Функционализированные модифицированные фолатом нанокомплексы оксида графена / PEI siRNA для таргетной генной терапии рака яичников

Введение

Рак яичников является ведущей гинекологической причиной смерти в мире и обычно связан с плохими клиническими исходами из-за трудностей ранней диагностики и лечения [1,2,3]. К сожалению, обычные химиотерапевтические агенты обладают присущими им ограничениями, такими как неспецифическое распределение, плохая биодоступность, быстрое очищение крови и плохая растворимость в физиологической среде [4]. В течение последних нескольких десятилетий генная терапия изучалась как потенциальный подход к лечению различных генетических заболеваний, включая рак [5,6,7,8]. Однако отсутствие безопасного, высокоэффективного и селективного носителя для доставки генов препятствовало его продвижению до клинического применения. В настоящее время существует две категории генных векторов:вирусные и невирусные векторы. Хотя вирусные векторы показали высокую эффективность трансфекции, их клиническое применение ограничивают некоторые недостатки, например тяжелые иммунные воспалительные реакции и риск рекомбинации с вирусами дикого типа [9, 10]. Напротив, невирусные векторы обладают большой способностью к доставке, низкой иммуногенностью и структурной гибкостью, что делает их отличными альтернативами вирусным векторам [11,12,13]. С быстрым развитием нанотехнологий многие наночастицы были исследованы на предмет их потенциального использования в качестве носителей доставки генов [14, 15]. В этой работе был разработан новый невирусный вектор PEG-GO-PEI-FA, который может эффективно доставляться в опухолевые ткани.

Оксид графена (GO) является производным графита, который получают путем многостадийного окисления, ультразвуковой очистки и очистки графита [16]. Поверхность ОГ содержит эпоксидные, гидроксильные и карбоксильные группы [17]. Кислородные функциональные группы на его поверхности придают ГО превосходную биосовместимость, что позволяет ему образовывать стабильную суспензию в воде и органических растворителях, облегчая химические модификации и функционализацию [18, 19]. Итак, ГО широко используется для фототермической терапии рака, доставки лекарств и генов, а также биосенсоров [20,21,22]. Полиэтиленгликоль (ПЭГ) - безопасный, нетоксичный, биоразлагаемый материал; он был одобрен Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США в качестве гидрофильного носителя лекарств [23]. Функционализация ГО с помощью ПЭГ может улучшить стабильность в физиологических условиях, увеличить время цикла наноматериала ГО в организме и улучшить фармакокинетику наноматериала ГО для лучшего нацеливания на опухоль [24, 25]. Полиэтиленимин (PEI) стал золотым стандартом невирусных векторов из-за его высокой эффективности трансфекции в различных клеточных линиях [26]. Однако PEI проявляет серьезную цитотоксичность и плохую биосовместимость, что ограничивает его клиническое применение. В этом исследовании мы наблюдали значительное снижение цитотоксичности, когда PEI был трансплантирован на поверхность GO. Рецептор фолиевой кислоты чрезмерно экспрессируется на поверхности различных раковых клеток, особенно в раковых клетках яичников, как до, так и после химиотерапии [27]. Для нацеленной доставки генов молекулы фолиевой кислоты были ковалентно связаны с GO для нацеливания на рецепторы фолиевой кислоты.

В целом, основная цель настоящего исследования состояла в том, чтобы изучить новую систему доставки генов на основе GO для повышения эффективности генной терапии на основе siRNA при раке яичников. Полученный положительно заряженный PEG-GO-PEI-FA может быть загружен siRNA для доставки гена. Его успешный синтез, характеристика, эффективная интернализация клеток и противоопухолевый эффект in vitro были проанализированы с использованием различных методов. Кроме того, безопасность этой системы также оценивалась in vitro.

