Использование высокобиосовместимых наночастиц Au Nanocages @ PEG в качестве нового контрастного агента для визуализации компьютерной томографии in vivo

Аннотация

В последние годы контрастные вещества широко используются в технологиях визуализации для улучшения качества. Наночастицы обладают лучшей способностью к обнаружению in vivo, чем обычные контрастные вещества молекулярного масштаба. В этом исследовании новый тип наноклеток Au @ наночастиц PEG (AuNC @ PEGs) с высоким коэффициентом поглощения рентгеновских лучей был синтезирован в качестве контрастного вещества для изображений сканирования компьютерной томографии (КТ). Результаты показали, что AuNC @ PEG обладают хорошей водной дисперсией, низкой цитотоксичностью и сильной способностью к поглощению рентгеновских лучей. Кроме того, исследования in vivo показали, что синтезированные AuNC @ PEG имеют очевидное усиление контраста, длительное время циркуляции в крови и незначительную токсичность in vivo. Таким образом, синтезированные функционализированные AuNC @ PEG в этом исследовании имеют большой потенциал для клинического применения при компьютерной томографии.

Введение

В последние годы компьютерная томография (КТ) стала наиболее часто используемым методом диагностической визуализации в клинических условиях и находит широкое применение при исследовании различных тканей человека. Из-за сильной проникающей способности и высокой контрастности, а также относительно простой обработки изображений компьютерной томографии, он считается самым мощным методом неинвазивной визуализации в современной медицинской системе [1, 2]. Однако в процессе визуализации нет естественного контраста между поражением и некоторыми окружающими структурами. Таким образом, контрастный агент, который представляет собой вещество с относительно более высокой или более низкой плотностью, должен использоваться для различения целевой структуры или ткани и органов. Более того, это вещество обладает различной абсорбционной способностью в разных тканях, и его можно наблюдать с помощью рентгеновского излучения в мягких тканях. Было оценено использование некоторых молекул и нескольких контрастных веществ микрочастиц в томографе компьютерной томографии [3,4,5].

В настоящее время наиболее часто используемым контрастным веществом для компьютерной томографии является органическая молекула, содержащая йод. Йодированные молекулы, такие как йодид-ион или неионный препарат, широко используются в качестве контрастного вещества для компьютерной томографии в клинических условиях. Хотя йодированные молекулы могут обеспечить хорошее усиление контраста при КТ, они обладают высокой скоростью почечного клиренса, коротким временем циркуляции в организме и аллергенными свойствами, что значительно ограничивает их дальнейшее применение [6, 7]. Из-за быстрого удаления йодного проявителя эффективное временное окно визуализации пула крови серьезно ограничено, и трудно получить высококонтрастное изображение. Кроме того, быстрый клиренс больших доз лекарств может вызвать побочные эффекты со стороны почек [8, 9].

В последнее десятилетие применению наночастиц в биомедицине, особенно в диагностической визуализации, уделяется большое внимание [10]. По сравнению с контрастными веществами на основе йода наночастицы обладают такими контрастными характеристиками, которыми не обладают небольшие молекулы, а также имеют определенный размер, форму и поверхность [11, 12]. Как правило, наночастицы с большим атомным номером, такие как наночастицы золота, серебра и других металлов, имеют отличный коэффициент поглощения рентгеновских лучей; таким образом, они обладают замечательной способностью увеличивать контраст [13, 14]. Среди этих наночастиц наночастицы золота были быстро разработаны в области биомедицины и считаются заменителем визуализирующих агентов на основе йода из-за их значительной биологической инерции и простоты синтеза и модификации поверхности [15,16,17]. Наночастицы золота имеют более длительное время циркуляции крови, меньший риск нефротоксичности и более высокий коэффициент поглощения рентгеновских лучей, чем соединения йода. Следовательно, может быть назначена пониженная дозировка и низкий риск побочных эффектов [18]. Несколько наночастиц золота, в том числе наносферы, наностержни и нанозвезды, широко используются в качестве контрастного вещества для компьютерной томографии [19, 20], и это имеет многообещающий эффект. Среди различных золотых наноструктур наноклетки Au имеют полую внутреннюю часть и тонкую пористую стенку; таким образом, они имеют большую площадь поверхности и более эффективную способность к визуализации компьютерной томографии, чем другие наночастицы золота с другой морфологией [21, 22]. В последние годы наноклетки Au использовались в качестве усилителя контраста для оптической когерентной томографии и фотоакустической томографии, и было обнаружено, что они обладают хорошими характеристиками. Между тем, из-за большой площади поглощения наноклеток Au они также являются эффективными фототермическими преобразователями [23, 24]. Насколько нам известно, лишь в нескольких исследованиях оценивалось использование наноклеток Au в качестве контрастного вещества для компьютерной томографии. Основываясь на вышеупомянутых исследованиях, мы дополнительно изучили использование наноклеток Au в качестве контрастного агента при компьютерной томографии. Применение наночастиц в компьютерной томографии требует поверхностей, обладающих биосовместимостью и биологической активностью. Полиэтиленгликоль (ПЭГ) представляет собой биоразлагаемый и биосовместимый полимер, который также является скрытым материалом, используемым для предотвращения захвата РЭС и улучшения биосовместимости, способности очищать почки и времени циркуляции крови; таким образом, ПЭГилированные наночастицы могут удерживаться в крови в течение длительного периода [15, 25, 26, 27, 28].

В этом исследовании были получены и охарактеризованы новые AuNC @ PEG. Затем биосовместимость AuNC @ PEG in vitro оценивали с помощью колориметрии MTT, метода утечки лактатдегидрогеназы (LDH), анализа концентрации внутриклеточных активных форм кислорода (ROS), кальцеина-AM / PI и других экспериментальных методов. Кроме того, были выполнены гематологические и гистологические анализы для определения токсичности AuNC @ PEG in vivo. Результаты показали, что AuNC @ PEG обладают отличной биосовместимостью in vitro и in vivo. Более того, было обнаружено, что AuNC @ PEG обладают более сильной способностью к визуализации компьютерной томографии in vitro и in vivo. Эти экспериментальные результаты показали, что синтезированные AuNC @ PEG имеют очевидные преимущества, такие как сильный контраст, длительное время циркуляции крови и низкий риск нефротоксичности. Таким образом, синтезированные функционализированные AuNC @ PEG в этом исследовании имеют большой потенциал для клинического применения при компьютерной томографии.

Методы

Все протоколы экспериментов, включая любые соответствующие детали, были одобрены Региональным этическим комитетом Медицинского университета Цзиньчжоу в провинции Ляонин, Китай.

Материалы и инструменты

Наборы для тестирования LDH и ROS были приобретены в Нанкинском институте биоинженерии, Китай, а наборы для окрашивания кальцеином-AM / PI - у Shanghai Dongren Chemical Technology Co., Ltd., Китай. Другие химические реагенты и растворители были приобретены у Sigma-Aldrich. Все срезы оценивали с помощью флуоресцентного микроскопа (DMI4000B, Leica, Wetzlar, Германия). Характеристики синтезированных наночастиц оценивали с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ). Использовали 256-рядную спиральную компьютерную томографию с 512 срезами (Philips, Германия), и параметры визуализации были следующими:толщина среза 0,625 мм; напряжение на лампе 100 кВп; и ток трубки 100 мА.

Синтез AuNC @ PEG

Наноклетки Au были приготовлены с использованием простой реакции гальванического замещения между нанокубцами Ag и HAuCl ₄ решение, согласно предыдущему исследованию [29, 30]. Как правило, нанокубцы Ag с размером 25 нм были приготовлены в диэтиленгликоле и использовались в качестве темплатов для синтеза наноклеток Au с размером 30 нм. Затем к раствору AuNC (pH 8,0, 6,55 нМ, 6 мл) добавляли SH-PEG (MW ≈ 2000, 10 мг, растворенные в 5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS)) и перемешивали в течение ночи в темноте в атмосфере азота. защита. После трехкратной промывки AuNC @ PEG их диспергировали в водном растворе.

Оценка токсичности in vitro

В этом исследовании для определения токсичности синтезированных AuNC @ PEG in vitro использовали колориметрию MTT, метод утечки LDH, анализ внутриклеточной концентрации ROS и окрашивание кальцеином-AM / PI. Клетки HUVEC высевали в 96-луночные планшеты плотностью 1 × 10 ⁴ . /Что ж. Использовали среду RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, пенициллина (100 мкг / мл) и стрептомицина. Затем клетки культивировали при 37 ° C в инкубаторе с 5% углекислым газом в течение 12 ч. Затем добавляли среду с AuNC @ PEG в различных концентрациях (10, 20, 50, 100, 200, 500 и 1000 мкг / мл) для дальнейшего культивирования. Через 24 часа был проведен анализ МТТ. Культуральная среда без наночастиц использовалась в качестве контроля в каждой группе.

Затем для оценки токсичности in vitro определяли содержание лактатдегидрогеназы (ЛДГ), высвобожденной из клеток HUVEC, обработанных AuNC @ PEG в различных концентрациях. Клетки инокулировали аналогично МТТ, а затем обрабатывали AuNC @ PEG в различных концентрациях (10, 20, 50, 100, 200, 500 и 1000 мкг / мл) в течение 24 часов. Затем супернатант отделяли, центрифугировали и переносили в чистый 96-луночный планшет. Активность ЛДГ в культуральной среде оценивали в соответствии с инструкциями производителя, а оптическую плотность определяли с помощью прибора для маркировки ферментов (450 нм).

Основываясь на принципе измерения внутриклеточной концентрации АФК с использованием набора АФК, DCFH был окислен до дихлорфлуоресцеина (DCF), который является сильным зеленым флуоресцентным веществом DCF, в присутствии 2 ', 7'-дихлорфлуоресцеина (DCFH-DA). Клетки HUVEC культивировали в 24-луночных планшетах в течение 12 часов, обрабатывали AuNC @ PEG в различных концентрациях (50, 100, 200 и 500 мкг / мл) в течение 24 часов и инкубировали с DCFH-DA при 37 ° C в течение 40 мин. Клетки, обработанные перекисью водорода (H ₂ О ₂ ) были использованы в качестве положительного контроля. Интенсивность флуоресценции клеток наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа (λex, 485 нм; λem, 525 нм). Перед оценкой трижды использовали среду без сыворотки и льда для промывания.

Для окрашивания живых / мертвых клетки HUVEC инокулировали в 24-луночные планшеты и культивировали в течение 12 часов. Затем клетки обрабатывали AuNC @ PEG в различных концентрациях (10, 20, 50, 100, 200, 500 и 1000 мкг / мл) в течение 24 часов. После переваривания трипсин-ЭДТА посредством центрифугирования клетки промывали PBS (pH =7,4); затем приготовленную суспензию клеток смешивали с предварительно сконфигурированным реагентом кальцеин-AM / PI и культивировали при 37 ° C в течение 15 минут. Чтобы определить токсичность AuNC @ PEG, количество мертвых клеток оценивали с помощью флуоресцентной микроскопии.

Модель животного

Все процедуры экспериментов на животных были выполнены в соответствии с критериями, установленными Комитетом по защите и использованию животных Медицинского университета Цзиньчжоу. После эксперимента животные были умерщвлены в соответствии с гуманитарными принципами. В этом исследовании использовали взрослых крыс Sprague Dawley весом 250–300 г (приобретенных в Центре животных Медицинского университета Цзиньчжоу). В этом эксперименте все животные были случайным образом разделены на группы. Раствор хлоралгидрата (10 мас.%) Вводили через брюшную полость; затем все материалы вводились через хвостовую вену.

Компьютерная томография in vitro и in vivo

Для получения изображений компьютерной томографии in vitro, AuNC @ PEG в различных концентрациях и растворы йода помещали в пробирки EP и располагали в надлежащем порядке, а сканирование CT выполняли спереди назад. При компьютерной томографии in vivo после введения анестезии животных сканировали от головы до хвоста, используя центр брюшной полости в качестве ориентира. Положение животных не менялось каждый раз. Все исходные данные (изображение 0,625 мм) были переданы на рабочую станцию Philips для анализа с помощью компьютерной томографии.

Оценка токсичности in vivo

Гематологический анализ проводился с использованием стандартной методики забора крови из подкожной вены. Ткани сердца, печени, селезенки, легких и почек крыс фиксировали 4% параформальдегидом в течение 48 ч и заливали парафином после обезвоживания. Парафиновый срез имел толщину 5 мкм и помещался на предметное стекло. Затем было проведено окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) и проведен анализ под микроскопом.

Статистический анализ

Данные были проанализированы с использованием одностороннего дисперсионного анализа и P значение использовалось в качестве индекса. А P значение <0,05 считалось статистически значимым, что выражалось средним значением SD.

Результаты и обсуждение

Синтез и характеристика AuNC @ PEG

Функционализация поверхности и контроль размера - два ключевых фактора для разработки высокоэффективного наноконтрастного агента [ 15]. Строение и характер AuNC @ PEG определяли с помощью ПЭМ и DLS. На рис. 1а показаны результаты, согласно которым размер AuNC @ PEG составлял около 40 нм с высокой однородностью; Между тем, радиус гидратации AuNC @ PEG также использовался для тестирования дисперсии в растворе, как показано на рис. 1b, радиус гидратации AuNC @ PEG составлял около 50 нм, показывая, что AuNC @ PEG были очень стабильными без какой-либо агрегации. . AuNC @ PEG имеют меньший размер и относительно хорошую биологическую инерцию, что лучше для приложений наномедицины. Более того, структура полой клетки указывает на большие внутренние и внешние удельные площади поверхности и лучшую способность к визуализации компьютерной томографии, а окружающие металлические стенки обеспечивали дополнительную защиту для полезных нагрузок во время их обработки, транспортировки и хранения. С его очевидной структурой ядро-оболочка снаружи был покрыт полиэтиленгликолем биологического назначения, который может эффективно повысить биосовместимость и избежать захвата макрофагами.

Безопасность и стабильность AuNC @ PEG in vitro

Перед использованием AuNC @ PEG для визуализации in vivo мы оценили их безопасность и стабильность. Влияние AuNC @ PEG на жизнеспособность клеток HUVEC было обнаружено с помощью анализа МТТ (рис. 2а). Клетки обрабатывали AuNC @ PEG в различных концентрациях (10, 20, 50, 100, 200, 500 и 1000 мкг / мл) в течение 24 часов. Результаты МТТ-анализа показали, что выживаемость клеток AuNC @ PEG была аналогична таковой в контрольной группе, и у них была благоприятная биосовместимость, когда концентрация AuNC @ PEG достигала 200 мкг / мл. Выживаемость клеток при концентрации 1000 мкг / мл все еще составляла> 75%.

Кроме того, анализ ЛДГ также использовался для оценки биосовместимости AuNC @ PEG in vitro. В нормальных клетках ЛДГ не может проходить через клеточную мембрану. Когда клеточная мембрана повреждена, ЛДГ выделяется через клеточную мембрану [ 31]. Таким образом, мы оценили безопасность AuNC @ PEG, измеряя содержание ЛДГ в супернатанте клеток (рис. 2b), обрабатывая клетки AuNC @ PEG в различных концентрациях в течение 24 часов. Результаты показали, что уровень ЛДГ, высвобождаемый клетками, немного увеличивался по сравнению с контрольными клетками, не подвергавшимися воздействию, когда концентрация AuNC @ PEG была <200 мкг / мл, и была значительно ниже, чем в группе положительного контроля (H ₂ О ₂ ), что согласовывалось с результатами анализа МТТ, и было обнаружено, что 200 мкг / мл AuNC @ PEG в качестве оптимальной концентрации обладают хорошей цитосовместимостью.

Кроме того, были проведены тесты на окислительный стресс и оценка иммунофлуоресцентного окрашивания живых / мертвых клеток (кальцеин-AM / PI) для выявления токсичности AuNC @ PEG in vitro. Окислительный стресс является пагубным состоянием для всех жизненных систем, а избыточные активные формы кислорода (АФК) могут вызывать окислительный стресс [32, 33]. Поэтому мы измерили уровень АФК в клетках. Через 24 часа индукции AuNC @ PEG при различных концентрациях интенсивность зеленой флуоресценции клеток, индуцированная при концентрации 50–200 мкг / мл, существенно не отличалась от таковой в контрольной группе и была значительно ниже, чем у клеток контрольной группы. группа положительного контроля (рис. 2в). Интенсивность флуоресценции была пропорциональна уровню АФК. Как показано на рис. 3, выживаемость клеток HUVEC при концентрации 0–200 мкг / мл составляла> 90% (рис. 3a – f). Вышеупомянутые результаты подтверждают, что AuNC @ PEG в концентрации 200 мкг / мл стабильны, обладают хорошей совместимостью с клетками и могут быть многообещающими клиническими контрастными веществами.

Компьютерная томография in vitro и определение значения КТ

Чтобы оценить возможность применения AuNC @ PEG в компьютерной томографии, мы сравнили увеличение контрастности при различных молярных концентрациях (AuNC @ PEG) с клиническим использованием контрастного вещества (йода). Были получены изображения компьютерной томографии и измерены значения компьютерной томографии. AuNC @ PEG сравнивали с агентами для визуализации йода в аналогичных концентрациях (50, 100, 200, 500 и 1000 мкг / мл). Результаты показали, что значение CT увеличивалось с увеличением концентрации (рис. 4a), и согласно анализу значений CT AuNC @ PEG и йодного контрастного агента (рис. 4b) коэффициент поглощения AuNC @ PEG составлял лучше, чем у контрастных агентов на основе йода при аналогичных концентрациях, что указывает на то, что использование AuNC @ PEG для компьютерной томографии лучше.

КТ In Vivo

Из-за высокой контрастной способности AuNC @ PEG мы дополнительно сравнили качество изображения AuNC @ PEG с таковым йодных агентов in vivo. Двести микролитров AuNC @ PEG (200 мкг / мл) вводили через хвостовую вену крыс. Время ангиографии пула крови в AuNC @ PEG оценивали с помощью непрерывного сканирования временных точек до инъекции (0 мин) и после инъекции (10, 20, 30, 40, 60 и 90 минут). Затем крысам контрольной группы вводили йодную контрастную среду в соответствующей концентрации. Доза инъекции и время сканирования были аналогичны таковым для AuNC @ PEG. После инъекции контрастного вещества мы одновременно наблюдали усиление контрастности почки (рис. 5) и наполнение мочевого пузыря (SI рис. 1). Результаты показали, что почка в группе AuNC @ PEG достигла пика через 30 минут и полностью выводилась через 90 минут, а в группе контрастного вещества на основе йода достигла пика через 20 минут и полностью выводилась через 60 минут. Затем мы заметили, что мочевой пузырь постепенно наполнялся контрастным веществом. Это открытие показало, что время ангиографии пула крови AuNC @ PEG было лучше, чем у контрастного агента на основе йода. Более продолжительное время кровообращения AuNC @ PEG может обеспечить лучший диагноз, а AuNC @ PEG имеет большие перспективы развития.

Безопасность AuNC @ PEG in vivo

Как показано на рис. 6а, стандартные параметры рутинных анализов крови, печени и почек были отражены уровнем гемоглобина, средней концентрацией корпускулярного гемоглобина, средним корпускулярным объемом, количеством тромбоцитов, количеством эритроцитов, количеством лейкоцитов, концентрацией альбумина и т.д. уровень аланинаминотрансферазы, уровень аспартатаминотрансферазы и уровень креатинина. При статистическом анализе не наблюдалось значительной разницы между AuNC @ PEG, йодным контрастным агентом и контрольными группами ( P > 0,05). Кроме того, органы (сердце, печень, селезенка, легкие и почки) крыс были проанализированы гистологически, как показано на фиг. 6b, через 24 часа после инъекции AuNC @ PEG (200 мкг / мл); нарезанный; и окрашены (H&E). По сравнению с контрольной группой (без инъекций наноматериалов) не было обнаружено явных морфологических изменений и повреждений, как показано под микроскопом. Вышеупомянутые результаты дополнительно подтвердили безопасность и надежность AuNC @ PEG in vivo.

Заключение

Мы разработали AuNC @ PEG, новый тип контрастного вещества для компьютерной томографии, с такими характеристиками, как небольшой размер, высокая контрастность, длительное время удержания крови и низкий риск токсичности. Оценки токсичности in vitro и in vivo показали, что AuNC @ PEG обладают хорошей биосовместимостью и низким риском побочных эффектов. Характеристики визуализации компьютерной томографии in vitro и in vivo показали, что AuNC @ PEG имеют более высокий коэффициент поглощения рентгеновских лучей и более длительное время ангиографии пула крови, чем традиционные агенты визуализации на основе йода. Кроме того, AuNC @ PEG превосходят агенты визуализации на основе йода, и использование AuNC @ PEG является практичным. Все эти результаты показали, что AuNC @ PEG имеют более высокий коэффициент поглощения рентгеновских лучей, чем традиционные контрастные вещества на основе йода, и что эффективность визуализации AuNC @ PEG была выше, чем у традиционных контрастных агентов на основе йода. Таким образом, синтезированные функционализированные AuNC @ PEG в этом исследовании имеют большой потенциал для клинического применения при компьютерной томографии.

Доступность данных и материалов

Необработанные / обработанные данные, необходимые для воспроизведения этих результатов, не могут быть переданы в настоящее время, поскольку данные также являются частью текущих исследований и разработок.

Сокращения

CT:: Компьютерная томография
DCF:: Дихлорфлуоресцеин
DCFH:: Дихлорфлуоресцин
H ₂ О ₂ :: Перекись водорода
LDH:: Лактатдегидрогеназа
MTT:: 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолий бромид
PBS:: Физиологический раствор с фосфатным буфером
PEG:: Полиэтиленгликоль
ROS:: Активные формы кислорода
ТЕМ:: Просвечивающий электронный микроскоп

Совместное допирование олова и кислородных вакансий в гематитовый фотоанод для улучшения фотоэлектрохимиче… Исследование зависящих от размера проводящих свойств отдельных кремниевых нанопроволок

Наноматериалы