Оценка эффективности клеточного поглощения в соответствии с множественными ингибиторами наночастиц Fe3O4-Au Core-Shell:возможность контролировать специфический эндоцитоз в клетках колоректального рака

Аннотация

Магнетит (Fe ₃ О ₄ ) -золото (Au) наночастицы ядро-оболочка (НЧ) обладают уникальными магнитными и оптическими свойствами. В сочетании с биологическими фрагментами эти NP могут предлагать новые стратегии для биомедицинских приложений, таких как доставка лекарств и нацеливание на рак. Здесь мы представляем эффективный метод для контролируемого клеточного поглощения систем NP магнитного ядра-оболочки в сочетании с биологическими фрагментами. Биохимически подтверждено, что виментин, который является структурным белком, сильно влияет на фагоцитоз. Кроме того, виментин влияет на интернализацию экзогенных материалов в клетки даже при множественном ингибировании биологических составляющих. В этом исследовании мы демонстрируем эффективность клеточной интернализации Fe ₃ О ₄ -Au НЧ ядро-оболочка с модификацией поверхности с использованием комбинации биологических фрагментов. На фотофлуоресценцию меченых виментином НЧ не влияли многочисленные тесты на ингибирование, что указывает на минимальное влияние на НЧ нистатина, диназора, цитохалазина D и даже антитела Muc1 (Ab). Следовательно, этот результат указывает на то, что Muc1 Ab может нацеливаться на определенные молекулы и может контролировать специфический эндоцитоз. Кроме того, мы показываем возможность контроля специфического эндоцитоза в клетках колоректального рака.

Введение

Наноматериалы открыли новые возможности для клинической диагностики и лечения. В частности, наночастицы (НЧ) являются одним из наиболее важных инструментов и используются в таких приложениях, как биосенсоры [1, 2], диагностика [3, 4] и системы адресной доставки лекарств [5, 6]. Для биомедицинских приложений НЧ обычно состоят из органических материалов, окружающих поверхность материалов ядра [7,8,9]. Материалы сердечника, которые состоят из магнитных материалов, полупроводниковых материалов или других типов материалов, обладают полезными физико-химическими свойствами, а внешняя органическая поверхность обеспечивает химическую стабильность и функциональность наночастиц. Для применений в биологических системах нацеливания критическими параметрами являются не только физико-химические свойства, но и внешняя органическая поверхность, которая является биофункциональной для нацеливания. Примерами нацеливающих групп для функционализации являются антитела или лиганды, специфичные для мишени. В зависимости от биофункциональных материалов на внешней поверхности определяются механизмы эндоцитоза НЧ. Механизм, который позволяет НЧ проникать в клетки, был предметом многих недавних исследований из-за их важности для применения в наномедицине [10,11,12,13,14,15].

В частности, магнитные наночастицы широко используются во многих приложениях для нацеливания на конкретные сайты, включая сортировку клеток [16, 17], МРТ [18], выделение ДНК [19], доставку лекарств [20], лечение гипертермии [21] и рак. нацеливание [22]. Среди различных магнитных НЧ нанокристаллы магнетита наиболее широко используются в биомедицинских приложениях из-за их биосовместимости и химической стабильности. Хотя много усилий было направлено на биомедицинские приложения с использованием магнитных наночастиц, все еще остаются некоторые важные проблемы, такие как хорошая диспергируемость в водном растворе, функциональность и биосовместимость. Чтобы преодолеть эти проблемы, многие исследования были сосредоточены на модификации поверхности НЧ с использованием различных функциональных групп (например, карбоксильных и аминогрупп) [23]. Однако присоединение функциональных групп к поверхности НЧ магнетита - процесс трудоемкий и трудоемкий. Учитывая этот факт, магнитные наночастицы с покрытием из Au типа ядро-оболочка являются привлекательными, поскольку поверхность Au может легко связываться с биомолекулами и органическими материалами.

В частности, магнитные свойства наночастиц магнитное ядро-Au-оболочка делают возможным магнитное разделение, увеличивают разрешение при МРТ-изображениях и могут применяться в гипертермической терапии. Более того, превосходные химические связывающие свойства золота полезны для создания рецепторно-опосредованных систем доставки для специфического нацеливания на рак [24,25,26].

За последние несколько десятилетий многие исследователи сообщили о рецепторно-опосредованных системах доставки для нацеливания на рак [27,28,29].

Рецептор-опосредованное нацеливание на раковые клетки - это форма активного нацеливания. Выбор мишени является ключом к эффективному активному нацеливанию, и мишени должны быть сверхэкспрессированы на внеклеточной мембране. Большинство исследователей использовали моноклональные антитела для лечения рака, и терапевтический эффект может быть значительно увеличен, если лечение моноклональными антителами сочетается с традиционной химиотерапией [30]. Несмотря на успех терапии моноклональными антителами, моноклональные антитела имеют несколько ограничений при нацеливании на рак. Их большой размер (примерно 150 кДа) является основным препятствием для проникновения опухоли [31, 32], а их низкая стабильность и низкая растворимость препятствуют их широкому использованию [33]. Неоднородное направление их прикрепления к нацеливающему носителю также считается препятствием для неспецифического связывания. Для получения антител с улучшенным проникновением в опухоль был разработан и протестирован широкий спектр форматов антител [34]. Помимо классических антител, уникальный формат антител присутствует у видов из семейства Camelidae. Так называемые антитела к тяжелым цепям (HCAbs) естественным образом встречаются в периферической крови и молоке этих видов. Антигенсвязывающие фрагменты таких HCAb состоят из одного единственного домена, вариабельного домена тяжелой цепи (VH) HCAb верблюда (VHH). VHH, полученный рекомбинантно после клонирования и экспрессии в бактериях или грибах, называется нанотелом. Оно имеет молекулярную массу 11-15 кДа и является самым маленьким антителом среди всех моноклональных антител [35,36,37]. Не только их небольшой размер делает их потенциально подходящими в качестве зондов для нацеливания на антигены в изолированных местах, но также их легко модифицируемый концевой конец привлекателен для применения при нацеливании на рак.

Эффективная доставка NP с подходящей направленностью и интернализацией клеток также являются важными факторами в системе доставки. Сообщалось, что виментин играет важную роль как компонент прикрепления патогенов и путей внутриклеточного проникновения. Подавление экспрессии гена виментина подавляет фагоцитоз [38], тогда как расщепленный виментин является сигналом, который значительно увеличивает фагоцитоз [39]. Следовательно, нейтрализация устойчивости клеток к фагоцитозу, вызванному виментином на поверхности клеток, важна для эффективной доставки наночастиц.

В этом исследовании мы исследуем пути эндоцитоза Fe ₃, меченного нанотелами. О ₄ -Au НЧ ядро-оболочка, модифицированные прокладками из ПЭГ (полиэтиленгликоля) различной длины. Виментин, который, как известно из биохимических экспериментов, оказывает сильное влияние на фагоцитоз [39], сравнивался с контролем, и было подтверждено, что он эффективно действует на интернализацию НЧ клетками. Кроме того, Muc1, который представляет собой гликопротеин клеточной поверхности и сверхэкспрессируется при различных формах рака, таких как рак поджелудочной железы, груди, легких и желудка, используется в качестве биомаркера, нацеленного на рак. Мы подтвердили эффективную интернализацию Fe ₃ О ₄ НЧ ядра-оболочка Au и методы контролируемого нацеливания на раковые клетки посредством пути эндоцитоза, опосредованного рецепторами Muc1, в клетках толстой кишки.

Материалы и методы

Материалы

Ацетат золота (III) (Au (OOCCH3) 3, 99,9%) был получен от Alfa Aesar. Другие химические вещества, включая ацетилацетонат железа (III) (Fe (acac) ₃ , 99,9%), 1,2-гексадекандиол (C14H29CH (OH) CH2 (OH), 90%), поли (этиленгликоль) -блок-поли (пропиленгликоль) -блок-поли (этиленгликоль) (PEG-PPG- ПЭГ) и октиловый эфир (C8H17OC8H17, 99%) были приобретены у Sigma-Aldrich и использовались в том виде, в каком они были получены. Альфа-пиридил-2-дисульфид-омега-карбоксисукцинимидиловый эфир поли (этиленгликоль) (OPSS-PEG-NHS) (2K, 5K и 10K) был приобретен у Nanocs. Бикарбонат натрия, WST-1, хлорпромазин, нистатин, цитохалазин D, dynasore, брефельдин A (BFA), монензин и трипановый синий были приобретены у Sigma-Aldrich. Cy3 и Cy7.5 были приобретены у Lumiprobe. Анти-Muc1 Ab было приобретено у Abcam Inc. (Кембридж, Массачусетс). Солевой раствор с фосфатным буфером (PBS), среда Игла, модифицированная Дульбекко, и фетальная бычья сыворотка были приобретены у Invitrogen Corp.

Синтез Fe ₃ О ₄ -Au Core-Shell NPs

Fe ₃ О ₄ -Au НЧ ядро-оболочка были синтезированы методом наноэмульсии. Процесс синтеза НЧ ядро-оболочка состоит из двух этапов:(1) образование Fe ₃ О ₄ НЧ ядра и (2) покрытие Au-оболочки на магнитных НЧ. На первом этапе Fe ₃ О ₄ НЧ готовили из смешанного раствора Fe (acac) ₃ (0,1766 г или 0,5 ммоль), 1,2-гексадекандиол (0,6468 г или 2,5 ммоль) и блок-сополимер (поли (этиленоксид) -поли (пропиленоксид) -поли (этиленоксид); PEO-PPO-PEO) ( 0,4 ~ 1,2 г) в октиловом эфире. Смешанный раствор нагревали при 300 ° C для восстановления предшественника Fe. Образование Fe ₃ О ₄ активная НЧ завершалась охлаждением нагретого раствора. Второй процесс проводился непрерывно без какой-либо очистки после формирования магнитопровода. Прекурсоры Au (0,2338 г или 0,62 ммоль) и 1,2-гексадекандиол (0,88 г, 3,4 ммоль) добавляли в эмульсию, состоящую из Fe ₃ О ₄ НЧ, а затем смешанный раствор нагревали до 230 ° C. После охлаждения до комнатной температуры эмульсия осаждалась центрифугированием, и НЧ ядро-оболочка отделялись.

Создание вектора экспрессии рекомбинантного анти-Muc1-VHH 5-24 K10

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с использованием прямого праймера 5'-CCGAATTCGCCGATGTGCAGCTGACCGAG-3 'и обратного праймера 5'-CGG CTCGAGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTGCCTGAGGAGACGGTGACCTG-3'. Продукт ПЦР расщепляли EcoRI и XhoI и очищали в геле с использованием набора для быстрой экстракции из геля QIA (QIAGEN, Валенсия, Калифорния, США). Очищенный продукт ПЦР клонировали в расщепленный EcoRI / XhoI pET-23a (Novagen, Дармштадт, Германия). кишечная палочка ( E. coli DH5α (RBC Bioscience, Xindian, Тайвань) трансформировали полученной конструкцией с помощью теплового шока и отбирали на чашках с агаром LB, содержащим 100 мкг / мл ампициллина (Duchefa Biochemie, Харлем, Нидерланды).

Экспрессия и очистка рекомбинантного белка

Для экспрессии и очистки рекомбинантного белка анти-Muc1-VHH 5-24 K10 E. coli Штаммы BL21 (RBC Bioscience, Xindian, Тайвань) трансформировали pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10. Затем бактерии выращивали в бульоне LB, содержащем ампициллин (100 мкг / мл). Экспрессию белка индуцировали изопропил-β-d-тиогалактозидом (IPTG) (Duchefa Biochemie, Харлем, Нидерланды) в конечной концентрации 0,4 мМ в течение 5 часов при 37 ° C. Бактериальные осадки ресуспендировали в буфере для лизиса (50 мМ NaH ₂ ЗП ₄ , pH 8,0; 300 мМ NaCl) с последующей обработкой ультразвуком на льду в течение 10 мин. Обработанные ультразвуком лизаты центрифугировали при 20 000 × g . в течение 20 мин при 4 ° C и подвергали обработке Ni-NTA His · Bind Resin (Peptron, Daejeon, Korea). His-меченные белки, которые были связаны со смолой, элюировали элюирующим буфером (50 мМ NaH ₂ ЗП ₄ , pH 8,0; 300 мМ NaCl; 150 мМ имидазол). Очищенный белок разделяли на 15% геле SDS-PAGE.

Модификация Core-Shell Fe ₃ О ₄ -Au НП

OPSS-PEG-NHS различной длины (2, 5 и 10 K) растворяли в 0,1 М бикарбонате натрия для активации тиоловых групп. Активированный OPSS-PEG-NHS был добавлен к раствору синтезированного ядра-оболочки Fe ₃ О ₄ -Au НЧ и перемешивали в течение 12 ч при 4 ° C. Тиоловые группы активированного OPSS-PEG-NHS были ковалентно связаны с поверхностью Au НЧ ядро-оболочка. Затем раствор нанотел (0,25 мг / мл) добавляли к ПЭГилированному Fe ₃ О ₄ -Au НЧ ядро-оболочка в течение 12 ч при 4 ° C. Аминные группы десяти лизиновых (K) хвостов на конце были ковалентно связаны с группами NHS OPSS-PEG-NHS при pH 8,3. Cy3 и Cy7.5 были привязаны к остаточным аминогруппам нанотела.

Кривая интернализации

Клетки CT26 высевали в количестве 5 × 10 ³ . клеток на лунку в 96-луночном планшете с прозрачным дном и инкубируют в 250 мкл культуральной среды в течение 24 часов при 37 ° C в 5% CO ₂ во тьме. Среду удаляли и 250 мкл свежей культуральной среды, содержащей 50 мкг / мл Cy3-меченного Fe ₃ О ₄ -Au NP и PEG-Cy3 или PEG-нанотело-Cy3-меченные NP добавляли в каждую лунку. Далее клетки инкубировали в течение разных периодов (0, 10, 20, 30, 60, 120 и 360 минут). Затем клетки трижды промывали PBS для удаления свободных НЧ, и флуоресценцию каждой лунки измеряли с помощью трипанового синего в качестве мембранно-непроницаемого гасителя флуоресценции SpectraMAX GEMINI (Molecular Devices, Калифорния, США). Каждый эксперимент проводился с равным количеством НЧ (50 мкг / мл) и повторялся трижды [40].

Тест ингибирования

Клетки CT26 высевали в количестве 5 × 10 ³ . клеток на лунку в 96-луночном планшете с прозрачным дном и инкубируют в 250 мкл среды в течение 24 часов при 37 ° C в 5% CO ₂ во тьме. Среду удаляли и 250 мкл свежей культуральной среды, содержащей 20 мкг / мл хлорпромазина (CPZ), 50 мкг / мл нистатина, 20 мкг / мл цитохалазина D, 25 мкг / мл dynasore, 20 мкг / мл BFA, 140 мкг / мл. Добавляли мл монензина или 5 мкМ антител против Muc1, и клетки инкубировали в течение 1 часа.

Среду снова удаляли и 250 мкл культуральной среды, содержащей 50 мкг / мл Cy3-меченного Fe ₃ О ₄ -Au NPs, PEG-Cy3-меченые NP, PEG-нанотела-Cy3-меченые NPs или виментин-Cy3-меченные NPs.

Через 1 час при 37 ° C и 5% CO ₂ клетки трижды промывали PBS для удаления свободных НЧ, и флуоресценцию измеряли с помощью трипанового синего в качестве мембранно-непроницаемого гасителя флуоресценции с помощью SpectraMAX GEMINI (Molecular Devices, Калифорния, США). Каждый эксперимент проводился с равным количеством НЧ (50 мкг / мл) и повторялся четыре раза.

Результаты и обсуждение

НЧ ядро-оболочка были синтезированы по литературной методике [16, 17]. Наблюдения с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) на рис. 1a, b показывают, что Fe ₃ О ₄ -Au НЧ ядро-оболочка имели сферическую форму со средним диаметром 13,5 нм и узким распределением по размерам.

Увеличение от ~ 8,5 нм ядра NP (Fe ₃ О ₄ ) происходит из-за покрытия Au-оболочки толщиной ~ 2,5 нм на поверхности ядра, в результате чего возникает НЧ ядро-оболочка. ПЭМ-изображение высокого разрешения с анализом быстрого преобразования Фурье (БПФ) Fe ₃ О ₄ -Au ядро-оболочка NP включено в дополнительную информацию на рис. S1.

Продукт, изготовленный в органическом растворителе, очищали с помощью магнитной сепарации и переносили в воду.

НЧ ядро-оболочка были хорошо диспергированы и стабильны в воде без какой-либо модификации поверхности из-за остаточных блок-сополимеров, которые присутствовали на НЧ.

На рис. 1c и d показаны НЧ в водном растворе до и после приложения внешнего магнитного поля. Под действием внешнего магнитного поля НЧ ядро-оболочка быстро менялись от однородной дисперсии (рис. 1c) до прозрачного и прозрачного раствора (рис. 1d).

Полоса поглощения НЧ ядро-оболочка исследовалась с помощью спектрометрии в УФ-видимом диапазоне. Как показано на рис. 1e, пик поглощения появился при ~ 530 нм, что указывает на присутствие Au на поверхности наночастиц (дополнительная информация на рис. S2 включает результат данных EDX для Fe ₃ О ₄ -Au ядро-оболочка НП). После очистки образца оптические результаты продемонстрировали формирование структуры ядро-оболочка.

Петли магнитного гистерезиса были получены из измерений вибрирующих образцов для исследования магнитных свойств Fe ₃ О ₄ ядро и ядро-оболочка НП. Обе НЧ показали суперпарамагнитное поведение с коэрцитивной силой около 0 Э при комнатной температуре (рис. 1f).

Как сообщалось в предыдущих работах, восприимчивость НЧ ядро-оболочка была выше, чем восприимчивость НЧ магнетита, что отчасти могло быть связано с эффектами близости и уникальными пространственными конфигурациями [41, 42]. Кроме того, намагниченности насыщения ядер НЧ и НЧ ядро-оболочка составляют ~ 37 ЭМЕ / г и ~ 21 ЭМЕ / г при 10 кЭ, соответственно. Разница в Ms связана с существованием немагнитной составляющей (Au) в НЧ ядро-оболочка.

Ген VHH 5-24 K10 клонировали в рамке считывания для получения pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10 после амплификации ПЦР (фиг. 2a). Рекомбинантный белок экспрессировали в E. coli BL21, который был трансформирован pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10 после индукции IPTG и очищен смолой Ni-NTA His · Bind. Рекомбинантные антитела против Muc1-VHH 5-24 K10 легко экспрессировались в E. coli как растворимый белок массой 18 кДа. Из 1-литровой культуры мы получили 1 ± 0,5 мг очищенного рекомбинантного анти-Muc1-VHH 5-24 K10.

Очищенный белок проверяли с помощью 15% геля SDS-PAGE. Окрашивание очищенного белка кумасси синим показало, что он имел чистоту> 95% (фиг. 2b). Синтезированный Fe ₃ О ₄ -Au NPs были модифицированы в три этапа, а именно ПЭГилирование, мечение антителом и мечение красителем (рис. 2c). После каждой стадии модификации измеряли дзета-потенциал, чтобы подтвердить успешную модификацию. В таблице 1 показано влияние модификации на соответствующие дзета-потенциалы. Дзета-потенциал НЧ без оболочки ядро-оболочка составил -19,8 ± 6,68 мВ. ПЭГилирование НЧ проводили с использованием OPSS-PEG-NHS. Для получения серии нанокомплексов разного размера использовался OPSS-PEG-NHS с разной длиной (2 K, 5 K и 10 K).

После пегилирования дзета-потенциалы были снижены (-44,9 ± 8,19 мВ, -40,7 ± 7,88 мВ и -39,6 ± 8,74 мВ для 2 К, 5 К и 10 К соответственно).

Интересно, что после мечения нанотел дзета-потенциалы явно увеличились (-38,5 ± 5,61 мВ, -23,3 ± 8,61 мВ и -31,8 ± 7,37 мВ для 2 K, 5 K и 10 K соответственно).

После маркировки красителем дзета-потенциалы также увеличились (-12,5 ± 7,25 мВ, -17,7 ± 3,94 мВ и -10,6 ± 4,72 мВ для 2, 5 и 10 К соответственно).

Дзета-потенциал чистого Fe ₃ О ₄ -Au НЧ ядро-оболочка - 19,8 ± 6,68 мВ. После пегилирования дзета-потенциал снижался почти до -40 мВ. Эти результаты показывают, что молекулы ПЭГ были хорошо связаны ковалентно с Au-оболочкой НЧ ядро-оболочка, поскольку молекулы ПЭГ имеют отрицательно заряженные N-гидроксисукцинимидные функциональные группы. Между тем, дзета-потенциал увеличивался после прикрепления красителя к нанотелу (-38,5 ± 5,61 мВ для K-нанотела NP-PEG2 и -12,5 ± 7,25 мВ для красителя K-нанотела NP-PEG2). Такой результат является разумным, поскольку рекомбинантное нанотело имеет десять лизиновых хвостов на конце. Каждый тип нанотел был классифицирован с помощью измерения дзета-потенциала, и для определения связывания антитела с нанотелом мы измерили флуоресценцию для каждого типа нанотел.

Как показано на рис. 3, мы подтвердили, что все типы наночастиц и нанотел обладают хорошим клеточным захватом и интернализацией в отсутствие ограничений ингибитора. Кривая интернализации клеток была получена для клеток, инкубированных в присутствии 50 мкг / мл Cy3-меченного Fe ₃ О ₄ -Au NPs, PEG-Cy3-меченные NP и PEG-nanobody-Cy3-меченные NPs в течение различных периодов времени (от 0 до 360 мин) после удаления среды, вымывания свободных NP и, наконец, измерения общей флуоресценции клеток с помощью трипана синий (рис. 3).

По результатам измерения интенсивности флуоресценции можно определить, что НЧ интернализовались в клетках в течение 1 часа (рис. 3а). Интенсивность флуоресценции НЧ достигает максимума в течение 1 ч, и интенсивность флуоресценции постепенно снижается после достижения стационарного состояния. Несмотря на то, что существует небольшая разница во времени в зависимости от присутствия Ab, интенсивность флуоресценции за время культивирования существенно не отличалась от результата чистых НЧ (рис. 3b). Как показано на рис. 3c, было подтверждено, что влияние Ab при использовании гетерогенных Ab из Muc1 и виментина было незначительным в отношении клеточного поглощения и интернализации NP.

С помощью анализа WST-1 жизнеспособность (%) муциновых клеток CT26 в зависимости от концентрации и модификации поверхности Fe ₃ О ₄ НЧ -Au ядро-оболочка оценивали после различного времени экспонирования (рис. 4а, б). Жизнеспособность клеток CT26 не показала каких-либо значительных различий после 24 и 48 часов воздействия ни при варьировании доз, ни после модификации поверхности НЧ. Жизнеспособность клеток была более 90% как на чистом Fe ₃ О ₄ -Au НЧ (Рис. 4a) и поверхностно-модифицированные НЧ (Рис. 4b).

Фигура 5 показывает, что НЧ проникают в муциновые клетки CT26 через различные пути эндоцитоза (опосредованный клатрином, опосредованный кавеолами пути и пути фагоцитоза / макропиноцитоза). Интересно, что фиг. 5b показывает, что антитела против Muc1 также в основном влияют на эндоцитоз НЧ, меченных PEG-нанотело-Cy3. Чтобы понять путь интернализации NP, мы попытались подавить пути эндоцитоза с помощью специфических химических ингибиторов (рис. 5). Хорошо известно, что пути эндоцитоза подразделяются на три типа:клатрин-опосредованный, опосредованный кавеолами и макропиноцитоз / фагоцитоз.

В этом исследовании ингибиторы были использованы в качестве первого подхода к изучению интернализации НЧ, меченных нанотелами. CPZ (клатрин-опосредованный ингибитор эндоцитоза), нистатин (опосредованный кавеолами ингибитор эндоцитоза), dynasore (ингибитор динамина), цитохалазин D (ингибитор фагоцитоза / макропиноцитоза), BFA (разрушитель аппарата Гольджи), монензин (лизосомальный ингибитор 1) или Ab (рецептор / переносчик-специфичный конкурент) инкубировали с клетками в течение 1 часа. CPZ, нистатин, диназор и цитохалазин D влияли на эндоцитоз НЧ (рис. 5a).

Нацеливающая составляющая является ключом к успеху нацеливания на рак, что исключительно важно в терапии рака. Для нацеливания очень важна эффективная модификация поверхности для повышения терапевтической эффективности и ограничения побочных эффектов. Fe ₃, меченный нанотелами О ₄ -Au НЧ ядро-оболочка были успешно получены из синтезированных НЧ и рекомбинантных нанотел. Таблица 1 ясно показывает, что каждый этап модификации был успешно выполнен.

Жизнеспособность клеток - один из важнейших элементов биологического применения наноматериалов. Жизнеспособность клеток была более 90% на голых НЧ ядро-оболочка и модифицированных НЧ (рис. 4а, б). Эти результаты означают, что чистый Fe ₃ О ₄ -Au НЧ и модифицированные НЧ не вызывают значительной цитотоксичности, зависящей от концентрации и модификации, и что модифицированные НЧ подходят для биологического применения.

Исследования эффективности интернализации и ингибирующего действия НЧ предоставляют важную информацию для понимания механизмов, посредством которых НЧ проникают в клетки. Пегилированные НЧ относительно медленно интернализовались в клетки по сравнению с голыми НЧ, но меченые нанотелами НЧ интернализовались в клетки немного быстрее, чем голые НЧ (рис. 3a, b). Поскольку ПЭГилирование является хорошо известным методом модификации поверхности для предотвращения интернализации НЧ, тенденция интернализации ПЭГилированных НЧ легко объяснима. Более того, нанотело индуцировало эндоцитоз НЧ. Чтобы проверить специфичность нанотела, мы подтвердили скорость интернализации наночастиц, меченных виментином Ab. Интересно, что НЧ, меченные виментином Ab, не способствовали интернализации клеток (рис. 3c).

Эти результаты показывают, что нанотело может эффективно индуцировать интернализацию наноматериалов в муциновые клетки CT26, и подразумевают, что тенденцию интернализации можно контролировать с помощью специфической модификации внешней мембраны НЧ. Кроме того, механизмы эндоцитоза наночастиц, меченных нанотелами, были четко показаны с помощью тестов на ингибирование и изображений конфокальной микроскопии. Фотофлуоресценция как нанотел, меченных НЧ, так и немеченых НЧ показала сходные уменьшающиеся значения при культивировании с CPZ, нистатином или диназором (рис. 5a, b). CPZ, нистатин и диназор играют роль в ингибировании, соответственно, клатрин-опосредованного эндоцитоза, опосредованного кавеолами эндоцитоза и динамина, который представляет собой большую GTPase, участвующую в отпочковании и отрыве формирующихся пузырьков от родительских мембран. Таким образом, значения фотофлуоресценции в обоих случаях быстро снижались, потому что динамин тесно связан с продуцированием везикул для клатрин-опосредованного и опосредованного кавеолами эндоцитоза. Как показано на рис. 5а, как немеченые (рис. 5а), так и меченые нанотелами НЧ (рис. 5b) наблюдается быстрое снижение фотофлуоресценции.

