивали 5 мин, затем добавляли 150 мМ NaOH. Смесь нагревали при 100 °C в течение 6 мин в микроволновом реакторе. Кластеры диализировали (10 кДа MWCO) против нанопурной воды. Флуоресценция регистрировали на пластинчатом ридере Varioskan Flash (λ_эк=350 нм). Агарозный гель (0,75%) и TEM (200 кВ) использовали для размера. CD оценивали вторичную структуру. XPS определяли степени окисления золота.

Лектиновый агглютинационный анализ

G0-OVA-AuNCs (0,2 мг/мл) смешивали с лектинами (AAL, STL, BSL-II) при 0–10 мкМ в буфере TSM. После ночной инкубации образцы центрифугировали и флуоресценцию supernatанта измеряли. Осадок наблюдали под UV для STL.

Изоляция мышиных селезенковых DC

Селезенки от мышей C57BL/6J обрабатывали в одноклеточные суспензии. CD11c⁺ клетки изолировали магнитно-активированным клеточным сортированием (Miltenyi) и культивировали на покрытых поли-D-лизином стеклышках.

Поглощение DC G0-OVA-AuNCs

DC (2 × 10⁶ клеток) инкубировали с 150 мкг/мл G0-OVA-AuNCs (3/4) в течение 40 мин при 37 °C, вымывали, фиксировали 3% PFA и визуализировали на конфокальном микроскопе Zeiss LSM 510 (365 нм лазер, 63× масло объектив).

Аббревиатуры

AAL:

Aleuria aurantia лектин

AuNCs:

Золотые нанокластеры

BSA:

Сывороточный альбумин грызуна

BSL-II:

Bandeiraea simplicifolia лектин-II

CD:

Циркулярная дихроизм

CLRs:

C-тип лектиновые рецепторы

DCs:

Дендритические клетки

DMSO:

Диметилсульфоксид

DSS:

Дискцинимаид суберата эфир

FBS:

Фетальная грызунья сыворотка

G0:

Биантеннарный N-гликан

G0-OVA-AuNCs:

Неогликопротеин-функционализированные золотые нанокластеры

HAuCl₄·3H₂O:

Тетрахлороаурат (III) кислота

IMDM:

Модифицированная среда Дюльбекко Искова

IR:

Инфракрасный

LOD:

Предел детекции

MACS:

Магнитно-активированное клеточное разделение

OVA:

Овалбумин

QY:

Квантовый выход

STL:

Solanum tuberosum лектин

TEM:

Трансмиссионная электронная микроскопия

XPS:

Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия