Оксид графена, функционализированный с помощью микроволн, как контролируемая наносистема внутриклеточной доставки лекарств для синергетической противоопухолевой активности

Введение

Рецептор HER2 является членом семейства рецепторов EGFR, который опосредует рост и дифференцировку раковых клеток и сильно сверхэкспрессируется в 20–30% случаев рака груди человека, что приводит к метастатическому фенотипу опухоли и плохому прогнозу [1]. HER2 также сверхэкспрессируется примерно в 20% случаев рака желудка у человека [2]. Трастузумаб, гуманизированное моноклональное терапевтическое антитело, демонстрирует многообещающие терапевтические преимущества в качестве терапии первой линии у пациентов с раком молочной железы с гиперэкспрессией HER2 [3]. Однако общий уровень ответа на трастузумаб остается умеренным:15–30% при лечении в виде единой терапии и 50–75% при использовании в сочетании с химиотерапевтическими препаратами [4]. Среди тех пациентов, которые действительно реагируют на трастузумаб, большинство из них в конечном итоге прогрессируют после первоначального ответа и приобретают резистентность со временем после непрерывного лечения [5]. Таким образом, крайне важно и необходимо разработать дополнительные новые методы лечения пациентов со сверхэкспрессией HER2 для повышения общей выживаемости.

Антрациклины по-прежнему служат основой лечения рака. Что касается антрациклиновых агентов, то ингибитор топоизомеразы II адриамицин широко используется для лечения многих видов рака, таких как рак груди, легких и лимфоидный рак [6]. Адриамицин обладает эффективной эффективностью при лечении пациентов с раком молочной железы с избыточной экспрессией HER2 из-за близости между геном HER2 и геном топоизомеразы II [7]. Несмотря на клиническую пользу, наблюдаемую при лечении рака груди при терапии на основе антрациклинов, сердечная дисфункция ограничивает более широкие терапевтические возможности. В клинических испытаниях трастузумаб в сочетании с адриамицином продемонстрировал значительную эффективность, в то время как сильно дозозависимая кардиотоксичность была проблемой, которую необходимо решить [8]. Устойчивое высвобождение химиотерапевтических агентов в ткани-мишени рака признано хорошим решением для снижения доз, необходимых для терапевтической эффективности, и улучшения профилей безопасности [9]. Чтобы добиться лучшей противоопухолевой эффективности, но с меньшим количеством побочных эффектов, необходимо срочно повысить эффективность доставки противоопухолевых лекарств для нацеливания на раковые клетки.

Наноматериалы на основе оксида графена (GO) показали большие перспективы в контролируемой доставке химиотерапевтических агентов [10]. Многочисленные исследования показали, что токсичность ГО связана с функционализацией его поверхности [11]. Недавно сообщалось, что экологически чистые агенты, такие как хитозан и ПЭГ, функционализируют ГО менее ядовитой поверхностной функциональной группой [12, 13]. Коллоидная стабильность наночастиц в биологических средах имеет решающее значение для разработки эффективных и безопасных систем доставки лекарств для клинического использования [14]. Функционализированные нанолисты GO привлекли большое внимание в биомедицинских приложениях благодаря своим свойствам, таким как биосовместимость и стабильность. Как отличный кандидат в биоматериал на основе графена, коллоидная стабильность GO или rGO важна для контроля характеристик носителей лекарств. ГО, функционализированный полиэтиленгликолем, проявляет улучшенные коллоидные свойства в средах для культивирования клеток [15]. П. Ханра сообщил о новом методе одновременного восстановления и биофункционализации ГО с использованием дрожжевых клеток в качестве восстановительного биокатализатора [16, 17]. Avinav G представил биосинтез GO в одном сосуде с использованием дрожжевого экстракта во время автоклавного процесса [18]. Обработка ультразвуком листов GO микрометрового размера в течение нескольких часов привела к получению нанолистов GO, которые показали более высокую коллоидную стабильность по сравнению с обычным GO микрометровым размером [19]. Хотя предыдущие исследования продемонстрировали высокий потенциал ГО для биоматериалов, биофункциональные нанолисты ГО с хитозаном путем восстановления с помощью микроволнового излучения с использованием бесклеточного дрожжевого экстракта до сих пор не изучались. С этой целью была создана новая структура оксида графена, функционализированного хитозаном (ChrGO), с помощью простой системы микроволнового синтеза, в которой в качестве восстановителя используется дрожжевой экстракт. Более того, эффективная функционализация ГО с помощью биосовместимого хитозана обеспечивает потенциальную платформу для эффективной загрузки и доставки лекарств. Исследования по загрузке и высвобождению лекарств продемонстрировали, что адриамицин эффективно загружается и высвобождается из нанолистов ChrGO. Композиты ChrGO / адриамицин показали значительную противоопухолевую активность в зависимости от концентрации. В частности, комбинированное лечение ChrGO / адриамицином и трастузумабом привело к усиленному эффекту ингибирования роста клеток BT-474 по сравнению с монотерапией. Было обнаружено, что синергетическая противоопухолевая эффективность этих агентов опосредована остановкой клеточного цикла и апоптозом, что в конечном итоге привело к гибели раковых клеток. В этой работе сообщается о многообещающем способе быстрого и экономичного производства композитов ChrGO, которые доставляют химиотерапевтические агенты с пространственно-временным контролем для эффективного лечения рака (Схема 1).

Биофункционализация и восстановление оксида графита с помощью микроволн в качестве наносистемы контролируемой доставки лекарств для двойной направленной терапии клеток BT-474 со сверхэкспрессией HER2

Материалы и методы

Материалы

Графитовый порошок был получен от Qingdao Huatai Tech (Циндао, Китай). Хитозан и адриамицин были приобретены у Aladdin Co., Ltd. (Шанхай, Китай). Трастузумаб был приобретен в компании Hoffmann-La Roche Ltd (Базель, Швейцария). Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640), среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM), и фетальная бычья сыворотка (FBS) были приобретены у Invitrogen Corporation (Камарилло, США). Амикон ^® Ультрацентробежные фильтры были приобретены у Merck Millipore. CellTiter 96 ^® набор для анализа пролиферации клеток в одном растворе и Caspase-Glo ^® Набор для анализа 3/7 был получен от Promega Corporation (Мэдисон, США). Сухие пекарские дрожжи были получены от AB / Mauri Co., Ltd. Клеточные линии BT-474 и Cos-7 были получены из банка клеток Китайской академии наук (Шанхай, Китай). Среда Лурия-Бертани была приобретена у Sangon Biotech Co., Ltd. Все химические вещества были аналитической чистоты и коммерчески доступны без дополнительной очистки.

Восстановление функционализированного хитозаном GO с помощью микроволн

Оксид графита (ОГ) получали из чешуек самородного графита модифицированным методом Хаммера [14]. Для получения однослойного наноразмерного ОГ его расслаивали ультразвуковым датчиком (Scientz, Китай), работающим при 800 Вт в течение 8 ч. Наконец, расслоенный ГО был диспергирован в деионизированной воде для дальнейшего использования. Частично восстановленные нанолисты хитозан-GO (ChrGO) были синтезированы путем восстановления GO с помощью микроволн водным раствором хитозана с использованием системы микроволнового синтеза. Бесклеточный дрожжевой экстракт использовали для биосинтеза ChrGO посредством восстановления с помощью микроволн. Сначала заселенные дрожжевые клетки были активированы инокуляцией в среду Луриа-Бертани и встряхиванием при 135 об / мин в течение 18 ч при 25 ° C. Активированные дрожжевые клетки переносили в 2% раствор сахарозы, встряхивая при 135 об / мин, в течение еще 6 часов при 25 ° C. Затем 6 мл бесклеточного дрожжевого экстракта получали центрифугированием при 2000 об / мин в течение 5 мин. Затем 50 мг хитозана растворяли в 25 мл 2% (об. / Об.) Раствора уксусной кислоты и смешивали с дрожжевым экстрактом [20]. Добавляли 5 мг раствора GO при интенсивном перемешивании магнитной мешалкой. Наконец, свежеприготовленный раствор переносили в оборудование для микроволнового синтеза NOVA-2S (PreeKem Scientific Instruments, Китай) для микроволновой реакции. Схема нагрева микроволновой системы включала нагрев до 80 ° C в течение 5 минут и поддержание температуры еще в течение 5 минут. Полученный ChrGO очищали на фильтре MWCO 100 кДа (Millipore, США) и сушили вымораживанием для дальнейшего использования.

Характеристики

Изображения наноразмерного GO с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) получали на просвечивающем электронном микроскопе JEM-2100 с ускоряющим напряжением 200 кВ (JEOL, Япония). Ультрафиолет-видимые (УФ-видимые) спектры получали с использованием спектрофотометра УФ / видимого / ближнего ИК-диапазона Lambda 950 (Perkin-Elmer, США). Инфракрасные спектры с преобразованием Фурье (FTIR) собирали с использованием FTIR-спектрометра Vertex 70, сканировавшего от 4000 до 400 см ^-1 . на образцах, приготовленных в виде таблеток KBr (Bruker, Германия). Спектры комбинационного рассеяния регистрировали с помощью рамановского микроскопа Senterra R200-L с длиной волны возбуждения 532 нм (Bruker Optics, Германия). Рентгенограммы исследовали на дифрактометре Bruker D8 Advance (Bruker, Германия). Элементы поверхности регистрировали с помощью рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (XPS) Kratos AXIS Ultra DLD с монохроматическим излучением Al Ka ​​(1486,6 эВ) (Shimadzu, Япония). Термогравиметрический анализ (ТГА) проводили на приборе PerkinElmer Pyris 1 TGA при скорости нагрева 5 ° C / мин от 30 до 800 ° C в атмосфере азота (PerkinElmer, США). Поверхностный заряд композитов измерялся прибором Malvern Zeta Nano ZS-90 (Малверн, Великобритания).

Загрузка и выпуск лекарств

Четыре миллиграмма наночастиц ChrGO суспендировали в 20 мл водного раствора адриамицина (0,4 мг / мл). После обработки ультразвуком в течение 0,5 ч перемешивание проводили в темноте в течение 24 ч, избегая света. Незагруженный адриамицин удаляли центрифугированием через фильтры Amicon MWCO 50 кДа (Millipore, США) и смывали фосфатно-солевым буфером (PBS, pH 8,0) до тех пор, пока супернатант не стал бесцветным. Концентрацию адриамицина определяли с использованием стандартной кривой концентрации адриамицина с помощью спектрометрии УФ-видимого диапазона при 490 нм с SpectraMax ^® Считыватель микропланшетов M5 (Molecular Devices, США). Количество адриамицина, нанесенного на ChrGO, определяли по поглощению в УФ-видимом диапазоне путем измерения концентрации потери адриамицина в супернатанте Amicon ^® Центробежный фильтр Ultra-15 мл.

Изучены характеристики высвобождения адриамицина из ChrGO. ChrGO, нагруженный адриамицином, погружали в 10 мл буферного раствора PBS. Через определенные промежутки времени 2 мл высвободившегося раствора адриамицина, отделенного от ChrGO, собирали центрифугированием и фильтрованием через фильтры Amicon MWCO 50 кДа (Millipore, США). Объем раствора ChrGO / адриамицин поддерживали постоянным путем добавления 2 мл свежего буферного раствора PBS после каждого отбора проб. Количество адриамицина, высвобождаемого из ChrGO, измеряли по поглощению в УФ-видимой области при 490 нм с помощью SpectraMax ^® Считыватель микропланшетов M5 (Molecular Devices, США). Исследования высвобождения изучались в растворах с различным pH (значения pH 5 и 7,4).

Анализ биосовместимости и анализ терапевтической эффективности

Клетки BT-474 и Cos-7 поддерживали в RPMI-1640 с добавлением 10% FBS или DMEM с добавлением 10% FBS, соответственно, и культивировали в увлажненной атмосфере с 5% CO ₂ при 37 ° С. Анализ биосовместимости GO и ChrGO проводили на клетках BT-474 или Cos-7 с помощью анализа клеточной цитотоксичности. Клетки помещали в 96-луночные плоские планшеты с плотностью 3 × 10 ⁴ . клеток на лунку и предварительно инкубировали в течение 18 ч перед обработкой GO и ChrGO. Затем к клеткам добавляли разведения тестируемых агентов и инкубировали еще 24 ч. Жизнеспособность клеток определяли с помощью CellTiter 96 ^® водный раствор. Поглощение измеряли при 490 нм с помощью SpectraMax ^® . Считыватель микропланшетов M5 (Molecular Devices, США).

Эффективность комплексов ChrGO / адриамицин отдельно или в комбинации с трастузумабом на пролиферацию в клетках BT-474 исследовали с помощью анализа ингибирования пролиферации [16]. Клетки BT-474 помещали в 96-луночные плоские планшеты с плотностью 1 × 10 ⁴ . клеток на лунку и инкубируют в течение 24 часов. Затем комплексы ChrGO / адриамицин по отдельности или в сочетании с трастузумабом вводили в клетки BT-474 в культуральной среде. После 96-часовой инкубации жизнеспособные клетки определяли с помощью CellTiter 96 ^® водный раствор. Оптическую плотность измеряли с помощью SpectraMax ^® . Считывающее устройство для микропланшетов M5 при 490 нм (Molecular Devices, США). Данные были проанализированы с помощью однофакторного дисперсионного анализа. p <0,05 считалось статистически значимым.

Анализ клеточного цикла и анализ апоптоза

Для анализа клеточного цикла клетки BT-474 помещали в шестилуночные планшеты с плотностью 5 × 10 ⁵ . клеток на лунку и оставляли для прилипания в течение 16 часов. Клетки обрабатывали комплексами ChrGO / адриамицин отдельно или в комбинации с трастузумабом в течение 24 часов. Клетки BT-474 собирали и фиксировали 70% (об. / Об.) Этанолом при 4 ° C в течение 24 часов. Фиксированные клетки BT-474 окрашивали раствором йодида пропидия (15 мкг / мл), содержащим рибонуклеазу A (10 мкг / мл), при 25 ° C в течение одного часа. Затем клетки анализировали с помощью проточного цитометра (BD Biosciences, США). Для анализа апоптоза клетки BT-474 высевали в 96-луночные планшеты с белыми стенками при плотности 2 × 10 ⁴ клеток на лунку и оставляли для прилипания в течение 18 часов. Клетки обрабатывали комплексами ChrGO / адриамицин, трастузумабом отдельно или в сочетании с обработкой в ​​течение 24 часов. Затем культуральную среду отбрасывали и 100 мкл Caspase-Glo ^® Реагент 3/7 добавляли в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. Люминесценцию измеряли с помощью SpectraMax ^® Считыватель микропланшетов M5 (Molecular Devices, США). Результаты были проанализированы односторонним дисперсионным анализом. p <0,05 считалось статистически значимым. Все исследования проводились в соответствии с соответствующими инструкциями и правилами.

Результаты и обсуждение

Синтез и характеристика

Морфология синтезированных листов GO была охарактеризована с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). На рис. 1а показано равномерное распределение нанолистов GO по размерам ниже 100 нм со средним размером примерно 45 нм. Высокая электронная плотность GO демонстрирует лучший контраст по сравнению с хитозаном, который едва заметен из-за его низкой электронной плотности и гидратированной природы [21]. Из-за большей площади поверхности в качестве носителей лекарств широко используются наноразмерные GO или восстановленные листы GO [22]. На диаграмме дифракции электронов в выбранной области (SAED) на рис. 1c видны концентрические кольца, что демонстрирует наличие поликристаллической природы, соответствующей оксиду графена [23].

а ПЭМ-изображение нанолистов GO с малым увеличением, b ПЭМ-изображение нанолистов и c с высоким разрешением типичный образец SAED нанолистов GO

Для стабилизации нанолистов GO в физиологическом растворе нанолисты GO, функционализированные хитозаном, были приготовлены путем восстановления с помощью микроволн с использованием микроволновой системы [24]. Полученный восстановленный GO-хитозан (ChrGO) анализировали с помощью УФ-видимой спектрометрии. На рис. 2а представлены УФ – видимые спектры GO и ChrGO. GO показал острый пик поглощения при 230 нм и плечо при 300 нм, что приписывается π - π * переход ароматических связей C =C и n - π * переход связей C =O соответственно [25, 26]. После прививки хитозана к GO пик при 230 нм сместился в красную сторону до 270 нм для ChrGO, а плечо при 300 нм, очевидно, исчезло, что было приписано частичному восстановлению электронного сопряжения между ароматическими атомами углерода [27]. Черный раствор синтезированного ChrGO показан на рис. 2б, что указывает на образование частично восстановленного оксида графена (p-rGO). И нанолисты GO, и ChrGO были хорошо диспергированы в деионизованном H ₂ О. Коллоидная стабильность ГО или производных ГО в водном растворе очень важна для их биомедицинского применения. Результаты показали, что хитозан был конъюгирован с ГО после восстановления.

а УФ – видимый спектр нанолистов GO и ChrGO в водном растворе, b фотографии нанолистов GO и синтезированного ChrGO

Для характеристики структуры ГО, хитозана и ChrGO была проведена ИК-Фурье спектроскопия (рис. 3а). Характерные пики GO располагались при 3440 см ⁻¹ . и 1376 см ⁻¹ , соответствующие связям O – H и C – OH соответственно. Пик на 1072 см ⁻¹ был отнесен к валентному колебанию C – N – C. Примечательно, что пики молекул хитозана при 2912 см ⁻¹ и 2848 см ⁻¹ были отнесены к валентным колебаниям СН ₃ - и –CH ₂ - [28, 29]. Функционализированный p-rGO с хитозаном приводил к новым связям, что приводило к новым пикам в спектрах ChrGO. Наблюдается значительное уменьшение интенсивности полосы C =O при 1636 см ⁻¹ . в ChrGO по сравнению с таковым в GO, что позволяет предположить, что процесс восстановления удалял кислородсодержащие группы GO [30]. Спектр FTIR ChrGO подтвердил успешное конъюгацию хитозана с GO. Кроме того, спектроскопия комбинационного рассеяния света использовалась для характеристики электронных свойств и структуры графена. Полоса G относится к E _{2 г} фононы sp ² углеродные домены, тогда как полоса D соответствует колебанию sp ³ домены атомов углерода и неупорядоченные атомы углерода. Интенсивность полосы D указывает на характеристики нарушений и дефектов углеродных листов [31]. Восстановление нанолистов GO было проанализировано также в соотношении сигналов полосы D и G [32]. Типичный рамановский спектр GO показывает два характерных пика полосы D (1341 см ^-1 ) и полосы G (1591 см ⁻¹ ) на рис. 3б. Изменение относительной интенсивности I _D / I _G Значение иллюстрирует изменение состояния электронного сопряжения ГО в процессе восстановления [33]. Смещение полосы D свидетельствует об успешной функционализации сокращенного ГО. Значение I _D / Я _G увеличивается с 0,99 (GO) до 1,12 (ChrGO), что приписывается введению sp3 дефекты после функционализации и неполное восстановление характерной структуры графена [34]. Это наблюдение хорошо согласуется с предыдущим отчетом и предполагает образование функционализированного хитозаном графена [16].

а FTIR-спектры GO, ChrGO и хитозана, b Рамановские спектры GO и ChrGO

Состав поверхности ChrGO подтвержден методом РФЭС. Полное сканирование XPS-спектра ChrGO показывает три пика при 284, 399 и 533 эВ, которые относятся к C1s, N1s и O1s (рис. 4a) соответственно. Относительный элементный анализ показал увеличение уровней кислорода и азота ChrGO с соответствующим уменьшением содержания углерода по сравнению с GO. Спектры высокого разрешения C1s ChrGO, показанные на рис. 4b, демонстрируют четыре разделенных пика, соответствующих C – C или C =C ( sp ² , 284,7 эВ), C-O (эпокси / гидроксилы, 286,4 эВ), C =O ( sp ³ , 288.2 эВ) и O =C – O (карбоксилаты, 289.1 эВ) связи. Появление амидного пика в ChrGO свидетельствует о функционализации хитозана на ГО [35]. Обильные гидрофильные функциональные группы на поверхности сделали ChrGO хорошо растворимым в водном растворе, что согласуется с результатами FTIR. Биомолекулы, такие как восстанавливающие аминокислоты и альфа-линоленовая кислота в дрожжевом экстракте, могут играть важную роль в производстве ChrGO с помощью микроволн [20].

а Обзорные XPS-спектры GO и ChrGO, b спектры высокого разрешения C1s

Рентгенограмма GO и ChrGO представлена ​​на рис. 5а. В XRD-спектрах GO основной пик при 11,0 ° и слабый пик при 20,7 ° четко представляют структуру графита. Особенность дифракционного пика при 11.0 °, соответствующего плоскости (001) GO, свидетельствует об успешном синтезе GO [36]. Небольшая выпуклость между 20 ° и 24 ° показывает графитовые фрагменты, которые приписываются неокисленному чистому графиту [37]. При функционализации хитозана пик (001) GO исчезает, тогда как широкий дифракционный пик при 21,4 ° становится заметным. Этот сдвиг можно отнести к уменьшению GO, при этом уменьшение делает упаковку RGO более плотной, чем GO. Отражение (002) образца ChrGO очень широкое, что позволяет предположить, что образец очень плохо упорядочен вдоль направления укладки, что может быть приписано неполному восстановлению GO [33]. Поведение при разложении GO, хитозана и ChrGO было изучено с помощью термогравиметрического анализа (ТГА) [38]. Кривые ТГА ChrGO, GO и хитозана показаны на рис. 5b, которые были измерены в атмосфере азота. GO начал терять в весе ниже 100 ° C, что было связано с удалением адсорбированной свободной воды в многослойной структуре [39]. ОГ потерял 42% веса в интервале 191–231 ° С, что связано с распадом лабильных кислородсодержащих групп. Скорость потери массы ChrGO при 100–250 ° C значительно ниже, чем у GO, и очевидно, что ChrGO показал другую картину разложения по сравнению с GO. Термическое удаление ChrGO и чистого хитозана происходило от 250 до 440 ° C, что связано с деполимеризацией и пиролизом более стабильных функциональных групп, таких как гликозидные звенья хитозана и карбоксильные группы [40]. По сравнению с GO, ChrGO был термически стабилен и давал основную потерю веса 36% на первой стадии разложения при 250–440 ° C, тогда как потеря веса была небольшой для GO. Значительная потеря веса в высокотемпературной области 450–800 ° C была связана с термической деградацией углеродного скелета, которую можно приписать остаткам хитозана и биомолекулам из дрожжевого экстракта, таким как аминокислоты [41]. P>

а Диаграммы XRD GO и ChrGO, b Кривые ТГА GO, хитозана и ChrGO

Поверхностный заряд GO и ChrGO измеряли с помощью прибора Malvern Zeta Nano ZS-90, который является важным параметром коллоидной стабильности. Более высокая плотность поверхностного заряда на нанолистах GO создает более стабильную коллоидную дисперсию [42]. Как показано в дополнительном файле 1:рис. S1, дзета-потенциал GO монотонно уменьшался от -10,7 мВ при pH 3 до -35,5 мВ при pH 11, что подтвердило отрицательный заряд на поверхности нанолистов GO. Значение дзета-потенциала ChrGO было сравнительно меньше, чем потенциал GO при любом pH в диапазоне от 3 до 11. Нанолисты ChrGO показали стабильность во всем диапазоне значений pH, в то время как восстановленные коллоиды GO, как сообщалось, были менее стабильными в деионизированной воде из-за увеличено π - π укладка на деоксигенированных поверхностях [43]. Хотя на поверхности хитозана присутствовали некоторые свободные аминогруппы [44], более высокий дзета-потенциал ChrGO не был достигнут. Более низкое значение дзета-потенциала ChrGO можно приписать многочисленным молекулам отрицательных аминокислот из дрожжевого экстракта, которые увеличивают коллоидную стабильность в физиологическом растворе [20]. Отрицательно заряженная поверхность ChrGO делает их потенциально применимыми для загрузки и доставки лекарства.

Биосовместимость синтезированного ChrGO

Биосовместимость синтезированного ChrGO важна для его применения в доставке лекарств. Цитотоксичность клеток ChrGO и GO исследовали с помощью анализа цитотоксичности. Клетки Cos-7 и клетки BT-474 инкубировали в присутствии ChrGO или GO в течение 24 часов. Результаты клеточной цитотоксичности показаны на фиг. 6. Можно сделать вывод, что ChrGO не проявляет явной клеточной цитотоксичности по отношению к клеткам Cos-7 и BT-474. Даже при концентрации 100 мкг / мл жизнеспособность клеток была выше 90%. Однако GO проявлял значительную клеточную цитотоксичность в зависимости от дозы, с выживаемостью только 73,0 ± 0,5% и 71,0 ± 0,5% для клеток Cos-7 и BT-474 при концентрации 100 мкг / мл соответственно. Результаты продемонстрировали, что хитозан, функционализированный на поверхности ГО, показал очень низкую цитотоксичность и улучшенную биосовместимость. Сообщалось, что поверхностная функционализация ГО с помощью макромолекул заметно ослабляет его цитотоксические эффекты [45]. Hu et al. сообщили, что фетальная бычья сыворотка в клеточной среде заметно снижает клеточную цитотоксичность ГО в клетках немелкоклеточного рака легкого A549 [46].