Материалы и методы

Материалы

Оксид графена был получен от Suzhou Carbon Fung Graphene Technology Co. Ltd. (Сучжоу, Китай). Фолиевая кислота (FA), N -гидроксисукцинимид (NHS) и флуоресцеинизотиоцианат (FITC) были приобретены у Sigma Aldrich Trading Co. Ltd. (Шанхай, Китай). Разветвленный PEI 25K, PEG (MW =2000), агароза и гидрохлорид 1- (3-диметиламинопропил) -3-этилкарбодиимида (EDC · HCL) были приобретены у Adama Reagent Co. Ltd. (Шанхай, Китай). Раствор с фосфатным буфером (PBS), фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS) и все другие химические вещества были приобретены у Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd. (Шанхай, Китай). Все остальные химические вещества были реактивными. Среда RPMI-1640 (Gibco), фетальная бычья сыворотка (FBS) (Gibco), трипсин (Gibco) и 20 × буфер TAE были приобретены у Thermo Fisher Scientific Co. Ltd. (Китай). Набор для подсчета клеток 8 (CCK-8) был приобретен у Shanghai Yisheng Biological Co. Ltd. (Шанхай, Китай). Реагенты для трансфекции LysoTrackerRed, 4% параформальдегид, 4'-6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) и липофектамин 2000 были приобретены у Invitrogen Co. Ltd. (Китай). Зонд флуоресценции Dil (номер по каталогу:C1036) был приобретен у Beyotime Co. Ltd. Короткая интерферирующая РНК (siRNA) против PLK1 (PLK1-homo-581) была синтезирована Shanghai GenePharma Co. Ltd. (Шанхай, Китай).

Подготовка PEG-GO-PEI-FA

Синтез PEG-GO-PEI-FA осуществляется в соответствии со стратегией, показанной на рисунке S2 (A). Во-первых, 10 мл водной суспензии GO (1000 мкг / мл) непрерывно обрабатывали ультразвуком при 50 Вт в течение 2 часов. Затем добавляли 1 мл EDC · HCL (5000 мкг / мл) и NHC (5000 мкг / мл) и периодически обрабатывали ультразвуком в течение 30 минут при 100 Вт с последующим добавлением PEG (10 мг), обрабатываемого ультразвуком в течение 30 минут и перемешивания на магнитной мешалке. мешалкой в ​​течение 6 ч при 0 ° С. Для удаления непрореагировавших реагентов и получения раствора ГО-ПЭГ смесь диализовали в течение 24 ч в дистиллированной воде с диализной мембраной (MWCO, 3500 Да). Затем раствор GO-PEG обрабатывали ультразвуком в течение 30 минут, добавляли 1 мл EDC · HCL (5000 мкг / мл) и NHC (5000 мкг / мл) и снова обрабатывали ультразвуком в течение 30 минут с последующим добавлением PEI 25K (5000 мкг / мл. ) 2 мл. Смесь обрабатывали ультразвуком в течение 30 минут и перемешивали в течение 6 часов при 0 ° C. Затем для получения PEG-GO-PEI смесь снова диализовали в течение 24 ч в дистиллированной воде с диализной мембраной (MWCO, 3500 Да). Раствор PEG-GO-PEI обрабатывали ультразвуком в течение 60 минут, добавляли 1 мл EDC · HCL (5000 мкг / мл) и NHC (5000 мкг / мл) и снова обрабатывали ультразвуком в течение 30 минут с последующим добавлением к раствору 10 мг FA. . Раствор обрабатывали ультразвуком в течение 30 минут, перемешивали в течение 12 часов при 0 ° C и диализовали в течение 48 часов с получением PEG-GO-PEI-FA в соответствии с вышеупомянутой процедурой. Раствор нанокомплексов сушили в вакуумной сублимационной сушилке (Biosafer-10D).

Характеристика

Поверхностный дзета-потенциал и средний размер частиц нанокомплексов в водном растворе измеряли с помощью динамического светорассеяния (DLS, Malvern Zetasizer Nano ZS, Великобритания). Морфологию нанокомплексов наблюдали с помощью атомно-силового микроскопа в атмосфере (AFM, MuLtimode Nanoscope IIIa, Германия). Спектры инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье (FTIR) были получены с помощью FTIR-спектрографа Thermo Nicolet 6700 с использованием таблеток KBr в диапазоне 400–4000 см ^-1 . Спектры поглощения нанокомплексов в УФ-видимой области измеряли на спектрофотометре УФ-видимой области (УФ, EV300, США). Рамановский спектр нанокомплексов измеряли с помощью дисперсионного рамановского микроскопа (Senterra R200-L, Германия) с длиной волны возбуждения 532 нм.