В частности, меченые нанотелами НЧ показали значительно более низкие значения фотофлуоресценции в CPZ, нистатине и диназоре. Более того, мы подтвердили, что непомеченные НЧ подвергались более сильному воздействию, чем меченные нанотелами НЧ, когда применялись к цитохалазину D, который является проницаемым для клеток токсином, который блокирует полимеризацию актиновых филаментов для фагоцитоза [43]. Эти результаты предполагают, что немеченые NP были интернализованы посредством множества механизмов, таких как клатрин-опосредованный эндоцитоз, опосредованный кавеолами эндоцитоз и фагоцитоз. Следовательно, клеточная интернализация НЧ, меченных нанотелами, зависит от клатрин-опосредованного и опосредованного кавеолами эндоцитоза. Кроме того, количество клеточного поглощения НЧ, меченных нанотелами, значительно снижалось, когда клетки культивировали с антителом Muc1 (рис. 5b). Этот результат указывает на то, что свободное антитело Muc1 играет роль конкурента нанотела на модифицированных NP при прикреплении к клеточной мембране CT26 и что антитело Muc1 играет важную роль в интернализации модифицированных NP клетками. В частности, НЧ, меченные виментином Ab, показали очевидные различия по сравнению с НЧ, меченными нанотелами, с точки зрения ингибирующей способности. На фотофлуоресценцию меченых виментином НЧ не повлияли многочисленные тесты на ингибирование, что указывает на минимальное влияние на НЧ нистатина, диназора, цитохалазина D и даже Muc1 Ab. Этот феномен может свидетельствовать об эффективности виментина, которая, как было подтверждено биохимически, сильно влияет на фагоцитоз [39]. Следовательно, этот результат указывает на то, что Muc1 Ab может нацеливаться на определенные молекулы и может контролировать специфический эндоцитоз.

Как показано на фиг. 6, аналогичные результаты были получены, когда клетки обрабатывали НЧ без оболочки с ядром и оболочкой, меченными Cy7.5, и НЧ, меченными ПЭГ-нанотелами, что указывает на аналогичное клеточное поглощение в обоих случаях в отсутствие ингибирования диназора. Ингибирование Dynasore индуцировало явно более низкую клеточную интернализацию НП, меченных ПЭГ-нанотелами, по сравнению с голыми НП (фиг. 6b, нижний ряд). Эти результаты подразумевают, что существует два механизма эндоцитоза, а именно неспецифический эндоцитоз голых НЧ и ограниченный эндоцитоз НЧ, меченных нанотелами, через молекулу динамина. Как только нанотело прикрепляется к внешней клеточной мембране, меченые нанотелами НЧ могут легко проходить через клеточную мембрану из-за одновременной активации механизмов, опосредованных клатрином и кавеолами. Следовательно, мы могли предположить, что основными механизмами являются как клатрин, так и кавеолы-опосредованный эндоцитоз для интернализации меченых нанотелами НЧ в муциновых клетках CT26.

Выводы

Наноматериалы для нацеливания на рак и контролируемое введение экзогенных материалов, таких как лекарства, гены и пептиды, являются критически важными достижениями в биомедицинских приложениях. Эти знакомые, но творческие концепции могут предложить стратегии для новых терапевтических методов. В этой статье мы продемонстрировали повышенное поглощение клетками Fe ₃. О ₄ -Au НЧ ядро-оболочка после ПЭГилирования антителом Muc1. Были продемонстрированы основные механизмы эндоцитоза наночастиц, меченных нанотелами, что показало возможность контролируемого специфического эндоцитоза в клетках колоректального рака. Эти результаты дают представление о нацеливании между НЧ, меченными нанотелами, и клетками колоректального рака, что помогает в разработке высокоэффективных нацеленных носителей.