Биосовместимость ГО и ChrGO. Различные концентрации наночастиц культивировали с a Клетки Cos-7 и b Клетки BT-474 и их влияние на жизнеспособность клеток было определено

Загрузка и выпуск препарата

Потенциальное биомедицинское применение ChrGO в качестве носителя лекарства измеряется по загрузке и высвобождению лекарства. Структурные характеристики производных графена очень эффективны для доставки ароматических лекарств из-за их очень большой удельной поверхности. Адриамицин является одним из основных химиотерапевтических средств против опухолей при различных гематологических злокачественных новообразованиях и солидных опухолях и часто используется в качестве модельного лекарственного средства для оценки систем доставки лекарственных средств на основе производных графена [47]. Нагрузочная способность адриамицина на нанолистах ChrGO была подтверждена по характеристическому пику поглощения адриамицина в УФ-видимом диапазоне при 490 нм. Как и ожидалось, максимальная эффективность загрузки адриамицина, связанного с нанолистами ChrGO, составила 169,8%, что частично объясняется большой площадью поверхности нанолистов ChrGO. Нанокомпозиты ChrGO / адриамицин, нагруженные адриамицином, легко диспергировались в физиологическом буфере, получая прозрачный раствор со слегка красноватым цветом.

Чтобы изучить профиль высвобождения адриамицина из комплексов ChrGO / адриамицин, были введены различные значения pH PBS для имитации среды опухолевых клеток. Дополнительный файл 1:на рис. S2 показаны кумулятивные профили высвобождения адриамицина из ChrGO / адриамицина при pH 5 и 7,4. Адриамицин, высвобождаемый из ChrGO / адриамицина, характеризовался начальным быстрым высвобождением, а затем стадией более медленного высвобождения в растворе PBS с pH 5,0. Кумулятивное высвобождение адриамицина составляло 6,5% в первые 3 часа, а затем медленно увеличивалось до 26,7% через 96 часов при pH 5,0. Напротив, процентное содержание адриамицина в ChrGO / адриамицине увеличивалось медленнее и было ниже при pH 7,4, показывая процент высвобождения адриамицина с 2,5% в первые 3 часа до 7,4% за 96 часов. Предыдущие исследования показали, что профили высвобождения лекарств из функционализированного ГО очень медленно в среде с pH 7,4 [48]. Протонирование карбоксильных групп на ChrGO снижает π – π-стэкинг, водородные связи и электростатические взаимодействия между адриамицином и ChrGO, облегчая высвобождение адриамицина в уксусной среде [49]. Чувствительность к pH дает ChrGO / адриамицин потенциал для сайт-специфической доставки лекарств, что впоследствии увеличивает цитотоксичность опухолевых клеток.

Терапевтическая эффективность комплексов ChrGO / адриамицин

Терапевтическая эффективность комплексов ChrGO / адриамицин в раковых клетках BT-474 с избыточной экспрессией HER2 была исследована с помощью анализа ингибирования пролиферации. Сверхэкспрессия рецептора HER2 играет ключевую роль в трансформации клеток рака молочной железы BT-474. Лечение одним трастузумабом, моноклональным антителом против HER2, приводит к значительному ингибированию роста клеток BT-474 [50]. As shown in Fig. 7a, after treatment with ChrGO/adriamycin complexes, the cell viability of BT-474 cells was decreased significantly, demonstrating a dosage-dependent toxic effect. Besides, when compared to free adriamycin, the ChrGO/adriamycin complexes demonstrated a less effective performance in killing BT-474 cells, which was ascribed to the gradual diffusion of loaded adriamycin rather than direct treatment with free adriamycin [51]. However, the therapeutic efficacy of the ChrGO/adriamycin complexes was close to that of free adriamycin as their concentration of ChrGO/adriamycin complexes increased, which can be explained by the sustained adriamycin release from the ChrGO carrier.

а In vitro cell viability of BT-474 cells incubated with concentrations of free adriamycin and adriamycin loaded in ChrGO/adriamycin complexes, b cytotoxicity of ChrGO/adriamycin complexes (5 μg/mL) in combination with trastuzumab (5 μg/mL) in BT-474 cells. Adria:adriamycin. ** p  < 0.01, ***p <0,001

To study whether trastuzumab, an anti-HER2 monoclonal antibody, could improve the antitumour activity of equivalent amounts of adriamycin loaded on ChrGO, BT-474 cells were treated with trastuzumab alone or in combination with ChrGO/adriamycin. Treatment with trastuzumab alone produced a significant inhibition of BT-474 proliferation, which is consistent with a previous report [52]. The combined therapy with trastuzumab and ChrGO/adriamycin resulted in an enhanced cell growth inhibition effect, as shown by a reduction of 88.5% compared with a reduction of 54.5% with trastuzumab alone (5 μg/mL) and 59.5% with equivalent ChrGO/adriamycin alone (5 μg/mL) versus the negative control (Fig. 7b). The results suggest that the ChrGO system may be effectively used to develop composites for combination therapies, and the combined treatment of ChrGO/adriamycin and trastuzumab resulted in a modest, but significant, reduction of cell viability compared to each drug alone.