Анализ биобезопасности in vitro

SKOV3 (клетки рака яичников человека) был приобретен у Keygen (Китай). Клетки поддерживали в среде RPMI-1640 с добавлением 10% FBS, 100 Ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и культивировали при 37 ° C в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO ₂ . В этом исследовании цитотоксичность материалов анализировали на клетках SKOV3 с помощью анализа CCK-8. Вкратце, клетки высевали в 96-луночный планшет при плотности 6 × 10 ³ . клеток на лунку в 100 мкл среды 1640, содержащей 10% FBS, а затем инкубируют при 37 ° C в течение 12 часов в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO ₂ . Затем добавляли GO, GO-PEG, PEG-GO-PEI и PEG-GO-PEI-FA в конечных концентрациях от 10 до 1000 мкг / мл и инкубировали с клетками в течение дополнительных 12 часов. Другой, GO, GO-PEG, PEG-GO-PEI и PEG-GO-PEI-FA, инкубировали с разным временем от 4 до 24 ч при концентрациях 100 мкг / мл. Затем в каждую лунку добавляли 10 мкл CCK-8 и инкубировали еще 3 ч при 37 ° C. После этого на микропланшетном ридере измеряли оптическую плотность при 450 нм. Каждую группу экспериментов повторяли трижды. Относительная жизнеспособность клеток (%), относящаяся к контрольным клеткам, культивированным в среде, рассчитывалась как (поглощение образца - поглощение холостого опыта) / (поглощение контроля - поглощение холостого опыта) × 100%.

Анализ задержки геля агарозы

Буферный раствор 20 × TAE разбавляли водой, обработанной DEPC, чтобы получить 1% раствор агарозы. Затем раствор нагревали в микроволновой печи в течение 5 мин до полного растворения агарозы. Когда температура раствора агарозы упала до 55 ° C, добавляли раствор бромида этидия (EB, 0,5 мкг / мл) в объемном соотношении 10000:1 и равномерно перемешивали, затем раствор агарозы охлаждали с образованием геля агарозы. . В лунку добавляли смесь PEG-GO-PEI, PEG-GO-PEI-FA и миРНК в различных весовых соотношениях. Гель прогоняли при 110 В и 40 мА в течение примерно 60 минут, а затем наблюдали и анализировали с помощью ультрафиолетового формирователя изображения.

Исследования поглощения клеток PEG-GO-PEI-FA

Для исследования поглощения клетками нанокомплексы были помечены FITC в соответствии с ранее описанным методом с небольшой модификацией [28]. Вкратце, раствор нанокомплексов (приблизительно 1 мг / мл, 2,0 мл) смешивали с 0,2 мл FITC (26 мМ), растворенным в ДМСО, и затем перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Полученные смеси диализовали через мембрану 5000 MWCO для удаления немеченого FITC, а затем лиофилизировали. Клетки высевали в 6-луночный планшет (содержащий покровные стекла) с плотностью 2 × 10 ⁵ . клеток / лунку в 2 мл среды 1640, содержащей 10% FBS, а затем инкубировали при 37 ° C в течение 12 ч в инкубаторе для культур клеток. Затем среду в каждой лунке заменяли бессывороточной средой 1640. Впоследствии клетки обрабатывали различными нанокомплексами / FITC. Клетки, обработанные без нанокомплексов, являются контрольной группой, а клетки, обработанные PEI 25 K, являются параллельной контрольной группой. После инкубации в течение 4 ч при 37 ° C во влажной атмосфере, содержащей 5% CO ₂ , жидкость из культурального планшета удаляли, клетки дважды промывали холодным DPBS (pH =7,4), затем в каждую лунку добавляли 20 мкл DAPI и 5 мкл Dil (цитомембранный краситель) и инкубировали 20 мин при 37 ° C в атмосфере. темнота. Затем DAPI и Dil из культуральной среды удаляли и дважды промывали холодным DPBS (pH =7,4), а покровные стекла клеток извлекали и фиксировали на предметном стекле с помощью монтажной среды Permount TM. После этого сигнал флуоресценции слайдов клеток наблюдали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (CLSM) и анализировали поглощение клетками нанокомплексов.

Эндосомный выход и проникновение в ядро ​​

Для визуализации клеточного распределения, выхода из эндосом и проникновения нанокомплексов клетки SKOV3 высевали в 12-луночный планшет (содержащий покровные стекла) с плотностью 1 × 10 ⁵ клеток / лунку в 2 мл среды 1640, содержащей 10% FBS, а затем инкубировали в течение 12 ч (37 ° C, 5% CO ₂ ). Затем среду в каждой лунке заменяли бессывороточной средой 1640 объемом 1 мл / лунку. Впоследствии различные нанокомплексы (100 мкг / мл), меченные FITC, добавляли в 12-луночный планшет по 1 мл / лунку. Через 6 ч жидкость удаляли, клетки дважды промывали холодным DPBS (pH =7,4) и в 12-луночный планшет добавляли LysoTracker Red (5 мкг / мл) по 50 мкл / лунку. После инкубации в течение 15 минут при 37 ° C во влажной атмосфере, содержащей 5% CO ₂ жидкость из 12-луночного планшета удаляли, клетки дважды промывали холодным DPBS (pH =7,4), затем в каждую лунку добавляли 20 мкл DAPI и инкубировали в течение 20 мин при 4 ° C в темноте. Затем жидкость DAPI удаляли и дважды промывали холодным DPBS (PH =7,4). После фиксации 4% параформальдегидом в течение 15 минут при комнатной температуре покровные стекла вынимали и фиксировали на предметном стекле с помощью монтажной среды Permount TM. Сигнал флуоресценции слайдов наблюдали с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и анализировали выход из лизосом и проникновение в ядра нанокомплексов [29].

Анализ цитоингибирования

Мы проанализировали эффект ингибирования клеток PEG-GO-PEI / siRNA и PEG-GO-PEI-FA / siRNA, используя анализ CCK-8. Вскоре клетки высевали в 96-луночный планшет при плотности 6 × 10 ³ . клеток на лунку в 100 мкл среды 1640, содержащей 10% FBS, а затем инкубируют при 37 ° C в течение 12 часов в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO ₂ . Затем добавляли PEG-GO-PEI и PEG-GO-PEI-FA в конечных концентрациях от 10 до 500 мкг / мл и инкубировали с клетками в течение дополнительных 12 и 24 часов. Затем PEG-GO-PEI / siRNA и PEG-GO-PEI-FA / siRNA инкубировали с клетками от 4 до 48 ч в концентрации 100 мкг / мл. SiRNA трансфицировали липофектамином 2000 и не обрабатывали в качестве контрольной группы. Затем в каждую лунку добавляли 10 мкл CCK-8 и инкубировали еще 3 ч при 37 ° C. Поглощение измеряли при 450 нм. Каждую группу экспериментов повторяли трижды. Степень ингибирования (%) рассчитывалась как 1 - (поглощение образца - поглощение холостого опыта) / (поглощение контроля - поглощение холостого опыта) × 100%.

Статистика

Каждый экспериментальный тест повторялся трижды, и данные анализировались с помощью программного обеспечения SPSS 17.0. Односторонний тест ANOVA для анализа нескольких групп и непарного теста Стьюдента t для сравнения использовался тест для двухгруппового анализа. Данные были выражены в виде среднего значения и стандартного отклонения (SD), а статистическая значимость была установлена ​​на уровне p <0,05.

Результаты и обсуждение

Синтез PEG-GO-PEI-FA

Экспрессия FR была сначала проанализирована в различных линиях раковых клеток на основе базы данных Энциклопедии линий раковых клеток (CCLE; http://portals.broadinstitute. Org / ccle) [30] и различных тканях яичника на основе интерактивного профилирования экспрессии генов. База данных анализа (GEPIA2; http://gepia2.cancer-pku.cn) [31]. Результаты соответствовали предыдущим исследованиям (Рисунок S1). Поэтому мы выбрали FA в качестве нацеливающего лиганда для доставки гена.

Оксид графена, безусловно, несет множество кислородсодержащих групп, включая карбоксильные группы на краю, гидроксильные группы и эпоксидные группы на базисной плоскости, образованные в процессе окисления [32]. Чтобы получить наноразмерный GO (NGO), GO непрерывно подвергали крекингу с помощью обработки ультразвуком в ванне при 50 Вт в течение 2 часов с последующим ковалентным связыванием PEG / PEI / FA с GO с использованием химии EDC / NHS, как показано на рисунке S2 (A). На фигуре S2 (B) показан способ лечения PEG-GO-PEI-FA / siRNA. Анализ химического сопряжения проводился с помощью технологии дифференциальных спектров FTIR для получения спектральных пиков поглощения [33]. Как показано на рис. 1а, существование OH (3425 см ⁻¹ ), C =O (1719 см ⁻¹ ) и C =H (1350 см ⁻¹ ) функциональные группы были обнаружены в GO и указали на существование гидроксила и карбоксила на поверхности GO. CH (2885 см ^-1 ) полоса валентных колебаний может быть обнаружена, когда ПЭГ реагирует с ГО через стабильные ковалентные связи; это указывает на то, что ПЭГ был привит к ГО, и эффективность конъюгации ПЭГ составляла около 6%. После того, как PEI и FA прореагировали с GO, NH (1590 см ^-1 ), C – N (1420 см ⁻¹ ) наблюдалась полоса валентных колебаний, что указывает на то, что PEI и FA были привиты к GO путем этерификации. Эти результаты продемонстрировали, что конъюгация PEG-GO-PEI-FA была успешно синтезирована.

Успешный синтетический анализ PEG-GO-PEI-FA с использованием инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье (FTIR) и спектрофотометра UV-Vis. а Спектры FTIR GO, GO-PEG, PEG-GO-PEI и PEG-GO-PEI-FA. б Спектры поглощения в УФ и видимой областях GO, FA, GO-PEG, PEG-GO-PEI и PEG-GO-PEI-FA

На рисунке 1b показаны спектры поглощения в УФ и видимой областях GO, FA, GO-PEG, PEG-GO-PEI и PEG-GO-PEI-FA. GO имел пик поглощения 223 нм. ФА имела пик поглощения 275 нм. GO-PEG показал плавную кривую, что указывает на то, что PEG конъюгировал с GO и сделал гору GO более гладкой. ПЭГ-ГО-ПЭИ имел пик поглощения при 219 нм, демонстрируя, что ПЭИ был привит к поверхности ГО-ПЭГ. PEG-GO-PEI-FA имел пик поглощения при 219 нм и 275 нм, показывая, что FA была привита к PEG-GO-PEI. Все эти результаты дополнительно продемонстрировали успешный синтез PEG-GO-PEI-FA.

Характеристика PEG-GO-PEI-FA

Данные, приведенные в таблице 1, показывают размер частиц и дзета-потенциал нанокомплексов. Размер частиц нанокомплексов постепенно увеличивался до 218,4 нм, в то время как PEG, PEI и FA постепенно прививались к поверхности GO. Дзета-потенциал изменился с -16,5 до + 17,5 мВ, когда PEI подключился к GO, что облегчило способность адсорбировать отрицательно заряженную ДНК или РНК посредством электростатического взаимодействия и клеточного поглощения. Дзета-потенциалы PEG-GO-PEI-FA и PEG-GO-PEI-FA / siRNA составляли + 14,7 мВ и + 14,5 мВ, соответственно. Дзета-потенциалы показали, что PEG-GO-PEI-FA или PEG-GO-PEI-FA / siRNA были меньше, чем PEG-GO-PEI из-за отрицательного заряда FA и siRNA. Они показали, что PEG-GO-PEI-FA / siRNA могут адсорбироваться на поверхности клеток за счет взаимодействия заряда и использоваться рецептор-опосредованным эндоцитозом на цитомембране [34].

Морфология поверхности и размер частиц наноносителя также измерялись методами AFM и DLS. Как показано на рис. 2а, ОГ показал гладкую поверхность и листовую структуру с размером частиц 192,1 нм. После прививки ПЭГ, ПЭИ и ЖК на поверхность ГО размер частиц ПЭГ-ГО-ПЭИ-ЖК увеличился до 216,1 нм, и на поверхности ПЭГ-ГО-ПЭИ-ЖК наблюдалось множество выпуклостей (рис. 2б). ), что свидетельствует о иммобилизации большого количества декораций на листах GO. В то же время высота PEG-GO-PEI-FA была больше, чем у GO, что в основном связано с прикреплением PEG, PEI и FA в обеих плоскостях листа GO.

Характеристика наноразмерной системы доставки. Для характеристики морфологии и распределения по размерам использовались атомно-силовая микроскопия (АСМ) и динамическое рассеяние света (DLS): a GO и b ПЭГ-ГО-ПЭИ-ФА. Рамановские спектры для анализа поверхности сформированного оксида графена GO, GO-PEG и PEG-GO-PEI c

Рамановская спектроскопия - одна из наиболее часто используемых для измерения характеристик и структурных свойств наноуглеродных материалов [35]. Как показано на рис. 2c, в спектре комбинационного рассеяния GO имеется полоса колебаний при 1600 см ^-1 . (Полоса G) и 1354 см ⁻¹ (Полоса D), а отношение площадей ID / IG было 1,0385, что указывает на то, что часть SP ² гибридизация ГО была нарушена с образованием гидроксила и карбоксила. GO-PEG и PEG-GO-PEI показали полосу колебаний при 1595 см ^-1 . (Полоса G) и 1352 см ⁻¹ (Полоса D), а отношение площадей ID / IG составляло 0,7737 и 0,5238. Отношение площадей ID / IG постепенно снижалось после реакции PEG и PEI с GO; это указывает на то, что ПЭГ и ПЭИ были привиты к поверхности ГО.

Анализ биобезопасности различных функциональных НПО in vitro

Проблема биобезопасности невирусных генных векторов остается серьезной проблемой для клинического применения. Высокие положительные заряды не только привели к отличной способности конденсировать и защищать гены, но также привели к серьезной цитотоксичности [36, 37]. Для проверки цитотоксичности свободных нанокомплексов siRNA был проведен анализ CCK-8 с клетками SKOV3, которые инкубировали в течение 4, 8, 12 и 24 ч со свободными нанокомплексами в различных концентрациях (от 10 до 1000 мкг / мл). Как показано на рисунке S3, нанокомплексы по-прежнему обладали высокой жизнеспособностью клеток при раке яичников при 1000 мкг / мл в течение 24 часов. Цитотоксичность всех нанокомплексов зависела от времени и концентрации (жизнеспособность клеток SKOV3:больше или равна 84,38% для всех нанокомплексов в 1000 мкг / мл и больше или равна 94,21% для всех нанокомплексов через 24 часа. с ячейками SKOV3). Эти результаты свидетельствуют о том, что нанокомплексы проявляют незначительную цитотоксичность и могут служить в качестве биосовместимого генного вектора.

Анализ нанокомплексов в сочетании с миРНК

Поглощение клетками свободных молекул РНК обычно затруднено из-за значительных отрицательных зарядов, которые они несут [38]. Загрузка отрицательно заряженных биомолекул катионными полимерами широко используется для решения этой проблемы [39]. В этой статье загрузка миРНК в вектор PEG-GO-PEI-FA была достигнута путем смешивания миРНК и PEG-GO-PEI-FA в водном растворе. Как показано в таблице 1, дзета-потенциал PEG-GO-PEI-FA составлял + 14,7 мВ, что указывает на то, что миРНК может адсорбироваться на поверхности PEG-GO-PEI-FA за счет электростатического взаимодействия. В данном исследовании способность нанокомплексов к конденсации генов оценивалась с помощью электрофореза в агарозном геле [40]. На фиг. 3а показано, что PEG-GO-PEI обладает очевидной способностью к конденсации по отношению к миРНК при весовом соотношении 10, тогда как полное замедление миграции миРНК PEG-GO-PEI-FA наблюдается, когда весовое соотношение достигает 20 (фиг. 3b). Итак, PEG-GO-PEI-FA может защищать siRNA от деградации, но в то же время требуется немного больше нанокомплекса, чтобы продемонстрировать хорошую связывающую способность. Это может быть связано с дзета-потенциалами PEG-GO-PEI-FA, которые были не такими высокими. Эти результаты показали, что PEG-GO-PEI и PEG-GO-PEI-FA обладают достаточной способностью к доставке, особенно PEG-GO-PEI-FA, который дополнительно продемонстрировал свой потенциал в качестве действительного вектора для эффективной и безопасной доставки генов. / P>

Способность к загрузке миРНК при различных весовых соотношениях. Анализ замедления задержки в агарозном геле проводили для оценки взаимодействия между миРНК и наноносителем. а PEG-GO-PEI и b ПЭГ-ГО-ПЭИ-ФА в различных весовых соотношениях (материалы / миРНК)

Анализ сотовой связи

Это так важно, если носители могут специфически нацеливаться на опухоли для доставки генов. Чтобы подтвердить, может ли носитель PEG-GO-PEI-FA легко проникать в клетки, мы использовали FITC в качестве флуоресцентного зонда для внутриклеточной визуализации. При этом ядра окрашивали DAPI, а цитомембрану - Dil. Как показано на фиг. 4, контрольная группа и группа PEG-GO-PEI не показали зеленых флуоресцентных сигналов вокруг ядер и цитомембраны. Это означало, что PEG-GO-PEI не проникал в клетки. PEI 25K и PEG-GO-PEI-FA / siRNA проявлялись в виде зеленого флуоресцентного сигнала вокруг ядра, что ясно продемонстрировало, что PEG-GO-PEI-FA может проникать через клеточные мембраны и проникать в клетки. Нанокомплексы PEG-GO-PEI-FA показали наиболее активное клеточное поглощение, возможно, из-за того, что FA может специфически связывать FR, который сверхэкспрессируется на поверхности клеток SKOV3. Эти результаты свидетельствуют о том, что ЖК играет важную роль в обеспечении эффективного клеточного поглощения нанокомплексов PEG-GO-PEI-FA и PEG-GO-PEI-FA / siRNA. Что еще более важно, способность FA связывать свой рецептор не зависела от ковалентной амидной связи, и рецептор-опосредованный эндоцитоз был беспрепятственным.

Поглощение клетками различных нанокомплексов. Изображения, полученные с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM), поглощения клетками различных нанокомплексов, меченных FITC, в клетках SKOV3 рака яичников человека после инкубации в течение 4 часов. Синий - ядра (помеченные DAPI); красный - цитомембрана (меченная Dil); зеленый, нанокомплексы (маркированные FITC). Масштабные полосы представляют 100 мкм, но масштабные линейки составляют 10 мкм в отдельной ячейке

Анализ побега лизосом

Что касается системы доставки миРНК, они должны ускользать из эндосомы или образованной лизосомы. Однако в противном случае siRNA будет деградировать или вытекать из клетки [41,42,43]. Мы оцениваем эндосомальную способность ускользать по внутриклеточной локализации нанокомплексов с помощью CLSM. Поскольку многие отчеты продемонстрировали, что PEI 25K может способствовать эндосомальному или лизосомному ускользанию за счет «эффекта протонной губки» [44], PEI 25K использовался в качестве контроля. В этом исследовании нанокомплексы были помечены FITC. Во-первых, мы оценили, что нанокомплексы входят в лизосому по желтому сигналу, который перекрывается зеленым флуоресцентным сигналом FITC с красным флуоресцентным сигналом Lyto Tracker Red. PEI 25K проявлялся как желтый сигнал после инкубации в течение 4 часов с клетками, а другие материалы проявлялись как желтый сигнал после инкубации в течение 2 часов с клетками, что означает, что материалы попали в клетки (рис. 5). Независимо от того, удаляются ли нанокомплексы из лизосом с помощью яркого голубого сигнала, зеленый флуоресцентный сигнал FITC комбинируется с синим флуоресцентным сигналом DAPI. Как показано на фиг. 5а, зеленый сигнал наблюдался при накоплении в ядрах, и был яркий голубой сигнал после инкубации PEI / siRNA в течение 8 часов с клетками, что указывает на то, что PEI / siRNA ускользнул из лизосомы. Однако PEG-GO-PEI-FA и PEG-GO-PEI-FA / siRNA имели некоторый слабый зеленый сигнал для проникновения в ядра уже через 2 часа, и более зеленый сигнал накапливался в ядрах вместе с увеличением времени инкубации. И был яркий голубой сигнал, когда PEG-GO-PEI-FA и PEG-GO-PEI-FA / siRNA инкубировали в течение 4 часов с клетками (рис. 5b, c). Это указывало на то, что материалы так рано вышли из лизосомы. Одним словом, эти результаты показали, что PEG-GO-PEI-FA и PEG-GO-PEI-FA / siRNA по-прежнему обладают превосходной эндосомальной или лизосомальной способностью ускользать и могут эффективно способствовать ускользанию через лизосомы и трансфекции генов in vitro.

Клеточная интернализация и лизосомный выход PEG-GO-PEI-FA, наблюдаемые с помощью CLSM. Клетки рака яичников SKOV3, инкубированные с a PEI, b PEG-GO-PEI-FA и c ПЭГ-ГО-ПЭИ-ФА в течение 0,5, 1, 2, 4 и 8 часов. Синим цветом обозначены ядра, окрашенные DAPI, зеленым - нанокомплексы, меченные FITC, а красным - флуоресценция эндосом и лизосом после окрашивания LysoTracker красным. Масштабные полосы представляют 100 мкм, но масштабные линейки составляют 10 мкм в отдельной ячейке

Оценка ингибирования клеток PEG-GO-PEI-FA / siRNA

В данном случае терапевтический эффект PEG-GO-PEI-FA / siRNA исследовали с помощью анализа CCK-8 на клетках SKOV3 in vitro. Как показано на рис. 6а, мы не обнаружили значительного влияния на выживаемость опухолевых клеток при различных концентрациях (10–100 мкг / мл) и разных временных точках (12 и 24 ч) в PEG-GO-PEI- Группа FA. Несмотря на то, что концентрация превышала 100 мкг / мл, выживаемость опухолевых клеток все еще составляла более 80%. Итак, мы выбрали 100 мкг / мл для следующего исследования клеточного ингибирования. Более слабая цитотоксичность проявлялась в группе PEG-GO-PEI / siRNA и Lipo2000 / siRNA (степень ингибирования менее 20%). По сравнению с PEG-GO-PEI / siRNA и Lipo2000 / siRNA, PEG-GO-PEI-FA / siRNA оказывали значительный ингибирующий эффект на рост опухолевых клеток SKOV3. PEG-GO-PEI-FA / siRNA ингибировали клетки SKOV3 в зависимости от времени (фиг. 6b). Эти результаты показали, что PEG-GO-PEI-FA / siRNA обладают лучшим ингибирующим эффектом для увеличения опухолевых клеток, и мы можем использовать PEG-GO-PEI-FA в качестве идеального наноносителя для доставки генов.

In vitro cytotoxicity of PEG-GO-PEI-FA/siRNA in ovarian cancer SKOV3 cells via CCK-8 assay. а SKOV3 cells were treated with PEG-GO-PEI and PEG-GO-PEI-FA at different concentrations (10–500 μg/mL) at 12 and 24 h to get the optimal dose of nanocarrier. б The cytotoxicity of PEG-GO-PEI-FA/siRNA, PEG-GO-PEI/siRNA, and Lipo2000/siRNA were measured in different time points (4–48 h) at 100 μg/mL. Error bars represent ± SD; * p <0.05 (Student’s t test)

Conclusions

In this study, we successfully synthesized a novel gene delivery system, PEG-GO-PEI-FA. The not cytotoxic by itself and excellent biological compatibility of PEG-GO-PEI-FA guaranteed its prospects as a safe and effective gene delivery vector. PEG-GO-PEI-FA/siRNA nanocomplexes exhibited outstanding physicochemical properties for gene targeting delivery. Moreover, PEG-GO-PEI-FA/siRNA could readily enter SKOV3 ovarian cancer cells and escape from the lysosomes. Cytotoxicity assay demonstrated that PEG-GO-PEI-FA/siRNA had a good inhibition effect on ovarian cancer cells in a time-dependent manner, and it exhibited a higher cytotoxicity effect compared to other groups. On the basis of aforementioned results, PEG-GO-PEI-FA may provide good anticipation as a gene vector for targeted gene delivery and more effective strategy in ovarian carcinoma treatments.

Доступность данных и материалов

Все данные, полученные или проанализированные в ходе этого исследования, включены в эту опубликованную статью и файлы с дополнительной информацией к ней.

Сокращения

AFM:

Атомно-силовой микроскоп

CCK-8:

Cell counting kit8

CCLE:

Cancer cell line encyclopedia

CLSM:

Confocal laser scanning microscope

DAPI:

4′-6-Diamidino-2-phenylindole

DLS:

Динамическое рассеяние света

DMSO:

Диметилсульфоксид

DPBS:

Dulbecco’s phosphate-buffered saline

EB:

Ethidium bromide

EDC∙HCL:

1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethyl carbodiimide hydrochloride

FA:

Folic acid

FBS:

Фетальная бычья сыворотка

FITC:

Fluorescein isothiocyanate

FITR:

Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье

FR:

Folate receptor

GEPIA:

Gene expression profiling interactive analysis

GO:

Оксид графена

MWCO:

Molecular weight cutoff

NGO:

Nanoscale graphene oxide

NHS:

N -hydroxysuccinimide

НП:

Наночастицы

PBS:

Phosphate-buffered solution

PDI:

Индекс полидисперсности

PEG:

Полиэтиленгликоль

PEI:

Polyethyleneimine

siRNA:

Small interfering RNA