Cell Cycle Analysis and Apoptosis

To determine whether the ChrGO/adriamycin complexes have effects on cell cycle progression, a cell cycle assay of ChrGO/adriamycin complexes alone or in combination treatment with trastuzumab was performed on BT474 cells. As shown in Fig. 8a, flow cytometry analysis revealed that trastuzumab alone increased the cell population in the G0/G1 phase. Treatment with ChrGO/adriamycin alone mediated a significant reduction in the number of G0/G1 cells and accumulation in S phase and G2/M phase compared to control cells. Besides, ChrGO/adriamycin combined with trastuzumab mediated S phase arrest, accompanied by a significant decrease in the number of cells in the G0/G1 phase. While ChrGO/adriamycin is most active in the S phase of the cell cycle, ChrGO/adriamycin treatment with trastuzumab can cause an increase in G0/G1 phase compared to ChrGO/adriamycin alone. A previous report showed that trastuzumab can cause cell arrest in the G1 phase [53]. Adriamycin inhibits cell proliferation and DNA replication, ultimately leading to cell cycle arrest [54].

а Cell cycle analysis after treatment with ChrGO/adriamycin alone or in combination with trastuzumab in BT-474 cells, b effect of ChrGO/adriamycin (5 μg/mL) plus trastuzumab (5 μg/mL) on induction of apoptosis in BT-474 cells. Adria:adriamycin. ** p  < 0.01, ***p <0,001

To assess the effects of ChrGO/adriamycin on apoptotic molecules, BT-474 cells were treated for 48 h with either ChrGO/adriamycin, trastuzumab, or a combinational treatment of both agents. For the visualization of apoptosis, caspase 3/7 activity has been extensively used as an apoptosis-specific marker due to its activity related to the process of apoptosis [55]. As observed from Fig. 8b, compared to the negative control, treatment with ChrGO/adriamycin (5 μg/mL) alone significantly increased the caspase 3/7 activity. However, trastuzumab (5 μg/mL) alone did not significantly increase caspase 3/7 expression, suggesting that trastuzumab does not induce apoptosis. In contrast, treatment with ChrGO/adriamycin (5 μg/mL) plus trastuzumab (5 μg/mL) significantly increased caspase 3/7 activity compared to that with each drug alone. The dual-targeted therapy showed higher apoptosis, indicating superior therapeutic efficacy due to the presence of different mechanisms of action. Similar to other studies, adriamycin amplifies the apoptotic response in HER2-overexpressing cancer cells [56]. In conclusion, ChrGO/adriamycin combined with trastuzumab induces cell cycle arrest and apoptosis, which ultimately results in augmented cell death.

Выводы

In the present work, the chitosan-functionalized graphene oxide nanosheets were structured with microwave-assisted reduction, which demonstrated biocompatibility and good dispersion stability. The as-prepared nanocomposites showed high efficiency of drug encapsulation and delivery. The ChrGO/adriamycin nanosheets displayed significant growth inhibition of BT-474 in a dose-dependent manner. The combined treatment of ChrGO/adriamycin and trastuzumab resulted in superior therapeutic efficacy in BT-474 cells compared to that with each agent alone. The results are favourable for the development of intracellular nanocarriers to deliver drugs in a controlled manner, which is expected to improve the therapeutic effect on HER2-overexpressing cancer therapies.

Доступность данных и материалов

The datasets supporting the conclusions of this current study are available from the corresponding authors upon reasonable request.

Сокращения

ChrGO:

Chitosan-functionalized graphene oxide

EGFR:

Epidermal growth factor receptor

HER2:

Human epidermal growth factor receptor-2

GO:

Оксид графена

DMEM:

Dulbecco's modified Eagle medium

FBS:

Фетальная бычья сыворотка

ТЕМ:

Просвечивающая электронная микроскопия

UV–Vis:

Ультрафиолет - видимый

FTIR:

Инфракрасное преобразование Фурье

XRD:

Рентгеновская дифракция

XPS:

Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия

TGA:

Термогравиметрический анализ

PBS:

Физиологический раствор с фосфатным буфером

SAED:

Электронная дифракция на выделенной области

TGA:

Gravimetric analysis